一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法与流程

[0001]
本发明涉及微生物发酵种子制备技术领域，具体为一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法。


背景技术：

[0002]
在工业规模化发酵生产中种子质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用，选择合理的种子培养时间能够为发酵罐提供代谢旺盛、数量足够的种子，使发酵生产周期缩短，设备利用率提高，放线菌的发酵是一个非常复杂的过程，受到很多环境条件的影响，在多种影响因子下种子的培养时间十分关键。研究表明放线菌的生长周期共分为四个阶段，迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期。在这四个阶段中，对数期的群体细胞具有生理特性比较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是作为菌种的最佳材料。因此，确定种子的对数生长期为发酵罐提供优良的菌种尤为重要，由于放线菌是丝状细菌，好氧，在摇床液体培养过程容易形成细菌球，而成不均匀分布，因此用来测单细胞细菌od值的分光光度计不能准确测量放线菌的od值。
[0003]
直接测细胞干重法，需要将种子液过滤或者离心处理，将离心或过滤后的菌体用无菌清水洗涤，洗涤后的菌体于烘箱进行烘干处理。此方法不仅需要足够量的种子培养液，而且步骤繁琐在处理过程中容易形成人为因素误差。另外在实际生产中种子培养基的成分复杂含有多种不溶性物质，不易用无菌水清洗，实验室摇瓶种子培养条件与发酵罐的条件有一定的差异，实验室的种子状态不能完全反映发酵罐中种子的生长情况。此外，目前的工业生产用放线菌菌种的移种时间往往是根据生产经验观测其生长状态来确定的，具有一定的波动性，为此，我们提出了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法来解决上述问题。


技术实现要素：

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针对现有技术的不足，本发明提供了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
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为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，包括以下步骤：
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s1、保藏菌种：制备一批该放线菌种子液体培养基和发酵培养基并分装，种子培养基分装至种子摇瓶，设置三个平行实验，发酵培养基分装至发酵摇瓶；
[0007]
s2、种子培养基：取保藏的菌种接种于步骤s1中的种子液体培养基，以不接菌种的培养基为空白对照，在相同的条件下进行培养并与种子罐培养同步；
[0008]
s3、od值、透射比、ph值和菌浓测量：从培养12h开始对该放线菌种子培养液进行od值、透射比、ph值和菌浓测量，过滤后弃去滤液留取滤渣于烘箱105℃烘干称取干重；
[0009]
s4、发酵培养和效价检测：将培养21h至25h的种子接入步骤s1中的发酵摇瓶培养基，每个时间段的发酵摇瓶培养一定时间后进行效价检测；
[0010]
s5、对数生长期：对实验数据进行统计分析得出最佳移种时间段。
[0011]
进一步优化本技术方案，述步骤s1中的种子培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖1.0％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％以及轻质碳酸钙0.1％。
[0012]
进一步优化本技术方案，所述步骤s1中的种子培养基的原料组分用水定容至所需用量，所述种子罐的装料量为10l。
[0013]
进一步优化本技术方案，所述步骤s1中的发酵培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖6.0％、蛋白胨1.0％、玉米粉1.0％、黄豆饼粉3.0％、0.1％、轻质碳酸钙0.5％、硫酸镁0.4％、氯化铵0.5％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.003％、氯化锰0.03％以及泡敌0.1％。
[0014]
进一步优化本技术方案，所述步骤s1中的发酵培养基的原料组分用水定容至所需用量，所需发酵罐装料量30l。
[0015]
进一步优化本技术方案，所述步骤s1中种子培养基分装至种子摇瓶装量120ml/瓶，所述步骤s1中发酵培养基分装至发酵摇瓶70ml/瓶。
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进一步优化本技术方案，所述步骤s3中每隔一个小时测量一次至培养24h时结束，种子罐同时进行取样。
[0017]
进一步优化本技术方案，所述步骤s5中最佳移种时间段为22-23h。
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有益效果
[0019]
与现有技术相比，本发明提供了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，具备以下有益效果：
[0020]
1、该产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，本发明将原有的测量技术结合在一起并与生产经验结合，克服了单一一种技术的缺点，使得测量结果更加精确，将理论与实际生产经验结合到一起，实验室与生产结合更加紧密，为生产提供符合条件的优良种子。
[0021]
2、该产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，本发明制备菌种对数生长期的检测方法减少单一技术造成的误差，获得该生产用放线菌菌种的最适培养时间，为发酵罐提供旺盛、质量优良的种子，产率提升、成本降低；将该放线菌培养至对数生长期进行菌种保藏，保藏时间相对延长，菌种性能相对稳定。
附图说明
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图1为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的流程示意图；
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图2为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法摇瓶种子ph随时间变化图；
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图3为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的摇瓶种子菌浓随时间变化图；
[0025]
图4为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的摇瓶种子吸光度值随时间变化图；
[0026]
图5为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法摇瓶种子透射比值随时间变化图；
[0027]
图6为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的摇瓶种子干重随时间变化图；
[0028]
图7为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的摇瓶发酵效价检测结果；
[0029]
图8为本发明提出的一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法的种子罐ph、菌浓、透射比(图a)和吸光度(图b)随时间变化图。
具体实施方式
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下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
实施例一：请参考图1，本发明公开了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，包括以下步骤：
[0032]
s1、保藏菌种：制备一批该放线菌种子液体培养基和发酵培养基并分装，种子培养基分装至种子摇瓶，设置三个平行实验，发酵培养基分装至发酵摇瓶，种子培养基分装至种子摇瓶装量120ml/瓶，发酵培养基分装至发酵摇瓶70ml/瓶，种子培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖1.0％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％以及轻质碳酸钙0.1％，种子培养基的原料组分用水定容至所需用量，所述种子罐的装料量为10l，发酵培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖6.0％、蛋白胨1.0％、玉米粉1.0％、黄豆饼粉3.0％、0.1％、轻质碳酸钙0.5％、硫酸镁0.4％、氯化铵0.5％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.003％、氯化锰0.03％以及泡敌0.1％，发酵培养基的原料组分用水定容至所需用量，所需发酵罐装料量30l；
[0033]
s2、种子培养基：取保藏的菌种接种于步骤s1中的种子液体培养基，以不接菌种的培养基为空白对照，在相同的条件下进行培养并与种子罐培养同步；
[0034]
s3、od值、透射比、ph值和菌浓测量：从培养12h开始对该放线菌种子培养液进行od值、透射比、ph值和菌浓测量，过滤后弃去滤液留取滤渣于烘箱105℃烘干称取干重，每隔一个小时测量一次至培养24h时结束，种子罐同时进行取样；
[0035]
s4、发酵培养和效价检测：将培养21h的种子接入步骤s1中的发酵摇瓶培养基，每个时间段的发酵摇瓶培养一定时间后进行效价检测；
[0036]
s5、对数生长期：对实验数据进行统计分析得出最佳移种时间段，最佳移种时间段为22-23h。
[0037]
实施例二：请参考图1，本发明公开了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，包括以下步骤：
[0038]
s1、保藏菌种：制备一批该放线菌种子液体培养基和发酵培养基并分装，种子培养基分装至种子摇瓶，设置三个平行实验，发酵培养基分装至发酵摇瓶，种子培养基分装至种子摇瓶装量120ml/瓶，发酵培养基分装至发酵摇瓶70ml/瓶，种子培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖1.0％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％以及轻质碳酸钙0.1％，种子培养基的原料组分用水定容至所需用量，所述种子罐的装料量为10l，发
酵培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖6.0％、蛋白胨1.0％、玉米粉1.0％、黄豆饼粉3.0％、0.1％、轻质碳酸钙0.5％、硫酸镁0.4％、氯化铵0.5％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.003％、氯化锰0.03％以及泡敌0.1％，发酵培养基的原料组分用水定容至所需用量，所需发酵罐装料量30l；
[0039]
s2、种子培养基：取保藏的菌种接种于步骤s1中的种子液体培养基，以不接菌种的培养基为空白对照，在相同的条件下进行培养并与种子罐培养同步；
[0040]
s3、od值、透射比、ph值和菌浓测量：从培养12h开始对该放线菌种子培养液进行od值、透射比、ph值和菌浓测量，过滤后弃去滤液留取滤渣于烘箱105℃烘干称取干重，每隔一个小时测量一次至培养24h时结束，种子罐同时进行取样；
[0041]
s4、发酵培养和效价检测：将培养23h的种子接入步骤s1中的发酵摇瓶培养基，每个时间段的发酵摇瓶培养一定时间后进行效价检测；
[0042]
s5、对数生长期：对实验数据进行统计分析得出最佳移种时间段，最佳移种时间段为22-23h。
[0043]
实施例三：请参考图1，本发明公开了一种产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，包括以下步骤：
[0044]
s1、保藏菌种：制备一批该放线菌种子液体培养基和发酵培养基并分装，种子培养基分装至种子摇瓶，设置三个平行实验，发酵培养基分装至发酵摇瓶，种子培养基分装至种子摇瓶装量120ml/瓶，发酵培养基分装至发酵摇瓶70ml/瓶，种子培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖1.0％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％以及轻质碳酸钙0.1％，种子培养基的原料组分用水定容至所需用量，所述种子罐的装料量为10l，发酵培养基包括以下质量份数的组分：葡萄糖6.0％、蛋白胨1.0％、玉米粉1.0％、黄豆饼粉3.0％、0.1％、轻质碳酸钙0.5％、硫酸镁0.4％、氯化铵0.5％、硫酸亚铁0.005％、硫酸锌0.003％、氯化锰0.03％以及泡敌0.1％，发酵培养基的原料组分用水定容至所需用量，所需发酵罐装料量30l；
[0045]
s2、种子培养基：取保藏的菌种接种于步骤s1中的种子液体培养基，以不接菌种的培养基为空白对照，在相同的条件下进行培养并与种子罐培养同步；
[0046]
s3、od值、透射比、ph值和菌浓测量：从培养12h开始对该放线菌种子培养液进行od值、透射比、ph值和菌浓测量，过滤后弃去滤液留取滤渣于烘箱105℃烘干称取干重，每隔一个小时测量一次至培养24h时结束，种子罐同时进行取样；
[0047]
s4、发酵培养和效价检测：将培养25h的种子接入步骤s1中的发酵摇瓶培养基，每个时间段的发酵摇瓶培养一定时间后进行效价检测；
[0048]
s5、对数生长期：对实验数据进行统计分析得出最佳移种时间段，最佳移种时间段为22-23h。
[0049]
判断标准：通过三个实施例对比，效果最佳者为实施例二，因此，选择实施例二为最佳实施例，具体对量的改变，也属于本技术方案保护的范围。
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本发明的有益效果：该产安普霉素放线菌菌种对数生长期的检测方法，本发明将原有的测量技术结合在一起并与生产经验结合，克服了单一一种技术的缺点，使得测量结果更加精确，将理论与实际生产经验结合到一起，实验室与生产结合更加紧密，为生产提供符合条件的优良种子；本发明制备菌种对数生长期的检测方法减少单一技术造成的误差，
获得该生产用放线菌菌种的最适培养时间，为发酵罐提供旺盛、质量优良的种子，产率提升、成本降低；将该放线菌培养至对数生长期进行菌种保藏，保藏时间相对延长，菌种性能相对稳定。
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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。