本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其涉及培养基及其在海洋来源的光合细菌培养中的应用。
背景技术：
：光合细菌是一类以光作为能源，能在厌氧光照或好氧黑暗条件下进行光合作用的原核微生物的总称，遍布于土壤、泥潭沼泽、海水、淡水、污泥、植物根系等。其在水体净化、水质监控、饲料添加剂、菌肥等方面发挥着重要作用。基于光合细菌的应用优势，常需要对其进行大规模的培养，利用太阳光能进行室外培养能够节省生产成本，但室外环境容易污染，传代次数有限，并且受到自然天气的限制，长期阴天会极容易造成培养失败。应用光生物反应器能够解决上述问题，尤其是菌种的大规模培养，适宜在室内严格灭菌的环境下进行，以减少杂菌的污染，增加菌种的扩大培养成功率及传代次数；同时，光生物反应器可在阴天与晚间不间断进行补光，极大地提高培养速度与最终菌体浓度。但目前针对光合细菌的培养基的研究尚不充分，仍不能提供给光合细菌充足的营养。因此，为了实现光合细菌的高纯度、高浓度的快速扩培还需要对培养基进行进一步的研究。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供培养基及其在海洋来源的光合细菌培养中的应用，以期实现光合细菌的高纯度、高浓度的快速扩培。本发明提供的培养基包括水和：乙酸钠1.0～5.0g/l、酵母膏0.5～1.2g/l、蛋白胨0.1～0.5g/l、氯化钠3.0～8.0g/l、硫酸镁0.01～0.05g/l、磷酸二氢钾0.5～1.5g/l、磷酸氢二钾0.1～0.5g/l、柠檬酸铁0.05～0.1g/l、复合维生素0.1vol％～0.5vol％、复合微量元素0.05vol％～0.3vol％、植物提取物0.1vol％～0.5vol％。本发明中，所述复合维生素包括水和维生素b1、维生素b12、生物素、烟酸和叶酸。一些实施例中，所述复合维生素包括水和维生素b1150mg/l，维生素b120.5mg/l，生物素2mg/l，烟酸0.1mg/l，叶酸10mg/l。本发明中，所述复合微量元素包括水和fe2+、mn2+、co2+、cu2+、zn2+和bo33-。本发明实施例中，所述fe2+来自fecl2或fecl2·4h2o；所述mn2+来自mncl2或mncl2·4h2o、所述co2+来自cocl2或cocl2·6h2o、所述cu2+来自cuso4或cuso4·5h2o、所述zn2+来自znso4或znso4·7h2o，所述bo33-来自h3bo3。一些实施例中，所述复合微量元素包括水和fecl2·4h2o1500mg/l，mncl2·4h2o50mg/l，cocl2·6h2o200mg/l，cuso4·5h2o5mg/l，znso4·7h2o50mg/l，h3bo3100mg/l。本发明中，所述植物提取物选自芒果叶提取物、金银花提取物中至少一种。一些实施例中，所述植物提取物为芒果叶和金银花的乙醇提取物。一些具体实施例中，所述植物提取物的制备方法包括：将芒果叶和金银花粉碎，每g粉末加入10l～20l质量浓度75％～80％的乙醇溶液，以转速5000～8000r/min离心20～30min，取上清，减压浓缩至体积减少70％～80％，获得植物提取物。所述芒果叶和金银花的质量比为1：1。一些实施例中，所述培养基由水和：乙酸钠1.0g/l、氯化钠3.0g/l、酵母膏0.5g/l、蛋白胨0.5g/l、硫酸镁0.01g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.1g/l、柠檬酸铁0.05g/l、复合维生素5ml/l、复合微量元素3ml/l、植物提取物5ml/l组成。一些实施例中，所述培养基由水和：乙酸钠2.0g/l、氯化钠4.0g/l、酵母膏0.7g/l、蛋白胨0.4g/l、硫酸镁0.02g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、柠檬酸铁0.07g/l、复合维生素4ml/l、复合微量元素2ml/l、植物提取物4ml/l组成。一些实施例中，所述培养基由水和：乙酸钠3.0g/l、氯化钠5.0g/l、酵母膏0.9g/l、蛋白胨0.3g/l、硫酸镁0.03g/l、磷酸二氢钾1.2g/l、磷酸氢二钾0.4g/l、柠檬酸铁0.08g/l、复合维生素3ml/l、复合微量元素1ml/l、植物提取物3ml/l组成。一些实施例中，所述培养基由水和：乙酸钠4.0g/l、氯化钠7.0g/l、酵母膏1.0g/l、蛋白胨0.2g/l、硫酸镁0.04g/l、磷酸二氢钾1.4g/l、磷酸氢二钾0.4g/l、柠檬酸铁0.09g/l、复合维生素2ml/l、复合微量元素1ml/l、植物提取物2ml/l组成。一些实施例中，所述培养基由水和：乙酸钠5.0g/l、氯化钠8.0g/l、酵母膏1.2g/l、蛋白胨0.1g/l、硫酸镁0.05g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、柠檬酸铁0.1g/l、复合维生素1ml/l、复合微量元素0.5ml/l、植物提取物1ml/l组成。本发明所述培养基的制备方法，包括：将水灭菌后，与乙酸钠、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、柠檬酸铁、复合维生素、复合微量元素和植物提取物混合，制得所述培养基；或将乙酸钠、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、柠檬酸铁、复合维生素、复合微量元素、植物提取物与水混合后，经灭菌制得所述培养基。本发明所述的培养基在培养光合细菌中的应用。所述光合细菌选自沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌或深红红螺菌中至少一种。本发明还提供了一种光合细菌的培养方法，其为将菌种接种于本发明所述培养基进行培养。该培养方法适合培养的光合细菌选自沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌或深红红螺菌中至少一种。在培养方法中，所述接种的接种量为25vol％～40vol％；一些实施例中，所述接种的接种量为35％。所述接种是指将经活化的光合细菌菌种加入新鲜培养基的步骤。所述培养在光生物反应器中进行。本发明提供的培养基中包括水和：乙酸钠、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、柠檬酸铁、复合维生素、复合微量元素、植物提取物。培养基中碳源、氮源、微量元素、维生素与杂菌抑制剂选择合理，营养全面，且配比得当。可保证光合细菌的在光生物反应器中不间断快速生长的需求，培养周期缩短，且浓度远高于传统培养模式。并且，本发明发现，培养基中加入芒果叶和金银花提取物后，这些中草药不仅具有抑制光合细菌中杂菌生长的作用，且能为光合细菌提供营养物，有效促进光合细菌的快速生长。具体实施方式本发明提供了培养基及其在海洋来源的光合细菌培养中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、制备杂菌抑制液：芒果叶和金银花，质量比为1:1混合，粉碎，过800～100目筛，取粉末，按料液比(1:10～20)g/l加入质量浓度75％～80％的乙醇水溶液，然后以转速5000～8000r/min离心20～30min，取上清，减压浓缩至体积减少70％～80％，得芒果叶和金银花混合提取物，作为杂菌抑制液。2、水灭菌：取自来水煮沸，冷却至35℃以下备用；或自来水经过1μm和0.22μm两级微孔过滤；或制备蒸馏水、超纯水。3、制备复合维生素溶液：维生素b1150mg，维生素b120.5mg，生物素2mg，烟酸0.1mg，叶酸10mg，定容1l。4、制备复合微量元素溶液：fecl2·4h2o1500mg，mncl2·4h2o50mg，cocl2·6h2o200mg，cuso4·5h2o5mg，znso4·7h2o50mg，h3bo3100mg，定容1l。5、配制培养基：取乙酸钠1.0g、氯化钠3.0g、酵母膏0.5g、蛋白胨0.5g、硫酸镁0.01g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.1g、柠檬酸铁0.05g、复合维生素5ml、复合微量元素3ml、杂菌抑制液5ml，补充步骤2灭菌后的水至1l。实施例21、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：同实施例1。2、配制培养基：乙酸钠2.0g、氯化钠4.0g、酵母膏0.7g、蛋白胨0.4g、硫酸镁0.02g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸氢二钾0.3g、柠檬酸铁0.07g、复合维生素4ml、复合微量元素2ml、杂菌抑制液4ml，补充水(可以经灭菌也可以是自来水)至1l然后进行高压灭菌。实施例31、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：同实施例1。2、水灭菌：同实施例1。3、配制培养基：乙酸钠3.0g、氯化钠5.0g、酵母膏0.9g、蛋白胨0.3g、硫酸镁0.03g、磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钾0.4g、柠檬酸铁0.08g、复合维生素3ml、复合微量元素1ml、杂菌抑制液3ml，补充步骤2灭菌后的水至1l。实施例41、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：同实施例1。2、配制培养基：乙酸钠4.0g、氯化钠7.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨0.2g、硫酸镁0.04g、磷酸二氢钾1.4g、磷酸氢二钾0.4g、柠檬酸铁0.09g、复合维生素2ml、复合微量元素1ml、杂菌抑制液2ml，补充水(可以经灭菌也可以是自来水)至1l然后进行高压灭菌。实施例51、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：同实施例1。2、水灭菌：同实施例1。3、配制培养基：乙酸钠5.0g、氯化钠8.0g、酵母膏1.2g、蛋白胨0.1g、硫酸镁0.05g、磷酸二氢钾1.5g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸铁0.1g、复合维生素1ml、复合微量元素0.5ml、杂菌抑制液1ml，补充步骤2灭菌后的水至1l。对比例11、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：同实施例1。2、水灭菌：同实施例1。3、配制培养基：乙酸钠5.0g、氯化钠8.0g、酵母膏1.2g、蛋白胨0.1g、硫酸镁0.05g、磷酸二氢钾1.5g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸铁0.1g、复合微量元素0.5ml、杂菌抑制液1ml，补充步骤2灭菌后的水至1l。对比例21、制备杂菌抑制液、复合维生素溶液、复合微量元素溶液：2、水灭菌：同实施例1。3、配制培养基：乙酸钠5.0g、氯化钠8.0g、酵母膏1.2g、蛋白胨0.1g、硫酸镁0.05g、磷酸二氢钾1.5g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸铁0.1g、复合维生素1ml、复合微量元素0.5ml，补充步骤1灭菌后的水至1l。对比例3nh4cl0.5g、nacl5.0g、乙酸钠1.0g、酵母膏1.0g、cacl20.2g、mgso4·7h2o0.2g、kh2po40.2g、k2hpo40.2g、加冷开水至1l，调节ph至7.4。对比例4nh4cl0.5g、乙酸钠1.0g、mgso4·7h2o0.2g、kh2po40.3g、k2hpo40.3g、酵母膏0.5g、蛋白胨0.5g、复合维生素储备液1ml、微量元素储备液20ml、加冷开水至1l，调节ph至7.4。复合维生素储备液：维生素b10.1g，尼克酸0.1g，生物素1.5mg，加冷开水至100ml。微量元素储备液：七水硝酸铜0.004g，七水硫酸锌0.024g，二水钼酸钠0.075g，加冷开水至100ml。试验例1：将上述实施例和对比例的培养基进行光合细菌培养效果的比较。应用100l光生物反应装置开展培养试验。按比例配制上述培养基，加入光生物反应装置中，分别接种35％已活化的光合细菌菌种，培养体积为100l，每种细菌培养基试验三次。试验所用的光合细菌菌种为发明人从海南对虾养殖池塘中筛选得到的一株沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)。接种后于室内开启节能灯、不间断流动的条件下进行培养，于刚接种以及培养的第一天、第二天、第三天和第四天分别取样，用分光光度计测定660nm下的吸光值(od660)，用于反映菌体的生物量。结果见表1。表1不同培养基对光合细菌(沼泽红假单胞菌)生长速度的影响将沼泽红假单胞菌替换为荚膜红假单胞菌(rhodopseudomonascapsulata)后，测试结果相似。选择深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)进行测试，试验方法同上。结果见表2。表2不同培养基对光合细菌(深红红螺菌)生长速度的影响培养天数初始od660第一天od660第二天d660第三天od660第四天od660实施例10.746±0.0301.040±0.040ab1.358±0.042a1.607±0.075a1.801±0.059a实施例20.742±0.0191.056±0.018a1.377±0.014a1.624±0.022a1.823±0.016a实施例30.749±0.0471.053±0.048ab1.407±0.027a1.662±0.043a1.851±0.042a实施例40.736±0.0281.030±0.028ab1.388±0.017a1.670±0.017a1.874±0.018a实施例50.755±0.0371.061±0.039a1.398±0.023a1.679±0.0251.878±0.031a对比例10.738±0.0310.935±0.037c1.226±0.033b1.386±0.022b1.440±0.013b对比例20.757±0.0180.963±0.020bc1.183±0.034b1.245±0.028c1.304±0.033c对比例30.740±0.0280.899±0.021c1.089±0.036c1.152±0.043c1.246±0.032c对比例40.759±0.0240.911±0.022c1.224±0.022b1.378±0.025b1.459±0.033b表1、2结果显示，实施例1-5的光合细菌生长速度明显高于对比例1-4，对比例1-4在第三天时，已进入稳定期，到第四天已增长缓慢；实施例1-5到第四天时，仍持续高增长。本发明的培养基根据光合细菌在连续人工光照培养下的生理特征与营养需求而设计，能够满足其大量连续增殖的营养需求，使稳定期延后，菌液浓度可达到更高水平。实施例1-5培养基所培养的光合细菌进行杂菌率测定，杂菌率均少于0.5％。由于实施例1-5的培养基中加入金银花与芒果叶混合提取物，光合细菌生长速度明显优于对比例2，可在短期内培养大量光合细菌；金银花与芒果叶混合提取物除了抑制杂菌生长带来的负面影响外，还为光合细菌的生长提供营养物质。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12