一种人AP-2α基因的shRNA干扰序列及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物药物
技术领域：
，具体涉及一种人ap-2α基因的shrna干扰序列及其制备与应用。
背景技术：
：近年来的研究表明，一些短片断的双链rna可以通过促使特定基因的mrna降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达并诱导细胞表现出特定基因缺失的表型称为rna干扰，sirna就是这种短片段双链rna分子，其能够以序列同源互补的mrna为靶目标，降解特定基因的mrna。rnai的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程，现在越来越多的研究人员开始采用rnai来研究生物体的基因表达，rnai技术可广泛应用到包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析及疾病基因治疗等等；转录因子ap-2α属于ap-2(activatingprotein2)家族，其包括ap-2α、ap-2β、ap-2γ、ap-2δ和ap-2ε五个亚型；ap-2家族在调节细胞增殖、分化和凋亡以及哺乳动物的胚胎发育中起到重要作用。近年来,ap-2家族在肿瘤发生发展中的作用也日益受到关注。研究表明，ap-2的调节效应可能是双向作用即抑癌或促癌作用,与组织特异性、时相性以及各亚型之间差异性等相关；在ap-2家族中,ap-2α发现最早,ap-2α表达下降与胃腺癌患者的不良预后有关，而在胰腺癌细胞和横纹肌肉瘤表达高水平ap-2α，在乳腺癌中ap-2α表达上调与erbb-2过表达呈显著正相关联,提示ap-2α可能参与erbb-2诱导的乳腺癌发生；在结肠癌细胞中，ap-2α是以肿瘤抑制基因的角色发挥作用，由此提示ap-2α在不同类型的肿瘤中的作用不同；有文献报道，在宫颈癌细胞系hela、siha和caski中都表达ap-2α蛋白；而在现有技术中，还没有关于ap-2αrnai载体的构建方法方面的报道。技术实现要素：针对上述存在的问题，本发明旨在提供人ap-2α基因的shrna序列及其干扰慢病毒的构建方法，通过构建人ap-2α基因小分子干扰rna、人ap-2α基因干扰核酸构建体、人ap-2α基因干扰慢病毒等过程，证明了ap-2α基因sirna或含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人ap-2α基因的表达，能够高效侵染靶细胞，高效率抑制靶细胞中ap-2α基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种人ap-2α基因的shrna干扰序列，包括dnaoligo正链序列与反链序列；其中：正链序列为:5′-tgctgaatttctcaaccgacaactcgagttgtcggttgagaaattcagcttttttc-3′；反链序列为：5′-tcgagaaaaaagctgaatttctcaaccgacaactcgagttgtcggttgagaaattcagca-3′。一种人ap-2α基因的shrna干扰序列的构建方法，所述方法包括：s1.设计合成针对人ap-2α基因的有效的sirna靶点，得到靶向人ap-2α基因的有效sirna靶点序列为：5′-tgaatttctcaaccgacaa-3′；s2.利用sirna靶点合成人ap-2α基因的dnaoligo干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，同时在正链3’端添加ttttt终止信号，反链5’端添加终止信号互补序列，合成单链dnaoligo；s3.将单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链dnaoligo。一种人ap-2α基因的shrna干扰序列构建慢病毒的应用，利用人ap-2α基因的shrna干扰序列构建慢病毒的具体过程为：s1.通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna连接；s2.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行pcr鉴定；s3.质粒抽提，病毒包装；s4.利用得到的慢病毒对ap-2α基因的沉默效率进行检测。优选的，步骤s1所述的通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna连接的具体过程包括：s101线性化载体制备(1)按41μl的ddh2o、5μl的10×cutsmartbuffer、2μl的纯化的质粒dna(1μg/μl)、1μl的hpai(10u/μl)酶、1μl的xhoi(10u/μl)酶的添加顺序配制50μl酶切反应体系，然后用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜，得到载体酶切产物；(2)对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，使其线性化，并于37℃反应1h，之后切胶回收目的片段；s102连接(1)按1μl的线性化载体dna100ng/μl、1μl的dnaoligo100ng/μl、2μl的10×t4噬菌体dna连接酶buffer、1μl的t4噬菌体dna连接酶和15μl的ddh2o的加入顺序配制连接反应体系；(2)并将该连接反应体系于16℃连接过夜，即实现将线性化载体与人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna连接。优选的，步骤s2所述的将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行pcr鉴定的具体过程包括：s201用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞；s202利用步骤s102得到的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；s203对已转化的感受态细胞进行阳性克隆pcr鉴定。优选的，步骤s203所述的对已转化的感受态细胞进行阳性克隆pcr鉴定的具体过程包括:(1)rna干扰载体构建及阳性克隆鉴定取转化子重悬于10μllb溶液，混匀取1μl作为模板；使用gv118通用引物，设计鉴定引物，并进行菌落pcr鉴定实验；(2)进行pcr扩增配置20μlpcr反应体系：包括2μl10×buffer，0.8μldntps(2.5mm)，0.4μlprimer(+)，0.4μlprimer(-)，0.2μltaqpolymerase，1μldna模板，15.2μlddh2o；然后进行pcr扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30次循环；72℃6min；(3)pcr结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，并对扩增得到的检测到呈阳性的tfap2a-rnai(36379)进行测序。优选的，步骤(1)所设计得到的鉴定引物为：鉴定引物-f：primer1:5’-gccccggttaatttgcatat-3’；鉴定引物-r:primer2:5’-gaggccagatcttgggtg-3’。优选的，步骤(3)测序得到的tfap2a-rnai(36379)的基因序列如序列表中sedidno.1所示。优选的，步骤s3所述的质粒抽提，病毒包装的具体过程包括：s301将测序正确的阳性克隆转化子的菌液转接于150ml含amp抗生素的lb液体培养基中，在37℃摇床震荡培养过夜，利用质粒抽提试剂盒抽取质粒；s302将抽提得到的lentivirus慢病毒连同phelper1.0载体、phelper2.0载体转染297t细胞进行病毒包装。一种人ap-2α基因的shrna干扰序列构建慢病毒的应用，步骤s4的检测结果证明：人ap-2α基因的shrna干扰序列、人ap-2α基因干扰核酸构建体、表达人ap-2α基因sirna的慢病毒能够抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡。本发明的有益效果是：本发明公开了一种人ap-2α基因的shrna干扰序列及其制备与应用与现有技术相比，本发明的改进之处在于：本发明设计了一种ap-2α基因的shrna干扰序列，并利用该基因制备表达shrna干扰序列慢病毒和实验证明：该ap-2α基因的shrna表达产物，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能,ap-2α基因可以作为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的ap-2α基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种潜在新手段。附图说明图1为本发明rnai慢病毒载体构建流程图。图2为本发明rnai慢病毒载体构建过程中线性载体酶切电泳图。图3为本发明rnai慢病毒载体构建过程中琼脂糖电泳检测图。图4为本发明rnai慢病毒小量包装流程图。图5为本发明rnai慢病毒载体构建过程得到的慢病毒载体图谱及信息图。图6为发明实施例1rt-pcr内源筛选有效rnai载体流程图；图7本发明实施例1ap-2α基因对人宫颈癌细胞hela中ap-2αmrna的表达水平的抑制率的柱状图。图8为本发明实施例2rnai前后hela细胞中ap-2α蛋白的表达情况图。图9为本发明实施例3各组hela细胞增殖能力变化柱状图。图10为本发明实施例4转染ap-2αsirna慢病毒的肿瘤细胞克隆形成的柱状图。图11本发明实施例5转染ap-2αsirna慢病毒的肿瘤细胞凋亡变化的柱状图。其中：在图2中：泳道1：10kbmarker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：hpai和xhoi双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；图3中：泳道1：阴性对照(ddh2o)；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆tfap2a-rnai(36379)-1，2，3，4，5。具体实施方式为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。参照附图1-11所示的一种人ap-2α基因的构建方法，包括以下步骤：步骤一：ap-2α基因rna干扰靶点设计及双链dnaoligo制备s1.设计合成针对人ap-2α基因的有效的sirna靶点(1)从genbank调取人ap-2α(nm_001372066)基因信息；设计针对人ap-2α基因的有效的sirna靶点；(2)设计得到的靶向人ap-2α基因的有效sirna靶点序列为：5′-tgaatttctcaaccgacaa-3′(1014-1032bp)，gc％为36.84％；s2.dnaoligo序列合成(1)根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列，合成单链dnaoligo；两端含hpai和xhoi酶切位点粘端的单链dnaoligo如表1所示：表1：两端含hpai和xhoi酶切位点粘端的单链dnaoligos3.双链dnaoligo制备(1)将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min；(2)自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链dnaoligo，包括dnaoligo正链序列与反链序列；其中：正链序列为:5′-tgctgaatttctcaaccgacaactcgagttgtcggttgagaaattcagcttttttc-3′；反链序列为：5′-tcgagaaaaaagctgaatttctcaaccgacaactcgagttgtcggttgagaaattcagca-3′步骤二：利用人步骤一得到的ap-2α基因的shrna干扰序列构建慢病毒的应用，包括以下过程：s1.通过酶切使载体线性化，使线性化载体与人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna连接，其具体过程为；s101线性化载体制备(1)按41μl的ddh2o、5μl的10×cutsmartbuffer、2μl的纯化的质粒dna(1μg/μl)、1μl的hpai(10u/μl)酶、1μl的xhoi(10u/μl)酶的添加顺序配制50μl酶切体系，然后用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜，得到载体酶切产物，所述酶切体系如表2所示；表2：酶切体系(2)对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，使其线性化，并于37℃反应1h，之后切胶回收目的片段，电泳结果如图1所示，其中在图2中：泳道1：10kbmarker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：hpai和xhoi双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒，电泳结果说明线性化载体构建成功。s102连接(1)按1μl的线性化载体dna100ng/μl、1μl的dnaoligo100ng/μl、2μl的10×t4噬菌体dna连接酶buffer、1μl的t4噬菌体dna连接酶和15μl的ddh2o的顺序配制连接反应体系，反应体系如表3所示：表3：连接反应的反应体系(2)并与16℃连接过夜，即实现将线性化载体与人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna连接，得到连接产物。s2.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行pcr鉴定，其具体过程如下：s201用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞(1)从于37℃培养16小时新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlsob培养基的1l烧瓶中；在旋转摇床上37℃剧烈振摇(300rpm)培养3小时；(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃；(3)于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞；(4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽；(5)以10ml用冰预冷的0.1mol/lcacl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；(6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞；(7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽；(8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/lcacl2重悬每份细胞沉淀；(9)得到新鲜的大肠杆菌感受态细胞，并将细胞分装成小份，放于-70℃冻存；s202利用步骤s102得到的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：(1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接产物，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；(2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管，再快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟；(3)每管加800μlsoc培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；(4)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/lmgso4和amp抗性(100ug/ml)的lb琼脂培养基上；(5)将平板置于室温直至液体被吸收，再倒置平皿，于37℃培养，16小时，即实现人ap-2α基因的shrna干扰序列的双链dna对大肠杆菌感受态细胞的转化；s203对已转化的感受态细胞进行阳性克隆pcr鉴定(1)rna干扰载体构建及阳性克隆鉴定取转化子(转化的大肠杆菌感受态细胞)重悬于10μllb溶液，混匀取1μl作为模板；使用gv118通用引物，进行菌落pcr鉴定实验；(2)设计引物序列，引物序列如表4所示：表4：引物序列primer(+)5’-gccccggttaatttgcatat-3’primer(-)：5’-gaggccagatcttgggtg-3’(3)进行pcr扩增按表5配制20μlpcr反应体系，包括：2μl10×buffer，0.8μldntps(2.5mm)，0.4μlprimer(+)，0.4μlprimer(-)，0.2μltaqpolymerase，1μldna模板，15.2μlddh2o；表5：pcr反应体系然后用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行pcr扩增，pcr扩增的反应条件为：首先94℃解链3min；然后94℃解链30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，解链-退火-延伸进行30次循环；最后72℃延伸6min；(4)pcr结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，并对扩增得到的检测到呈阳性的tfap2a-rnai(36379)进行测序，如图3所示，其中在图3中：泳道1：阴性对照(ddh2o)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bpmarker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆tfap2a-rnai(36379)-1,2,3,4,5；结果说明：泳道1无显影，说明检测系统无核酸污染；没有连接入shrna片段的空载体克隆pcr片段大小为：299bp(泳道2)：连接入shrna片段的阳性克隆pcr片段大小为：340bp(泳道4-8)，由此判断tfap2a-rnai(36379)-1,2,3,4,5为阳性克隆，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序；(5)阳性克隆测序结果将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序；以鉴定引物-f进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验，所述tfap2a-rnai(36379)测序结果如序列表中sedidno.1所示。s3.质粒抽提、病毒包装，其具体过程包括：s301质粒抽提(1)将测序正确的阳性克隆转化子的菌液转接于150ml含amp抗生素的lb液体培养基中，在37℃摇床震荡培养过夜；(2)然后以qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒dna即gv118、phelper1.0、phelper2.0，质粒dna溶于无菌te中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒dna的a260/a280在1.8-2.0之间，将质检合格的质粒进行病毒包装；s302将抽提得到的lentivirus慢病毒包装(如图4所示流程)(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2x107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养；(2)24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染，注意：细胞状态对于病毒包装非常重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv118载体20μg，phelper1.0载体15μg，phelper2.0载体10μg)，与相应体积的opti-mem混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟；(4)将lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μllipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlopti-mem混合，在室温下温育5分钟；(5)把稀释后的dna与稀释后癿lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，注意：不要振荡，必须在5分钟之内混合；(6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成dna与lipofectamine2000稀释液的转染复合物；(7)将dna与lipofectamine2000混合液转移至293t细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％co2细胞培养箱中培养；(8)养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的pbs液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去；(9)养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的pbs液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。s3.3慢病毒的收获及浓缩(1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293t细胞上清液；(2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片，以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子；(4)将过滤杯插到滤过液收集管中，组合好后，做好平衡，放在转头上；(5)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟；(6)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上；(7)离心力不超过1000g,时间为2分钟，注意：离心力过高转速会导致样品损失，把过滤杯从样品收集杯上移开；样品收集杯中的即为病毒浓缩液，得到的病毒浓缩液的载体图谱及信息如图5所示；(8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定。s4.利用得到的慢病毒对ap-2α基因的沉默效率进行检测，其具体包括以下实验：s4.1实施例1：rt-pcr检测ap-2α基因的沉默效率实验(其过程如图6所示)1、抽取处于对数生长期的人宫颈癌细胞hela细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板，培养至细胞融合度达到约30％，加入适量的利用上述人ap-2α基因的shrna干扰序列制备的慢病毒，培养6小时后更换培养基，待侵染时间达到3天后，收集细胞；2、对收集细胞进行rna抽提及cdna合成：①收取样品，trizol裂解，收集hela和siha细胞(6孔板80％细胞密度)，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mltrizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mlep管中；②每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒ep管15s，室温静置10min；③4℃、12800rpm，离心15min；④吸取上层液体移至新的1.5mlep管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min；⑤4℃、12800rpm离心12min后，弃上清；⑥加入1ml、depc水新鲜配制的75％乙醇，洗涤沉淀；⑦4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清；⑧4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥；⑨待rna沉淀基本透明时，加入适量rnase-free水至完全溶解，nanodrop2000/2000c分光光度计分析测定所抽提rna的浓度及质量；⑩反转录获得cdna；所述反转录获得cdna的过程为：将2μl反转录引物(0.5μg/μl)和2.0μgtotalrna加入到pcr小管中，补rnase-freeh2o至11μl；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使反转录引物和模板退火；在上述混合物中按如表6所示的比例，在冰浴中进行反应体系(25μl体系)配制，混匀，短暂离心；表6：冰浴反应体系3、将上述表6反应体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min使rt酶失活，将得到的反转录产物cdna，置于-20℃保存备用；4、设计rt-pcr反应体系(1)设计人ap-2α基因的引物如下：上游引物5’-ctgggcactgtaggtcaatctc-3’；下游引物5’-ggagtaaggatcttgcgactgg-3’；(2)然后以管家基因gapdh为内参，gapdhrt-pcr引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(3)利用上述(1)和(2)所述的引物配制rt-pcr反应体系如表7所示：表7：rt-pcr反应体系5、rt-pcr检测过程设定程序为两步法real-timepcr：预变性95℃，30s，之后变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环；每次在延伸阶段读取吸光值，pcr结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使dna双链充分结合；从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线；采用2-δδct分析法计算侵染pycr1mrna的表达丰度；实验结果表明，人宫颈癌细胞hela中ap-2αmrna的表达水平分别下调了93.1％，实验证明构建的表达ap-2α基因shrna的慢病毒构建体能有效抑制ap-2αmrna的表达(图7所示)。s4.2实施例2：westernblotting检测ap-2α基因的沉默效率实验1、细胞总蛋白提取(1)接收细胞样品，pbs洗涤两次后，适量预冷的2×lysisbuffer(1mtris-hcl(ph6.8)100mm、2％巯基乙醇、甘油20％、sds4％)裂解；(2)细胞刮刮下细胞转移入ep管中，冰上裂解10-15min后超声破碎细胞(200w共4次，每次5s，间隔2s)；(3)4℃、12000g，离心15min，取上清bca法测定蛋白浓度；(4)调整每个样品蛋白浓度为2μg/μl，-80℃保存备用；2、配置10％sds-page分离胶和5％浓缩胶，胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样(其中蛋白上样量取20μg)，电泳(电泳条件为浓缩胶80ma，20min；分离胶120ma，1h)；3、免疫印迹(湿转)，电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300ma恒流条件下电转150min，将蛋白转移到pvdf膜上；4、抗体杂交(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的tbst溶液)室温封闭pvdf膜1h或4℃过夜；(2)一抗孵育：封闭液稀释抗体(兔抗人ap-2α单克隆抗体1:500，小鼠抗人gapdh单克隆抗体1:1000)，然后与封闭好的pvdf膜室温孵育2h或4℃过夜，并用tbst洗膜4次，每次8min；(3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗(1:5000)，室温下孵育pvdf膜1.5h，并用tbst洗膜4次，每次8min；5、x光显影：(采用thermo公司piercetmeclwesternblottingsubstrate试剂盒)(1)pvdf膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合a液和b液，混合液均匀滴加在pvdf膜上，避光反应5min；(2)将膜取出，稍微沥干多余的ecl底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上x光片(避免x光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min；(3)取出x光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)；(4)取出x光片，晾干，分析；得到rnai前后hela细胞中ap-2α蛋白的表达情况如图8所示，实验结果表明，在hela细胞中检测到目的条带，kd相对于nc显著下调，构建的表达ap-2α基因shrna的慢病毒构建体能有效抑制ap-2α蛋白水平。s4.3实施例3：检测转染ap-2α-sirna慢病毒的宫颈癌细胞的增殖能力实验1、设立空白对照组(con)、阴性对照组(nc)和基因沉默组(kd)2、将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；3、根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)，每组3-5重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)；4、统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现控制组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养；5、从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μl5mg/ml的mtt于孔中，无需换液，4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μldmso溶解甲瓒颗粒，振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测od值，数据统计分析，对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线如图9所示，mtt检测结果表明：相比con组和nc组，kd组细胞增殖明显降低(p<0.05)，构建的表达ap-2α基因shrna的慢病毒构建体能有效抑制肿瘤细胞的增殖水平。s4.4实施例4：检测转染ap-2α-sirna慢病毒的肿瘤细胞克隆形成的能力实验1、设立空白对照组(con)、阴性对照组(nc)和基因沉默组(kd)；2、将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数；3、细胞接种于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定)，每个实验组设3个复孔；4、将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；5、实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，pbs洗涤细胞1次。每孔加入1ml4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，pbs洗涤细胞1次，每孔加入洁净、无杂质giemsa染液500μl，染细胞10-20min，ddh2o洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数；得到各组的克隆数如图7所示，从图10可以看出，hela细胞kd组相比nc组和con组，kd组克隆数显著减少(p<0.05)，构建的表达ap-2α基因shrna的慢病毒构建体能有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。s4.5实施例5：检测转染ap-2αsirna慢病毒的肿瘤细胞凋亡水平实验1、设立空白对照组(con)、阴性对照组(nc)和基因沉默组(kd)；2、待各组6孔板细胞生长至覆盖率约为70％时胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一5ml离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105/处理)；3、1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的d-hanks(ph＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀；1×bindingbuffer洗涤细胞沉淀一次，1300rmp、3min离心，收集细胞；4、200μl1×bindingbuffer重悬细胞沉淀，加入10μlannexinv-apc染色，室温避光10-15min，根据细胞量，补加400-800μl1×bindingbuffer，上机检测，其检测结果如图11所示，图11结果表明：ap-2αrnai慢病毒感染hela细胞，培养5天后，kd组凋亡率与con组及nc组细胞对比显著升高(p<0.05)，证明ap-2α基因与细胞的增殖相关，其表达减低可以促进宫颈癌细胞发生凋亡。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>陕西省人民医院<120>一种人ap-2α基因的rna干扰靶点序列及其制备与应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ugaauuucucaaccgacaa19<210>2<211>19<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2uugucgguugagaaauuca19当前第1页12