一种PD-1敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法与流程

一种pd-1敲除的cd19car-t细胞的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术，特别是涉及一种新的pd-1敲除的cd19car-t细胞的构建方法。


背景技术：

2.car-t(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法)是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰t细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖t细胞的信号传递至胞内，引起t细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。car分子大致可分为5代演变：i代，特异性t细胞激活；ii代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；iii代，同时具有两个共刺激因子，提高t细胞增殖能力与杀伤毒性；iv代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放(如il-7，il-15)激活等；v代，通用型car。与普通的免疫细胞治疗相比，car-t技术具有许多独特的优势，如car能非mhc依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过apc。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强t细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。
3.目前，car-t免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对b相关抗原cd19阳性的b细胞恶性肿瘤，如急性b-淋巴细胞白血病(b-all)，慢性b-淋巴细胞白血病(b-cll)，b细胞霍奇金氏淋巴瘤(b-hl)和非霍奇金氏淋巴瘤(b-nhl)，car-t-cd19t细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示car-t-cd19治疗在成人和儿童复发和难治性b-all中可以获得高达90％的完全缓解率(complete remission，cr)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的car-cd19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经car-t治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。
4.尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，car主要的转染模式包括慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升car-t细胞疗法的安全性的重要环节。亟待研发这一种新的构建cd19car-t细胞的方法
5.pd-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。pd1的主要功能是限制外周组织的效应t细胞活性。肿瘤细胞表达的pd1配体和t细胞的pd1结合，抑制t细胞激活相关激酶，从而抑制效应t细胞活性。利用pd1单克隆抗体(mdx-1106、mk3475、ct-011、amp-224等)，抑制pd1配体和pd1结合，从而达到治疗肿瘤的效果。
6.但是，利用pd1抗体的治疗只在黑色素癌疗效较好，对肾癌和肺癌有部分疗效。因为利用抗体进行靶基因的治疗还受到一些因素的限制：(1)抗体的作用只是暂时阻断的作
加上ccgg，如果序列本身在5’端已经有1或者2个g，那么就对应的省略1或者2个g，合成得到正向寡核苷酸即forward oligo；
26.所述的sgrna获得其对应dna序列的互补链，并且在互补链的5’加上aaac合成得到反向寡核苷酸即reverse oligo；
27.将合成的1对互补的sgrna寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入u6真核表达载体的双链sgrna寡聚核苷酸；
28.线性化载体pgl3-u6-sgrna质粒；将退火的双链sgrna寡聚核苷酸与线性化pgl3-u6-sgrna质粒连接获得pgl3-u6-hpd1sg质粒；
29.pgl3-u6-hpd1sg质粒转化感受态细菌并涂amp+平板，挑选阳性克隆并用通用引物u6测序的方法鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用axyprep plasmid miniprep kit抽提，得到pgl3-u6-hpd1sg质粒。
30.本发明中，car-t，全称是chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。
31.本发明具有如下优点：
32.本发明实验证明：采用非病毒类载体piggybac系统，具有更高的安全性和有效性，采用的nucleofector细胞核技术，能够将外源基因直接导入到细胞核，克服了脂质体转染和普通电穿孔，必须依赖细胞分裂时才有可能使外源基因入核表达的缺陷，细胞具有更高的存活率和增殖效率。pd-1敲除的免疫细胞较pd-1未敲除的car-cd19 t细胞，具有更高的细胞杀伤能力。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
34.图1为本发明提供的流式检测cd19car-t细胞c-myc(car expression)的表达；
35.图2为本发明提供的cd19car-t cell细胞体外杀伤能力检测图；
36.图3为本发明提供的cd19car-tcell细胞因子表达水平检测图；
37.图4为本发明提供的cd19car-tcell增殖能力检测图；
38.图5为本发明提供的流式检测cd19car-t细胞激活markercd25/cd28的表达情况图；
39.图6为本发明提供的流式检测记忆cd19car-t细胞marker cd45ro/cd62l的表达情况图。
具体实施方式
40.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1、本发明实施例的pgl3-u6-hpd1sg载体的构建
42.一、sgrna寡核苷酸的设计和选择
43.1、靶向pd1基因(homo sapiens programmed cell death 1(pdcd1),refseqgene on chromosome 2 ncbi reference sequence:ng_012110.1)的sgrna的设计：(1)在pd1基因上选择5
’-
ggn(19)gg的序列，如果没有5
’-
ggn(19)gg的序列，5
’-
gn(20)gg或者5
’-
n(21)gg也可以。(2)sgrna在pd1基因上的靶向位点位于基因的外显子。(3)sgrna在pd1基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。(4)在ucsc数据库中用blat或ncbi数据库中用blast，确定sgrna的靶序列是否唯一。
44.2、靶向pd1基因的sgrna的选择：(1)不能离atg起始子太近，防止转录会从下游另一个atg开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活；(2)sgrna在pd1基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中；(3)选择相隔一定距离(10～30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
45.二、构建sgrna的寡聚核苷酸双链
46.根据选择的sgrna，在其5’加上ccgg得到正向寡核苷酸(forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有1或者2个g，那么就对应的省略1或者2个g)；根据选择的sgrna，获得其对应dna的互补链，并且在其5’加上aaac得到反向寡核苷酸(reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入u6真核表达载体的双链，如下：
47.forward oligo:5
′-
ccggnnnnnnnnnnnnnnnnnn
48.reverse oligo:nnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5
′
49.变性、退火体系为：2.5μl forward oligo(100μm)2.5μl reverse oligo(100μm)；1μl neb buffer2。
50.4μl灭菌水，在pcr仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95 85℃at-2℃/s；85 25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
51.三、sgrna寡聚核苷酸质粒的构建
52.1、线性化载体pgl3-u6-sgrna质粒
53.酶切体系和条件如下：2μg pgl3-u6-sgrna(400ng/μl)；1μl cutsmart buffer；1μl bsai(neb，r0535l)；补水至50μl，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切完成后用axyprep pcr clean up kit(ap-pcr-250)纯化回收至20～40μl灭菌水中。
54.2、将退火的sgrna寡聚核苷酸双链与线性化pgl3-u6-sgrna质粒连接获得pgl3-u6-hpd1sg质粒。3μl，50μm退火产物(双链sgrna寡聚核苷酸)，1μl线性化的pgl3-u6-sgrna质粒(25ng/μl)，1μl t4 ligation buffer；0.5μl t4 ligase(neb，m0202s)，4.5μl灭菌水，16℃孵育1小时。
55.3、将上述步骤获得的连接产物转化dh5α感受态细胞(transgen,cd201)并涂amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
56.4、用通用引物u6测序的方法鉴定获得阳性克隆。
57.5、37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用axyprep plasmid miniprep kit(ap-mn-p-250)抽提质粒，获得pgl3-u6-hpd1sg1质粒。
58.本发明实施例中，质粒pst1374-nls-flag-cas9-zf的制备方法参见文献：shen et al.2013,generation of gene-modified mice via cas9/rna-mediated gene ta rgeting.cell research23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46)。
59.实施例2、本发明的pd-1敲除的cd19car-t细胞的构建方法
60.本发明实施例提供pd-1敲除的cd19car-t细胞的构建方法，其过程如下：
61.根据piggybac载体的的特性，查找cd19的单链抗体可变区(scfv)基因片段序列，并设计合成包括来源于cd19抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连接分子相连组成的单链抗体(single-chain variable fragment，scfv)，中间片段由cd8来源的连接和穿膜片段组成，膜内片段由传递信号的效应分子如cd3ζ组成。本发明中，cd19car由依次连接的cd8信号肽、cd19单链抗体、cd8铰链及跨膜区、胞内4-1bb(亦即cd137)、胞内cd3ζ融合而成。
62.cd8α铰链区(seq id no.3)：
63.fvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd；
64.cd8α跨膜区(seq id no.4)：iyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn；4-1bb(seq id no.5)：rfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel；
65.cd3zeta(seq id no.6)：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。
66.将合成的目的基因连接到pmd 18-t simple vector上，采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到piggybac载体上，使用载体特异性引物进行pcr扩增并测序来检测合成的目的基因序列是否正确，接着将连接产物转入到大肠杆菌感受态top10中，使含有目的片段的piggybac载体在大肠杆菌中大量扩增。
67.具体的所述片段设计合成方法为：通过设计合成cd19-car片段，该片段主要包括对cd19抗原具有特异性的单链抗体片段scfv，myc-tag，cd8来源的跨膜铰链，共刺激因子cd28和4-1bb片段，及细胞内传递信号cd3ζ，然后将cd19-car连接到piggybac载体上。
68.构建成功后，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取质粒。取人血清，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，并加入t淋巴细胞培养液，ifn-γ，okt-3和hil-2进行扩展培养。
69.采用nucleofector细胞转染系统转染共转染质粒piggybac-car-cd19，piggybac transposase,pgl3-u6-hpd1sg1以及pst1374-nls-flag-cas9-zf到t细胞，48小时后，收集细胞，myc-tag荧光抗体标记，使用流式细胞仪检测cd19-car的表达。
70.本发明采用nucleofector细胞核技术，将含有cd19的单链抗体可变区基因片段的piggybac载体质粒piggybac-car-cd19，转座酶表达质粒piggybac transposase，含有能成功靶向pd1基因的sgrna表达质粒pgl3-u6-hpd1sg1，以及pst1374-nls-flag-cas9-zf质粒共转染入t细胞，得到pd-1基因敲除的cd19 car-t细胞。
71.cd19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区之间通过连接肽连接，重链可变区包括重链可变区互补决定区1 cdr-h1、重链可变区互补决定区2 cdr-h2和重链可变区互补决定区3 cdr-h3；轻链包括轻链可变区，轻链包括轻链可变区互补决定区1 cdr-l1、轻链可变区互补决定区2 cdr-l2和轻链可变区互补决定区3 cdr-l3。
72.具体的，重链可变区互补决定区1 cdr-h1的氨基酸序列为如seq id no.2所示氨基酸序列中第26-35所示的氨基酸残基组成。重链可变区互补决定区2 cdr-h2的氨基酸序
列如seq id no.2所示氨基酸序列中第50-65所示的氨基酸残基组成。重链可变区互补决定区3 cdr-h3的氨基酸序列seq id no.2所示氨基酸序列中第98-109所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区1 cdr-l1的氨基酸序列seq id no.2所示氨基酸序列中第159-168所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区2cdr-l2的氨基酸序列seq id no.2所示氨基酸序列中第185-191所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区3cdr-l3的氨基酸序列seq id no.2所示氨基酸序列中第224-232所示的氨基酸残基组成。重链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示氨基酸序列中第1-120所示的氨基酸残基组成。轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示氨基酸序列中第136-242所示的氨基酸残基组成。连接肽的氨基酸序列如seq id no.2所示氨基酸序列中第121-135所示的氨基酸残基组成。
73.cd19单链抗体的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：
74.diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss。
75.实验证明，基因序列与设计合成的基因序列完全一致。目的基因如下：所述目的基因cd19单克隆抗体的编码核苷酸序列如seq id no.1所示。seq id no.1的信息：(i)序列特征；(a)长度：726bp，(b)类型：核苷酸，(c)链性：单链，(d)拓扑结构：线性；(ii)分子类型：寡核苷酸；(iii)序列描述：seq id no.1所示。
76.cd19的单链抗体的核苷酸序列如seq id no.1所示：
77.gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
78.实验中，淋巴细胞分离液，t淋巴细胞培养液为美国invitrogen公司产品，nucleofector细胞转染试剂购自lonza公司，ifn-γ，okt-3和hil-2抗体购自peprotech公司，myc-tag抗体购自cell signaling公司，无内毒素质粒大抽试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自美国zymo research公司，pcr试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，各种内切酶和t4连接酶均购自neb公司。
79.试验实施例、pd-1敲除的cd19car-t细胞的功能检测
80.1、pd-1敲除cd19car-t细胞的杀伤能力检测
81.1)准备靶细胞和非靶细胞：流式检测肿瘤靶细胞表面抗原的表达，当抗原表达较低时，需构建抗原过表达的靶细胞。同时，因杀伤检测的需要，需要在靶细胞以及非靶细胞上过表达luciferase。
82.2)细胞铺板：取2
×
105个靶细胞或非靶细胞铺于48孔板中，按照效靶比2:1，4:1，8:1，16:1的比例，分别加入未电转过的t细胞(nt细胞)，car-t细胞，以及基因编辑过的cd19car-t细胞，总体积300μl/孔，放于37℃，5％co2细胞培养箱内培养24小时。其中对照组不加t细胞培养，作为未杀伤最大值。
83.3)显微镜拍照检测t细胞杀伤能力。
84.4)收集培养的细胞，pbs清洗一次后，以100μl pbs重悬。并将细胞转移至不透明的96孔板中，加入100μl浓度为150μg/ml的luciferin，酶标仪检测荧光值。
85.5)计算t细胞的杀伤能力：1-靶细胞t细胞共培养荧光值/单独培养的靶细胞荧光值。
86.如图2所示本发明提供的pd-1敲除cd19car-t cell细胞体外杀伤能力检测图。
87.2、pd-1敲除cd19car-t细胞细胞因子分泌检测(il-2，tnf，ifn，gm-csf)
88.1)细胞铺板：取1
×
104个靶细胞或非靶细胞铺于96孔板中，按照效靶比2:1的比例，分别加入未电转过的t细胞(nt细胞)，car-t细胞，以及基因编辑过的cd19car-t细胞，总体积200μl/孔，放于37℃，5％co2细胞培养箱内培养24小时。
89.2)吸取上清100μl，1000转，5分钟。
90.3)取5μl上清转移至1/2area不透明96孔板中。
91.4)按照pe公司alphalisa kit进行检测。
92.如图3为本发明提供的cd19car-tcell细胞因子表达水平检测图。
93.3、pd-1敲除cd19car-t细胞增值能力检测
94.1)以可以标记蛋白的cfse染色，在细胞分裂过程中，cfse会随细胞分裂而逐渐被稀释，根据cfse荧光信号强度可以大体推测细胞的增值能力。
95.2)辐照靶细胞以及非靶细胞，70gy。
96.3)取辐照过的细胞1
×
105个铺于24孔板中。
97.4)t细胞pbs洗两次后，用5μm cfse的pbs染色，在培养箱中孵育5分钟。
98.5)用含有血清的培养基清洗2次后，按照效靶比10:1的比例，将car-t细胞，以及基因编辑过的cd19car-t细胞加入到24孔板中与肿瘤细胞共培养，连续培养一周，自72小时开始，每天流式检测cfse的荧光信号。
99.如图4所示，为本发明提供的pd-1敲除的cd19car-t cell增殖能力检测图。
100.4、pd-1敲除cd19car-t细胞激活，记忆细胞形成能力以及分化能力的检测
101.1)取靶细胞5
×
105个铺于t25培养瓶中，向培养瓶中加入10
×
106个t细胞共孵育72小时。不加靶细胞共培养的t细胞作为对照。
102.2)流式检测t细胞激活marker cd25/cd28的表达情况:
103.a、收集t细胞，用1ml pbs清洗一遍。
104.b、加入100μl抗体mixer，冰上避光孵育20分钟。
105.c、抗体配色方案:anti-c-myc-bv421,anti-cd25 apc-cy7,anti-cd28-apc
106.d、加入1ml pbs清洗一遍。
107.e、500μl pbs重悬。
108.f、流式上机检测。
109.3)流式检测记忆t细胞marker cd45ro/cd62l的表达情况：
110.流程同上，配色方案如下：
111.cd8a-apc,myc-bv421,cd45ro,cd62l
112.4)流式检测t细胞耗竭marker pd1/lag3/tim3的表达情况：流程同上，配色方案如下：
113.anti-c-myc-bv421,anti-pd1 pe,anti-tim3 percp-efluor710,anti-lag3 apc。
114.如图1所示，本发明提供的流式检测pd-1敲除cd19car-t细胞c-myc(car expression)的表达；如图6为本发明提供的流式检测pd-1敲除cd19car-t记忆细胞marker cd45ro/cd62l的表达情况图。
115.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
116.117.118.119.120.