用于东方鲀属鱼类快速鉴定的引物对、试剂盒和方法与流程

本发明涉及食品物种来源鉴定技术，具体涉及一种用于东方鲀属鱼类快速鉴定的引物对、试剂盒和方法。

背景技术：

随着我国经济水平的发展，我国人民对于营养与健康的要求日益增长，河鲀鱼因其味道鲜美，食材稀有，肉质细嫩。且与一般鱼类相比，河鲀肉具有低脂肪、高蛋白的特性，同时还富含钠、钾、磷、镁、钙、铁、锌、铜等矿物元素和甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸、缬氨酸等人体必需氨基酸。深受寻求新鲜感市民的追捧，其经济链也逐步形成。河鲀泛指鲀形目中4科7属57种的河鲀，其中东方鲀属(takifugu)22种，占比例最大。东方鲀鱼属隶属于鲀形目letrodontiforms、鲀科tetraodontidae、东方鲀属takifugu，俗称河鲀、气泡鱼，属于洄游性鱼类，分布于东海、黄海、渤海以及长江中下游，是一种经济价值极高的水产品。我国沿海地区较为常见的东方鲀河鲀有黄鳍东方鲀(takifuguxanthopterus)、暗纹东方鲀(takifugufasciatus)、菊黄东方鲀(takifuguflavidus)和红鳍东方鲀(takifugurubripes)等。

我国目前开放养殖，可流通市场食用的仅有红鳍东方鲀和暗纹东方鲀。

河鲀全身含毒，肝、鱼子和血液的毒性尤为强烈。因而河鲀鱼食用是否安全极其考验养殖场地和厨师厨艺技巧。不少人因为馋于肝的鲜美，食用后中毒。不仅直接食用河鲀会造成中毒，河鲀毒素还能够随着食物链在处于食物链较顶端的物种中富集，最后威胁人类健康。同时，河鲀还是一种观赏鱼类，一般称为狗头鱼或娃娃鱼。目前我国对某些有毒生物危害还没有形成成熟的检测鉴定技术、方法、试剂和标准，无法及时诊断出中毒原因、甚至出现误诊。

食品安全关系国计民生，食品物种鉴定是食品安全链的重要环节。原料来源不明或成分组成不明的食物会对食品安全带来巨大的风险与隐患。同时真假河鲀鱼肉掺杂，河鲀鱼的非法捕捞、养殖、贩卖，破坏了市场经济的正常运转。因此准确、快速的鉴定食品中的河鲀成分十分重要。

近十年来，多种分子生物学技术已应用于鱼类的快速鉴定，例如：dna条形码技术(dnabarcoding)、pcr技术、限制性片段长度多态性技术(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)、随机扩增多态性dna技术(randomamplifiedpolymorphicdna，rapd)、扩增片段长度多态性技术(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)以及基因芯片技术等，但从目前已有报道来看，现有报道只针对鲀科鱼类个别物种建立了快速检测方法，未能完全满足我国市场监管、食品安全监管的检测检验需求。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种特异性强、灵敏度高的用于东方鲀属鱼类快速鉴定的引物对，采用的技术方案是：

一种用于东方鲀属鱼类快速鉴定的引物对，所述引物对为tak_f/tak_r-1或者tak_f/tak_r-2，引物序列为：

tak_f：5’-tgagccggaatagtaggcac-3’,

tak_r-1：5’-ggtgtttggtattgtgagattgc-3’，

tak_r-2：5’-ggtgyttyggtattgtgagattgc-3’,y＝c,t。

本发明的另一目的是提供一种用于东方鲀属鱼类快速鉴定的试剂盒，包含上述的引物对，和pcr反应试剂。

优选地，所述试剂盒还包含海洋动物组织基因组dna提取试剂、阳性对照、阴性对照；

所述pcr反应试剂包含dna聚合酶和dna聚合酶缓冲液。

本发明的再一目的是提供一种用于东方鲀属鱼类快速鉴定的方法，包括如下步骤：

1)提取待测鱼样品的基因组dna；

2)采用上述的引物对或者试剂盒，对提取的基因组dna进行pcr扩增；

3)检测pcr扩增产物中是否含有目的条带，含有目的条带的样品鉴定为东方鲀属。

优选地，所述步骤2)中pcr扩增的反应体系为25μl反应体系，包括浓度为10μm的上、下游引物各1μl，2×taqpcrmastermix12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl。

优选地，所述步骤2)中pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环；72℃延伸10min。

步骤3)中所述目的条带为473bp。

优选地，所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物中是否含有目的条带。

所述的东方鲀属为暗纹东方鲀、菊黄东方鲀、红鳍东方鲀、弓斑东方鲀、双斑东方鲀或黄鳍东方鲀。

本发明的有益效果：

本发明通过对常见东方鲀属物种的线粒体基因组序列进行多序列比对，在线粒体基因组中找到了特属于东方鲀属物种的保守位点，该位点能够鉴定待测样品中是否含有毒河鲀鱼，并特异性地区分其他容易与东方鲀肉质产品混淆的皖鱼，腹刺鲀，兔头鲀等鱼类。

根据所得保守位点，建立了具有广泛适用性的东方鲀属河鲀鱼多目标快速鉴定技术体系，革新了检验检疫手段和措施，通过本发明提供的引物对、试剂盒和检测方法，能够快速准确地成功地将与东方鲀肉质产品容易混淆的皖鱼、腹刺鲀、兔头鲀等易混淆鱼类物种区分开来，检测特异性强，灵敏度能达到0.1ng/ul。为保障食品安全、减少因误食有毒河鲀鱼的中毒事件，保护我国水产业的正常发展和市场生态的和谐健康提供强有力的技术支撑。

附图说明

图1是东方鲀属物种通用引物特异性验证结果图，其中，图(a)为引物tak_f/tak_r-1扩增结果，图(b)为为引物tak_f/tak_r-2扩增结果，泳道1～10分别为ddh2o阴性对照、草鱼、暗纹东方鲀、菊黄东方鲀、红鳍东方鲀、弓斑东方鲀、双斑东方鲀、黄鳍东方鲀、棕斑腹刺鲀、棕斑兔头鲀。

图2是以暗纹东方鲀为例的东方鲀属物种通用引物灵敏度检测结果图，其中，图(a)为引物tak_f/tak_r-1扩增结果，图(b)为为引物tak_f/tak_r-2扩增结果；泳道1～7分别表示ddh2o阴性对照、0.001ng/ul、0.01ng/ul、0.1ng/ul、1ng/ul、10ng/ul、100ng/ul的基因组dna。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

主要试剂来源：

2×taqpcrmastermix：天根生化科技(北京)有限公司。

海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(dp324)：天根生化科技(北京)有限公司。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。

实施例1

一、供试东方鲀样品：

样品均置于无水乙醇中，-20℃保存备用，详见表1。

表1供试鱼类样品种类

二、东方鲀属鱼类通用引物的设计

在boldsystems数据库(www.boldsystems.org)中检索所有东方鲀属鱼类线粒体基因组序列，共计24种。

对所获得的所有东方鲀属物种的线粒体基因组序列用dnaman软件进行多序列比对，寻找东方鲀属物种的保守位点，同时该保守位点又能特异性地区分其他容易与东方鲀肉质产品混淆的皖鱼，腹刺鲀，兔头鲀等易混淆鱼类物种。在该位点人工设计引物，利用oligo软件对引物进行评估。所设计的引物如下(表2)：

表2特异性鉴定东方鲀属物种的通用引物

三、东方鲀属物种多目标快速鉴定体系的建立及验证

(1)dna提取：

首先对表1中待提取鱼样品进行预处理。用手术刀片去新鲜鱼表皮组织后，切取鱼的背部肌肉。取25mg肌肉组织，用剪刀剪碎并加液氮碾碎、研磨。利用“海洋动物组织基因组dna提取试剂盒”(dp324，天根生化科技(北京)有限公司)进行基因组dna提取，具体操作流程参照说明书，用于后续的引物验证。

(2)引物通用性和特异性验证：

以上述所提取的dna为模板，利用所设计的引物进行pcr扩增，通过不断调整pcr反应试剂用量以及退火温度、时间等，确定最终的反应体系。

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，27个循环；72℃延伸10min。

扩增反应结束后，取5μlpcr特异的扩增产物在含核酸染料goldview的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。

结果如图1所示，引物对tak_f/tak_r-1、tak_f/tak_r-2在标准的pcr反应体系和反应条件下，对东方鲀属物种发生阳性反应，产生特异性目的条带，对其余易混淆在东方鲀属的鱼类(草鱼、棕斑腹刺鲀、棕斑兔头鲀)均为阴性反应。

(3)灵敏度检测：

将提取的表1中各样品的基因组dna用te缓冲液进行系列稀释，分别得到6个梯度稀释液，6种稀释液中的基因组dna浓度为别为：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl。分别以每种稀释液为模板(水为阴性对照)，用引物对tak_f/tak_r-1、tak_f/tak_r-2分别对不同浓度的模板dna进行pcr扩增。

pcr反应体系和扩增条件同前面的pcr反应体系和扩增条件。

扩增反应结束后，取5μlpcr特异的扩增产物在含核酸染料goldview的1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在紫外灯下观察结果。结果显示两对引物可检测的模板浓度均可达到0.1ng/ul结果，部分结果如图2所示(图2是以暗纹东方鲀为例)。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>用于东方鲀属鱼类快速鉴定的引物对、试剂盒和方法

<160>3

<170>patentinversion3.5

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<211>20

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<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>y=c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

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