一种反式糖苷水解酶及其在糖苷结构改造及修饰中的应用的制作方法

文档序号:23985849发布日期:2021-02-20 12:04阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种反式糖苷水解酶,其特征在于,所述的反式糖苷水解酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列,其特征在于,所述的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.一种表达载体,其特征在于,含有权利要求2所述的核苷酸序列。5.一种宿主细胞,其特征在于,含有权利要求4所述的表达载体。6.一种制备权利要求1所述的反式糖苷水解酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)反式糖苷水解酶基因的获取活化clostridium stercorarium dsm8532菌种,收集细胞,按照用柱式质粒dna小量抽提试剂盒说明说提取dna,将提取好的dna作为pcr的模板;以上下游引物进行pcr扩增,获得编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列,上下游引物分别为:上游引物:agctgaagaacgcggaatga下游引物:agcattcgatgccgagctta(2)重组质粒的构建及转化将步骤(1)获得的编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列通过xhoi和bamhi酶切位点和载体pet-24c(+)连接,得到含有编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列的重组表达载体,命名为pet-24c(+)-gh;(3)重组酶的表达挑起单菌落重组大肠杆菌pet-24c(+)-gh至含抗生素的lb培养基中,37℃,220rpm,培养过夜,然后按照5%的接种量,接种到新鲜培养液中,培养至od600为0.7时,加入诱导剂iptg,使iptg在培养基的终浓度为0.2mmol/l,31℃,220rpm,诱导10个小时,收集菌体10000rpm/20min;(4)纯化将离心得到的菌体,加入6倍体积的0.1m的pbs缓冲液,放置冰水中,超声破碎机破损,所得浑浊液离心,所得上清即为粗酶液;于上清粗酶液中加入絮凝剂,待有沉淀生成后离心去滤渣,用30kda的超滤膜超滤,以除去小分子蛋白和盐,以及会对后续反应带来影响的微量元素并提高酶活性,浓缩至破碎液体积的30%,得到纯化后的反式糖苷水解酶,其中,优选的,所述的絮凝剂为阳离子型聚丙烯酰胺絮凝剂。7.权利要求1所述的反式糖苷水解酶在糖苷结构改造及修饰中的应用,其特征在于,所述的反式糖苷水解酶通过水解糖单元之间的反式糖苷键实现对糖苷结构的改造及修饰。8.一种人参皂苷rh2的酶催化制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)酸解取三七茎叶总皂苷加入8-12倍体积的4-6%v/v的乙酸回流酸解8-12h,冷却析晶过滤,干燥获得酸解物;(2)酶解及纯化酸解物加8-12倍体积的含有0.5-3%w/v的权利要求1所述的反式糖苷水解酶的pbs缓冲溶液,50-65℃水解18-24h,调酸析出,干燥得酶解物;
(3)纯化用硅胶柱分离,洗脱剂采用三氯甲烷和甲醇混合溶剂比例洗脱,tlc跟踪监测,洗脱完成后,收集目标物负压浓缩,低温浓缩后冷冻干燥,重结晶可得纯品人参皂苷rh2,含量≥98%,构型为r型。9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中硅胶与酶解物比例为100:1的分离比,洗脱剂中,三氯甲烷和甲醇的体积比为4:1。10.一种蓣皂素的酶催化制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)葡萄糖基薯蓣皂苷的制备薯蓣皂苷采用含有15-25%v/v的乙醇的0.05m,ph7.0的pbs使之溶解,加入0.1-0.5倍体积的20u/ml的权利要求1所述的反式糖苷水解酶,30-40℃反应3-5小时,tlc点板监测,完全转化,液相检测,转化完全后挥去乙醇,过滤可得产物,即为葡萄糖基薯蓣皂苷;(2)薯蓣皂素的制备葡萄糖基薯蓣皂苷采用含有15-25%v/v的乙醇的0.05m,ph7.0的pbs使之溶解,加入底物1%w/w的β葡萄糖水解酶10u/ml,55-65℃反应1-.5-2.5h,液相检测,转化完全后挥去乙醇,过滤可得产物,即为薯蓣皂素,重结晶后得纯品,含量>98%。
当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1