一株解淀粉芽孢杆菌HM9902的固体发酵方法与流程

一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法
技术领域
[0001]
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体的说是涉及一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法。


背景技术：

[0002]
解淀粉芽孢杆菌hm9902是本研究所从保定市定兴县麻山药根际土壤中分离取得，经生理生化和16s rrna基因序列同源性分析对该菌进行分类鉴定为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。该菌株已于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0003]
前期研究发现其对炭疽杆菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等多种病菌有较强的的抑制作用，在田间防治麻山药根腐病，防治效果达89.6％以上，同时有很好的肥效。本研究所又进一步研究了该菌株的液体深层发酵工艺，目前10吨发酵罐的发酵水平在80亿/ml以上。实验室采用离心、两级树脂分离纯化得到一种抗菌效果好的抗菌蛋白，分子量为26kd。
[0004]
本发明专利在前期工作的基础上为提高菌株的抑菌性能进行深入研究，提供一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007]
一株解淀粉芽孢杆菌hm9902，保藏编号为cgmcc no.12821，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年08月08日，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens。
[0008]
一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法，具体步骤如下：
[0009]
(1)解淀粉芽孢杆菌hm9902菌株活化；
[0010]
(2)液体种子制作
[0011]
①
将步骤(1)活化后的菌株用无菌水冲洗孢子，制成浓度为0.5-1.5
×
108个/ml的孢子悬液；
[0012]
②
用步骤
①
制成的孢子悬液接种到摇瓶液体培养基中，接种量为每100ml液体培养基中接种1ml孢子悬液；
[0013]
③
接种好的摇瓶置于30-34℃，180-220r/min的摇床培养，10-18h后摇床震动停止，静置8-12h，待发酵液上层结厚厚的一层膜时摇床震动5-15min，再静置8-12h，得到液体种子，取下摇床备用；
[0014]
(3)固体发酵
[0015]
a、向步骤(2)制作的液体种子加入灭菌玻璃珠，振荡打散；
[0016]
b、按5-10ml/瓶的量接种装有100g无菌固体培养基的1l罐头瓶；
[0017]
c、接种后用透气封口膜封口，置于30-32℃，湿度40-60％的培养箱培养70-84h，每12h翻动物料1次；
[0018]
d、待物料粘稠，周边有白色膜状物时停止发酵；平板计数。
[0019]
进一步，步骤(1)所述菌株活化：将斜面保藏的克氏瓶菌株接种前在室温活化2-4h。
[0020]
进一步，步骤
②
所述液体培养基为：豆饼粉1-4％，可溶性淀粉1-2％，玉米浆干粉0.2-1％，葡萄糖0.1-0.5％，硫酸锰0.05-0.1％，氯化钠0.05-0.1％，余量为水。
[0021]
进一步，步骤b所述固体培养基的制备方法如下：将麸皮与水按1:0.6-0.8混匀，在此基础上再加入0.2-0.4％的可溶性淀粉，0.1-0.3％的蛋白胨，0.05-0.1％的磷酸氢二钾，0.01-0.05％的硫酸镁，混合均匀；装罐头瓶，每瓶100g；121℃灭菌20min。
[0022]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法，采用合适的培养基和培养条件，固体发酵有效活菌数可达222亿/g以上，是此前液体发酵水平的2.775倍；其1倍水浸提液对炭疽病菌的抑菌带宽度达9.2mm以上，比液体发酵产物的抑菌带宽度6.2mm提高了48.4％。
附图说明
[0023]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0024]
图1附图为本发明抑菌带宽度；
[0025]
其中，a为炭疽病菌正常生长对照；b为液体发酵抑菌；c为实施例1固体发酵抑菌。
具体实施方式
[0026]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
实施例1
[0028]
一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法，具体步骤如下：
[0029]
(1)解淀粉芽孢杆菌hm9902菌株活化：
[0030]
将斜面保藏的克氏瓶菌株接种前在室温活化3h；
[0031]
(2)液体种子制作
[0032]
①
将步骤(1)活化后的菌株用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1
×
108个/ml的孢子悬液；
[0033]
②
用步骤
①
制成的孢子悬液接种到摇瓶液体培养基中，接种量为每100ml液体培养基中接种1ml孢子悬液；
[0034]
液体培养基为：豆饼粉2％，可溶性淀粉1.5％，玉米浆干粉0.6％，葡萄糖0.3％，硫酸锰0.08％，氯化钠0.08％，余量为水。
[0035]
③
接种好的摇瓶置于32℃，200r/min的摇床培养，15h后摇床震动停止，静置10h，待发酵液上层结厚厚的一层膜时摇床震动10min，再静置10h，得到液体种子，取下摇床备用；
[0036]
(3)固体发酵
[0037]
a、向步骤(2)制作的液体种子加入几粒灭菌玻璃珠，振荡打散；
[0038]
b、按8ml/瓶的量接种装有100g无菌固体培养基的1l罐头瓶；
[0039]
固体培养基的制备方法如下：将麸皮与水按1:0.7混匀，在此基础上再加入0.3％的可溶性淀粉，0.3％的蛋白胨，0.08％的磷酸氢二钾，0.03％的硫酸镁，混合均匀；装罐头瓶，每瓶100g；121℃灭菌20min。
[0040]
c、接种后用透气封口膜封口，置于30-32℃，湿度40-60％的培养箱培养72h，每12h翻动物料1次；
[0041]
d、待物料粘稠，周边有白色膜状物时停止发酵；平板计数。
[0042]
实施例2
[0043]
一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法，具体步骤如下：
[0044]
(1)解淀粉芽孢杆菌hm9902菌株活化：
[0045]
将斜面保藏的克氏瓶菌株接种前在室温活化4h；
[0046]
(2)液体种子制作
[0047]
①
将步骤(1)活化后的菌株用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1.5
×
108个/ml的孢子悬液；
[0048]
②
用步骤
①
制成的孢子悬液接种到摇瓶液体培养基中，接种量为每100ml液体培养基中接种1ml孢子悬液；
[0049]
液体培养基为：豆饼粉4％，可溶性淀粉1％，玉米浆干粉0.2％，葡萄糖0.5％，硫酸锰0.1％，氯化钠0.1％，余量为水。
[0050]
③
接种好的摇瓶置于34℃，220r/min的摇床培养，18h后摇床震动停止，静置8h，待发酵液上层结厚厚的一层膜时摇床震动5min，再静置8h，得到液体种子，取下摇床备用；
[0051]
(3)固体发酵
[0052]
a、向步骤(2)制作的液体种子加入灭菌玻璃珠，振荡打散；
[0053]
b、按10ml/瓶的量接种装有100g无菌固体培养基的1l罐头瓶；
[0054]
固体培养基的制备方法如下：将麸皮与水按1:0.8混匀，在此基础上再加入0.4％的可溶性淀粉，0.3％的蛋白胨，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸镁，混合均匀；装罐头瓶，每瓶100g；121℃灭菌20min。
[0055]
c、接种后用透气封口膜封口，置于30-32℃，湿度40-60％的培养箱培养84h，每12h翻动物料1次；
[0056]
d、待物料粘稠，周边有白色膜状物时停止发酵；平板计数。
[0057]
实施例3
[0058]
一株解淀粉芽孢杆菌hm9902的固体发酵方法，具体步骤如下：
[0059]
(1)解淀粉芽孢杆菌hm9902菌株活化：
[0060]
将斜面保藏的克氏瓶菌株接种前在室温活化2h；
[0061]
(2)液体种子制作
[0062]
①
将步骤(1)活化后的菌株用无菌水冲洗孢子，制成浓度为0.5
×
108个/ml的孢子悬液；
[0063]
②
用步骤
①
制成的孢子悬液接种到摇瓶液体培养基中，接种量为每100ml液体培养基中接种1ml孢子悬液；
[0064]
液体培养基为：豆饼粉1％，可溶性淀粉2％，玉米浆干粉1％，葡萄糖0.1％，硫酸锰0.05％，氯化钠0.05％，余量为水。
[0065]
③
接种好的摇瓶置于30℃，180r/min的摇床培养，10h后摇床震动停止，静置12h，待发酵液上层结厚厚的一层膜时摇床震动15min，再静置12h，得到液体种子，取下摇床备用；
[0066]
(3)固体发酵
[0067]
a、向步骤(2)制作的液体种子加入灭菌玻璃珠，振荡打散；
[0068]
b、按5ml/瓶的量接种装有100g无菌固体培养基的1l罐头瓶；
[0069]
固体培养基的制备方法如下：将麸皮与水按1:0.6混匀，在此基础上再加入0.2％的可溶性淀粉，0.1％的蛋白胨，0.05％的磷酸氢二钾，0.01％的硫酸镁，混合均匀；装罐头瓶，每瓶100g；121℃灭菌20min。
[0070]
c、接种后用透气封口膜封口，置于30-32℃，湿度40-60％的培养箱培养70h，每12h翻动物料1次；
[0071]
d、待物料粘稠，周边有白色膜状物时停止发酵；平板计数。
[0072]
试验例1有效活菌数
[0073]
按照农用微生物国家标准gb20287-2006规定的有效活菌数计数方法，计数实施例1-3的发酵物料有效活菌数分别为232亿/g、222亿/g、228亿/g。
[0074]
试验例2抑菌性能
[0075]
采用滤纸片法检测测定抑菌带宽度。具体做法为：先培养病原菌株，待病原菌菌丝萌发后，取其边缘生长旺盛的菌丝打约直径5mm的菌饼，接入新鲜pda培养基平皿，放入30℃培养箱培养，待菌苔生长到约直径10mm左右时，将直径为5mm的滤纸片平放在菌苔四周，贴实培养基，吸取10μl上清液滴在滤纸片上。置于30℃培养箱培养。培养结束测量滤纸片边缘到病原菌菌苔边缘的距离即抑菌带的宽度以考察其抑菌能力的大小。
[0076]
固体发酵：分别称取实施例1-3制备的10g发酵物料，加入10ml无菌水浸提30分钟，10000r/min离心20min，取上清液(1倍水浸提液)进行抑制炭疽病菌试验。实施例1的结果见图1c。实施例1-3的抑菌带宽度分别可达9.8mm、9.2mm、9.3mm。
[0077]
对比例液体发酵
[0078]
本发明所述液体发酵是专利号为201610952727.9，专利名称为解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用的发明专利中公布的液体微生物菌剂制备方法，所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为80亿/ml。采用本发明方法测定其抑菌带宽度为6.2mm(图1b)。
[0079]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
致的最宽的范围。