一种脐带组织高成活率的储运方法与流程

本发明属于细胞储运技术领域，具体涉及一种脐带组织高成活率的储运方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)，指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞。来源于发育早期的中胚层，发现其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞广泛存在于人体各个组织中，主要包括：胸腺、外周血、牙髓、羊膜、脐带血、脂肪、骨髓、脐带、胎盘等。脐带间充质干细胞具有以下优势：(1)来源丰富、采集简便，对母亲和新生儿无任何不良影响；(2)数量多，增殖能力强，可多次使用；(3)基因稳定、不易突变、使用安全可靠；(4)免疫原性低，具有免疫调节功能，使用时不引起免疫排斥反应，可抑制该反应；(5)可广泛用于多系统疾病治疗及美容保健抗衰老

细胞离开培养环境到移植入人体内需要存放于保存介质几个小时甚至更长，保存介质的选择、存放时间、存放温度都对细胞移植时的质量与治疗效果有直接影响。目前，脐带间充质干细胞的储运方法多采用传统的生理盐水的方式，即先将脐带间充质干细胞消化成单细胞后，直接用生理盐水重悬进行储运。这种传统的细胞储运方法，容易出现细胞损伤高、细胞容易成团的缺陷。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明提供一种脐带组织高成活率的储运方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种脐带组织高成活率的储运方法，包括以下操作步骤：

(1)取1ml密度为6×10⁵个/ml间充质干细胞，培养基重悬后，平均重铺至四瓶，每瓶为25ml体系，待细胞融合达90％以上时进行收获；

(2)将培养瓶中的旧培养基倒掉，用生理盐水洗涤后去除剩余培养基，每瓶加入2-4ml胰蛋白酶消化25-35s后，再加入8-12ml生理盐水清终止消化，得到细胞消化液；

(3)将细胞消化液进行离心，弃上清，洗去胰蛋白酶，得到间充质细胞；

(4)将间充质细胞重悬后重复步骤(3)操作，得到间充质细胞沉淀，然后加入细胞储运液混匀后，放入储运箱中，进行细胞运输，所述细胞储运液由以下重量份的组分制成：0.8-1.2份人血白蛋白、85-90份生理盐水、1-3份香菇多糖、0.4-0.8份黄芪甲苷、400-600单位肝素钠。

具体地，上述步骤(1)中，培养基含8-12％质量的胎牛血清、1.8-2.2mg/l的表皮生长因子、1.8-2.2mg/l的成纤维细胞生长因子、1.8-2.2mg/l的血管内皮生长因子。

具体地，上述步骤(2)和步骤(4)中，生理盐水中氯化钠的质量分数为0.85-0.90％。

具体地，上述步骤(3)和步骤(4)中，离心时的转速为800-1200r/min，离心时间为8-12min。

具体地，上述步骤(4)中，重悬所用溶液为pbs缓冲液。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种脐带组织高成活率的储运方法，操作简单，成本低廉，可有效的保证脐带间充质干细胞在储运过程中的细胞成活率。利用本发明制备的储运液，可以直接用于临床输注，满足了脐带间充质干细胞数量需求量大、应用紧急的需求，本发明提供的储运液可以解决间充质干细胞的快速运输问题，既是储运液也是注射液，可直接输注人体，在保证了干细胞质量的前提下，做到细胞的快速运输和立即使用。本发明提供的间充质干细胞的收集方法，可有效的避免间充质干细胞在储运的过程中发生成团的现象。

附图说明

附图1为实施例1和对比例1不同时间检测细胞活率。

附图2为采用实施例2方法获得的间充质细胞的cd34、cd44、cd45、cd73、cd90、cd105、hla-dr细胞表型的流式检测结果。

附图3为采用实施例3方法获得的间充质细胞的形态观察结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本发明所要求保护的技术方案。

实施例1

一种脐带组织高成活率的储运方法，包括以下操作步骤：

(1)取1ml密度为6×10⁵个/ml间充质干细胞，培养基重悬后，平均重铺至四瓶，每瓶为25ml体系，待细胞融合达90％以上时进行收获，其中培养基含8％质量的胎牛血清、1.8mg/l的表皮生长因子、1.8mg/l的成纤维细胞生长因子、1.8mg/l的血管内皮生长因子；

(2)将培养瓶中的旧培养基倒掉，用生理盐水洗涤后去除剩余培养基，每瓶加入2ml胰蛋白酶消化25s后，再加入8ml生理盐水清终止消化，得到细胞消化液；

(3)将细胞消化液进行离心，弃上清，洗去胰蛋白酶，得到间充质细胞，其中离心时，离心机的转速为800r/min，离心时间为8min；

(4)将间充质细胞采用pbs缓冲液重悬后重复步骤(3)操作，得到间充质细胞沉淀，然后加入细胞储运液混匀后，放入储运箱中，进行细胞运输，所述细胞储运液由以下重量份的组分制成：0.8份人血白蛋白、85份生理盐水、1份香菇多糖、0.4份黄芪甲苷、400单位肝素钠。

在本实施例中，生理盐水中氯化钠的质量分数为0.85％。

实施例2

一种脐带组织高成活率的储运方法，包括以下操作步骤：

(1)取1ml密度为6×10⁵个/ml间充质干细胞，培养基重悬后，平均重铺至四瓶，每瓶为25ml体系，待细胞融合达90％以上时进行收获，其中培养基含10％质量的胎牛血清、2.0mg/l的表皮生长因子、2.0mg/l的成纤维细胞生长因子、2.0mg/l的血管内皮生长因子；

(2)将培养瓶中的旧培养基倒掉，用生理盐水洗涤后去除剩余培养基，每瓶加入3ml胰蛋白酶消化30s后，再加入10ml生理盐水清终止消化，得到细胞消化液；

(3)将细胞消化液进行离心，弃上清，洗去胰蛋白酶，得到间充质细胞，其中离心时，离心机的转速为1000r/min，离心时间为10min；

(4)将间充质细胞采用pbs缓冲液重悬后重复步骤(3)操作，得到间充质细胞沉淀，然后加入细胞储运液混匀后，放入储运箱中，进行细胞运输，所述细胞储运液由以下重量份的组分制成：1.0份人血白蛋白、88份生理盐水、2份香菇多糖、0.6份黄芪甲苷、500单位肝素钠。

在本实施例中，生理盐水中氯化钠的质量分数为0.88％。

实施例3

一种脐带组织高成活率的储运方法，包括以下操作步骤：

(1)取1ml密度为6×10⁵个/ml间充质干细胞，培养基重悬后，平均重铺至四瓶，每瓶为25ml体系，待细胞融合达90％以上时进行收获，其中培养基含12％质量的胎牛血清、2.2mg/l的表皮生长因子、2.2mg/l的成纤维细胞生长因子、2.2mg/l的血管内皮生长因子；

(2)将培养瓶中的旧培养基倒掉，用生理盐水洗涤后去除剩余培养基，每瓶加入4ml胰蛋白酶消化35s后，再加入12ml生理盐水清终止消化，得到细胞消化液；

(3)将细胞消化液进行离心，弃上清，洗去胰蛋白酶，得到间充质细胞，其中离心时，离心机的转速为1200r/min，离心时间为12min；

(4)将间充质细胞采用pbs缓冲液重悬后重复步骤(3)操作，得到间充质细胞沉淀，然后加入细胞储运液混匀后，放入储运箱中，进行细胞运输，所述细胞储运液由以下重量份的组分制成：1.2份人血白蛋白、90份生理盐水、3份香菇多糖、0.8份黄芪甲苷、600单位肝素钠。

在本实施例中，生理盐水中氯化钠的质量分数为0.90％。

比较例1

步骤(4)的细胞储运液中不含有香菇多糖、黄芪甲苷、肝素钠，其余操作步骤与实施例1完全相同。

试验：

一、测试实施例1和对比例1不同时间检测细胞活率及凋亡结果

标记好分组实施例1和对比例1，4℃静置12h、18h、24h，分别取样进行台盼蓝染色、计数、凋亡试剂盒流式检测。如图1所示，台盼蓝染色计数结果显示，12h、18h后，实施例1的细胞成活率在各时间段均高于对比例1的细胞成活率。

二、脐带间充质干细胞流式细胞检测

采用实施例2的方法，静置24h后取样，离心后培养基重悬接种至t75培养瓶中，待细胞融合度达90％时收获，进行cd34、cd44、cd45、cd73、cd90、cd105、hla-dr细胞表型的流式检测，如图2所示，所有样本均很好符合间充质干细胞的标准(cd34+、cd45+、hla-dr低于2％；cd44+、cd73+、cd90+、cd105+高于95％)。

三、实施例3储运的脐带间充质干细胞重新贴壁后细胞形态观察

采用实施例3的方法，静置24h后取样，传代按照1×10⁴/cm²的密度接种后一般72小时左右即可长至90％汇合度，如图3所示，传代后成单个三角形或梭形，瓶中渐渐出现致密细胞克隆，脐带msc呈均一的梭形贴壁生长，平行状或旋涡状紧密排列。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。