一种柱状黄杆菌分离培养基的制作方法

[0001]
本发明涉及一种分离培养基，特别是涉及一种柱状黄杆菌分离培养基。


背景技术：

[0002]
草鱼是我国淡水养殖的主要品种，占淡水养殖产量25％以上，2018年我国草鱼的养殖产量约534万吨，每年由病害造成损失近21亿元。柱状黄杆菌属革兰氏阴性菌，感染包括草鱼、清鱼、鲫鱼、鳜鱼、鮰鱼、鲈鱼等海淡水鱼类近20多科。由柱状黄干菌引起草鱼烂鳃病近些年全国范围内均有爆发，是草鱼养殖中最严重的“老三病”之一。随着国家对水产抗生素使用监管趋于严格，具有预防性、安全性特征的水产细菌疫苗近年愈发受到国家和科研单位重视。
[0003]
草鱼柱状黄杆菌分离和流行病学调查作为其疫苗研发的关键因素之一，利用传统的柱状黄杆菌分离方法，具有特异性差，分离率低的缺点，通过实际应用，完成了全国11个省份草鱼柱状黄杆菌的流行病学调查，在46个有典型症状病灶部位分离出45株柱状黄杆菌。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供了一种柱状黄杆菌分离培养基，以提高柱状黄杆菌的分离效果。
[0005]
本发明提供了一种柱状黄杆菌分离培养基，包括下列成份：无机盐0.5-1g/l、除菌剂100-500μg/ml、蛋白胨4-5g/l、0.1-1％的血清、凝胶粉15-18g/l，所述无机盐由乙酸钠、二水氯化钡、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、七水硫酸亚铁、碳酸氢钠中的一种或多种组成，所述除菌剂由多粘菌素、妥布霉素、达托霉素、万古霉素中的一种或多种组成。
[0006]
进一步地，所述无机盐由乙酸钠、二水氯化钡、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、七水硫酸亚铁、碳酸氢钠组成。
[0007]
更进一步地，所述无机盐包括：乙酸钠0.02g/l，二水氯化钡0.01g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，七水硫酸镁0.6g/l，二水氯化钙0.0067g/l，七水硫酸亚铁0.002g/l，碳酸氢钠0.05g/l。
[0008]
进一步地，所述柱状黄杆菌分离培养基还包括酵母提取物0.4-0.5g/l。
[0009]
进一步地，所述血清含量为0.1％-0.6％。
[0010]
更进一步地，所述血清含量为0.6％。
[0011]
进一步地，所述除菌剂由多粘菌素、妥布霉素、达托霉素、万古霉素组成。
[0012]
更进一步地，所述除菌剂包括多粘菌素140-200u/ml、妥布霉素2-5μg/ml、达托霉素100-200μg/ml、万古霉素2-10μg/ml。
[0013]
进一步地，所述凝胶粉为琼脂粉。
[0014]
进一步地，所述蛋白胨为胰蛋白胨。
[0015]
本发明相对于现有技术，通过无机盐配合除菌剂，可以迅速从柱状黄杆菌烂鳃病
病鱼鳃和体表分离得到柱状黄杆菌，形成单菌落，杂菌数量少，相比传统的分离方法，解决杂菌数量较多的问题，大大提高了其分离效率，突破了柱状黄杆菌难以分离瓶颈，，通过实际应用，完成了全国11个省份草鱼柱状黄杆菌的流行病学调查，在46个有典型症状病灶部位分离出45株柱状黄杆菌。
附图说明
[0016]
图1为本发明实施例1分离平板菌落培育图；
[0017]
图2为本发明实施例2分离平板菌落培育图；
[0018]
图3为本发明对照例分离平板菌落培育图。
具体实施方式
[0019]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
[0020]
实施例1
[0021]
乙酸钠0.02g/l，二水氯化钡0.01g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，七水硫酸镁0.6g/l，二水氯化钙0.0067g/l，七水硫酸亚铁0.002g/l，碳酸氢钠0.05g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母提取物0.5g/l，血清0.6％，多粘菌素200u/ml，妥布霉素5μg/ml，达托霉素150μg/ml，万古霉素10μg/ml，琼脂粉15g/l。
[0022]
实施例2
[0023]
乙酸钠0.02g/l，二水氯化钡0.01g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，七水硫酸镁0.6g/l，二水氯化钙0.0067g/l，七水硫酸亚铁0.002g/l，碳酸氢钠0.05g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母提取物0.5g/l，血清0.1％，多粘菌素200u/ml，达托霉素200μg/ml，琼脂粉(固体培养基)15g/l。
[0024]
实施例3
[0025]
乙酸钠0.01g/l，二水氯化钡0.01g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，七水硫酸镁0.6g/l，二水氯化钙0.0067g/l，七水硫酸亚铁0.002g/l，碳酸氢钠0.05g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母提取物0.5g/l，血清0.6％，多粘菌素200u/ml，妥布霉素5μg/ml，达托霉素150μg/ml，万古霉素10μg/ml，琼脂粉15g/l。
[0026]
实施例4
[0027]
乙酸钠0.02g/l，二水氯化钡0.01g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，七水硫酸镁0.6g/l，二水氯化钙0.0067g/l，七水硫酸亚铁0.002g/l，碳酸氢钠0.05g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母提取物0.5g/l，血清0.1％，多粘菌素200u/ml，妥布霉素5μg/ml，达托霉素150μg/ml，万古霉素10μg/ml，琼脂粉15g/l。
[0028]
对照例
[0029]
本发明对照例的培养基包括柱状黄杆菌常规培养基、柱状黄杆菌选择性固体培养基、柱状黄杆菌选择性液体培养基。
[0030]
柱状黄杆菌常规培养基为常规shieh固体培养基，制备方法如下：取蛋白胨5g、酵母提取物0.5g、noble琼脂10g、k2hpo
4 0.1g、kh2po
4 0.05g、乙酸钠0.01g、nahco
3 0.05g、
mgso4·
7h2o0.3g、bacl2·
h2o 0.01g、feso4·
7h2o 0.001g、cacl2·
2h2o 0.0067g加入到1000ml蒸馏水中，调ph至7.2，灭菌而得。
[0031]
柱状黄杆菌选择性固体培养基：在上述柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2μg/ml、多粘菌素b使其终浓度为20u/ml，倒平板而得；
[0032]
柱状黄杆菌选择性液体培养基：在上述柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂，灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2μg/ml、多粘菌素b使其终浓度为20u/ml而得。
[0033]
本发明对照例培养基的使用方法如下：
[0034]
1、取上述制备的柱状黄杆菌常规固体培养基、选择性固体培养基和选择性液体培养基，备用；
[0035]
2、挑取病鱼鳃部病灶，划线接种到柱状黄杆菌常规固体培养基上，28℃培养48小时，培养基上可以观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落。
[0036]
3、挑选上述培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基上，在28℃培养48小时。
[0037]
4、挑选上述培养得到的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，在28℃培养24小时；
[0038]
5、将黄色菌液按照10倍系列稀释(稀释后稀释度为10-5～10-8)，均匀涂布到状黄杆菌选择性固体培养基上，在28℃培养48小时；
[0039]
6、挑选10-8稀释平板上的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，在28℃培养24小时，得到较纯培养物；
[0040]
7、菌株确证：
[0041]
用步骤6)得到的纯化菌液做革兰氏染色，细菌呈红色，形态单一。
[0042]
为对比本发明实施例1-4及对照例的分离效果，进行测试，方法如下：
[0043]
1、取上述实施例1-4柱状黄杆菌分离培养基及对照例的柱状黄杆菌常规固体培养基，备用；
[0044]
2、挑取病鱼鳃部病灶，分别划线接种到实施例1-4柱状黄杆菌分离培养基及对照例的柱状黄杆菌常规固体培养基上，28℃培养48小时，观察培养基上的菌落生长情况，图1为本发明实施例1的菌落生长情况，图2为本发明实施例2的菌落生长情况，图3为本发明对照例的菌落生长情况。
[0045]
如图1-3所示，本发明实施例1-4可以迅速从柱状黄杆菌烂鳃病病鱼鳃和体表分离得到柱状黄杆菌，形成单菌落，且杂菌数量少，而对照例杂菌数量较多，生长较快，即使多次纯化也难以将其分离。
[0046]
同时，本发明实施例1-4操作简单，平板无需担心会被空气中的杂菌污染。
[0047]
此外，如图1-3所示，本发明实施例1相比实施例2，通过采用多粘菌素、妥布霉素、达托霉素、万古霉素组合，有效提高对杂菌的抑制；相比实施例3，通过采用0.02g/l乙酸钠、0.002g/l硫酸亚铁、0.6g/l硫酸镁，提高了柱状黄杆菌的生长率；本发明实施例1相比实施例4，在常规条件下培育12小时后，实施例1的od值可达0.680，而实施例4的od值仅为0.455，本发明实施例1通过采用0.6％的血清，有效提高柱状黄杆菌的生长速度。
[0048]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术
人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。