本发明涉及分子生物学
技术领域：
：，具体涉及一种用于百合mirna检测的内参基因及其应用。
背景技术：
：：百合是一种兼具食用、药用及观赏价值的重要的球根花卉，具有十分重要的经济价值。为了改良百合植株性状，需要利用现代分子生物学手段对其重要的生理过程，包括开花，抗病和无性繁殖的调控机制等进行研究，这其中必然会涉及对百合基因表达丰度的检测。随着植物生物遗传研究的精细化，关于mirna在百合各种生理过程中的功能研究也越来越多。mirna(microrna)是一类长度约为21nt的内源非编码rna，已被证实在植物生理过程中发挥着重要的调控作用。qrt-pcr(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)是研究基因表达模式，比较基因表达丰度的最常用的生物手段之一，具有灵敏度高、易操作、特异性好、信息丰富的特点。而在众多影响该实验结果准确度的因素中，用来标准化实验结果的内参基因的选择是保证实验结果准确的前提和关键。作为内部控制，理想的内参基因应在实验条件下保证较高的、稳定的表达量，即易于检测且表达恒定。但在不同条件下中，表达绝对稳定不变的内参基因是不存在的。同时由于mirna的qrt-pcr扩增产物较短且部分mirna在不同条件下表达量差异较大，较mrna的qrt-pcr，mirna检测难度更大。因此，在mirna的qrt-pcr实验中，选择稳定的内参基因，对结果的准确度保证更为重要。目前，在植物中，使用较多的传统的内参基因包括snrnau6、rrna5s、5.8s、18s和gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等，这些基因广泛参与基本的细胞过程，并在所有细胞中比较均匀地表达。但这些传统内参基因在一些实验条件下，表达量并不恒定不变(thellino,zorziw,lakayeb,bormanbd,coumansb,henneng,grisart,igouta,heinene.housekeepinggenesasinternalstandards:useandlimits.jbiotechnol.1999；75(2):291-295；jainmk,nijhawana,tyagiak,khuranajp.validationofhousekeepinggenesasinternalcontrolforstudyinggeneexpressioninricebyquantitativereal-timepcr.biochembiophresco.2006；345(2):646-651.)。此外，百合基因组巨大，生理调控过程复杂，但目前尚未见在百合中系统评价适用于mirnaqrt-pcr的候选内参基因在不同实验条件下稳定性的报道。因此，在以mirna为检测对象的qrt-pcr检测之前，为保证检测结果的准确性，筛选出适合于尽可能多的实验条件，特别是涉及不同生长发育的样本的内参基因，是十分必要的。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于百合mirna检测的内参基因，本发明还提供该内参基因的应用。为获得在不同条件下稳定表达的用于百合mirna检测的内参基因，本发明首先构建了百合smallrna文库，在该smallrna文库中，首先，采用归一化方法确定mirna的表达谱，同时，进行差异表达基因的筛选。选择在不同条件下的文库中表达量高，表达没有显著差异(p-value>0.05)的mirna作为候选内参基因，参与稳定性评价。经上述筛选获得了5个在不同条件下表达量较高且较稳定的mirna，并将其作为候选内参基因，进一步以百合杂交品种新铁炮百合和野生种岷江百合为实验材料对候选内参基因进行筛选。新铁炮百合(lilium×formolongi)和岷江百合(l.regale)是性状优良、应用广泛的两种百合，二者分别是生长发育和抗病性研究的优良材料。新铁炮百合姿态优美，花色洁白，尤其不同于大部分百合的实生苗需要两到三年才可开花，新铁炮百合在一年中不需要春化处理即可开花，具有少有的较短营养生长，开花迅速的特性。而野生种岷江百合，实生苗开花时间为2-3年，但其抗病性尤其是对真菌病原体的抵抗力较强。在这两种百合中利用不同的方法对候选内参基因在不同实验条件(包括不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫)下的表达稳定性进行系统的评价，最终获得能够适用于尽可能多实验条件的优良的内参基因mirn46(成熟体的序列如seqidno.1所示，前体序列如seqidno.2所示)和mir399a(成熟体的序列如seqidno.3所示，前体序列如seqidno.4所示)，这两个mirna作为内参基因的检测性能明显优于传统内参基因(5s，5.8s，u6等)。具体地，本发明提供以下技术方案：第一方面，本发明提供一种用于百合mirna检测的内参基因，其具有如seqidno.1-4任一所示的核苷酸序列。本发明提供的内参基因为mirna，具体为mirn46和mir399a，其中，mirn46的成熟体的核苷酸序列如seqidno.1所示，前体序列如seqidno.2所示，mir399a的成熟体的核苷酸序列如seqidno.3所示，前体序列如seqidno.4所示。上述内参基因为用于百合mirna相对水平检测的内参基因。mirn46和mir399a在百合不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫条件下均能够稳定表达，适于作为不同实验条件下的百合mirna水平检测的内参基因。其中，mirn46适于作为新铁炮百合的mirna相对水平检测的内参基因，而mir399a则更适于作为岷江百合的mirna相对水平检测的内参基因。第二方面，本发明提供含有所述内参基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。第三方面，本发明提供用于扩增所述内参基因的引物，所述引物的核苷酸序列如seqidno.5-6所示或如seqidno.6-7所示。对于内参基因mirn46，其扩增引物如seqidno.5-6所示。对于内参基因mir399a，其扩增引物如seqidno.6-7所示。上述引物用于扩增mirn46和mir399a具有较高的特异性和灵敏度。第四方面，本发明提供含有如seqidno.5-6所示或如seqidno.6-7所示引物的试剂盒。该试剂盒可用于百合mirna相对水平的检测。可选的，所述试剂盒还含有选自pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntp、mgcl2、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。第五方面，本发明提供所述内参基因或含有所述内参基因的生物材料或所述内参基因的扩增引物或含有所述引物的试剂盒在检测百合mirna相对水平中的应用。优选地，本发明提供序列如seqidno.1或2所示的内参基因在新铁炮百合mirna相对水平检测中的应用。本发明还提供序列如seqidno.3或4所示的内参基因在岷江百合mirna相对水平检测中的应用。第六方面，本发明提供所述内参基因或含有所述内参基因的生物材料或所述内参基因的扩增引物或含有所述引物的试剂盒在百合mirna定量或半定量pcr检测中的应用。第七方面，本发明提供所述内参基因或含有所述内参基因的生物材料或所述内参基因的扩增引物或含有所述引物的试剂盒在检测百合mirna在不同组织、不同生长发育时期或不同胁迫条件下相对水平变化分析中的应用。第八方面，本发明提供一种检测百合mirna相对水平的方法，其以所述内参基因作为内参基因，采用定量或半定量pcr检测百合mirna的相对水平。具体地，所述方法包括：以所述内参基因作为内参基因，将待测百合mirna与所述内参基因同时进行qrt-pcr，根据内参基因的水平对待测mirna的水平进行相对定量。本发明的有益效果在于：本发明提供的内参基因mirn46和mir399a在百合不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫条件下均能够稳定表达，适于作为不同实验条件下的百合mirna相对水平检测的内参基因。与传统的内参基因(5s，5.8s，u6等)相比，mirn46和mir399a作为内参基因具有更高的稳定性，能够显著提高百合mirna相对水平检测的准确性，对于百合mirna表达和功能分析具有重要意义。附图说明图1为本发明实施例1中作为候选内参基因的百合新mirna的前体二级结构预测，其中，黑色区域为成熟mirna序列。图2为本发明实施例2中8个内参基因的扩增引物的特异性分析结果，其中，m：dl500dnamarker；1-8：5.8s，5s，u6，mir399a，mir2916，mir5083，mirn43，mirn46。图3为本发明实施例3中在新铁炮百合和岷江百合中不同条件下候选内参基因的cq值箱型图，箱型中部指示线为中位数，箱顶(底)为上(下)四分位数，+为平均值。图4为本发明实施例3中rankaggreg对各实验条件下两种百合的内参基因稳定性进行最终排序。图5为本发明实施例4中mir156a在两种百合生长过程中，以不同基因作为内参时的表达模式分析；s1，2-3片莲座叶时期；s2，5-6片莲座叶时期；s3，9-10个节间期；s4，可见花蕾期；a，不同内参基因下，新铁炮百合不同生长发育过程中mir156a的相对水平；b，不同内参基因下，岷江百合不同生长发育过程中mir156a的相对水平。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1候选内参基因的获得在新铁炮百合smallrna文库中，首先，采用归一化方法确定mirna的表达谱，同时，以p-value≤0.05为阈值进行差异表达基因的筛选。根据mirna在不同生长发育时期的表达模式及表达量，选择在不同条件下的文库中表达量高，表达没有显著差异(p-value>0.05)的mirna作为候选内参基因，参与稳定性评价。符合条件的新mirna则需满足mirna的一般判定条件：其前体的二级结构需符合已报道的mirna注释的基本原则(jeyaraja,zhangx,houy,shangguanm,gajjeramanp,liy,weic.genome-wideidentificationofconservedandnovelmicrornasinonebudandtwotenderleavesofteaplant(camelliasinensis)bysmallrnasequencing,microarray-basedhybridizationandgenomesurveyscaffoldsequences.bmcplantbiol.2017；17(1):212-212；jones-rhoadesmw,barteldp,bartelb.micrornasandtheirregulatoryrolesinplants.annurevplantbiol.2006；57:19-53.)。这些新mirna前体的二级结构则通过rnafold在线软件http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnafold.cgi进行预测。经筛选共获得5个在不同条件下表达量较高且较稳定的mirna作为候选内参基因，其中包括3个保守mirna(mir399a，mir2916，mir5083)和2个新的mirna(mirn46，mirn43)。而2个新mirna的前体的二级结构均满足形成mirna的条件(图1)。mirn46和mirn43前体的长度分别为101和109nt，热力学自由能分别为-38.75和-58.40kcal/mol，mfei分别为1.1和1.0，均满足mirna注释的基本原则。上述5个mirna的序列信息如表1所示，将这5个mirna作为候选内参基因用于后续稳定性评价。根据现有技术研究结果和预实验筛选结果，选择三个传统内参基因5s，5.8s和u6作为对照，与候选内参基因一起参与稳定性评价。表1作为候选内参基因的mirna的序列信息实施例2候选内参基因的引物设计及引物特异性扩增检验根据文库中所识别的mir399a、mir2916、mir5083、mirn46、mirn43的成熟序列进行引物设计。各mirna和对照内参基因的引物序列如表2所示。表2候选内参基因和对照内参基因的引物序列及相关信息在定量pcr检测开展之前，利用常规pcr技术，针对目标候选内参基因对引物特异性扩增效果进行检测。对表2中的引物利用pcr进行特异性扩增，反应体系(20μl)如表3所示，反应程序包括：预变性95℃5min；变性95℃45s，退火62℃1min，延伸72℃2min30s，33个循环；最后72℃2min。利用琼脂糖凝胶(3％)电泳验证特异性扩增效果，结果如图2所示，可看到各扩增产物的单个条带，且其长度与预期一致，因此这些候选内参基因的引物可用作后续qrt-pcr实验分析。表3候选内参基因引物特异性扩增反应体系实施例3候选内参基因的稳定性评价为了评价候选内参基因在不同的实验条件中表达的稳定性，以百合杂交种“新铁炮百合”(l.×formolongi)(‘雷山2号’)、野生种岷江百合(l.regale)为研究对象，设置以下不同实验条件：(1)不同生长发育时期百合杂交种“新铁炮百合”(l.×formolongi)(‘雷山2号’)、野生种岷江百合(l.regale)，经过大约1个月沙藏(4℃)后播种于穴盘，于温室自然条件下生长。分别在两种百合实生苗的不同生长发育阶段，包括莲座叶时期，抽葶时期和可见花蕾(花蕾大约为1cm左右)时期，挑选3株健壮，长势一致的植株，采集植株中部叶片。所有样品立即液氮冷冻后于-80℃保存。(2)不同器官组织分别收集两种百合成年期植株中3株长势相同，健壮的同一植株的不同新鲜组织，包括叶片、茎中部、种球中部鳞片、根及幼嫩种子。同样液氮冷冻后低温保存。(3)非生物胁迫：高温处理为了分析内参基因在两种百合受到非生物胁迫的情况下的稳定性，播种于穴盘的百合幼苗(播种后10周)移栽至温室，置于长日照高温条件下(16h光照(32℃)/8hdark(16℃)，湿度为70％)生长。收集两种百合分别在热处理0周、12周和22周后的新鲜叶片。(4)生物胁迫：灰霉菌(botrytiselliptica)处理分别采集新铁炮百合和岷江百合花蕾期(花蕾约1cm)的位于植株茎秆中部的成熟叶片。用蒸馏水洗净处理后，将两个直径5mm的新鲜菌丝块置于叶片中部并避开主叶脉。将正在处理的叶片放置在装有90％-100％湿度的保鲜膜的托盘中。在接种后0、6、12及24hpi(接种后的时间，小时)后收集叶片，用来后续mirna的提取作材料准备。候选内参基因在不同的实验条件中表达的稳定性的评价方法具体如下：1、mirna的提取和cdna的合成(1)mirna提取各样本mirna使用mircutemirna提取分离试剂盒(tiangenbio，beijing，china)按照试剂盒说明书进行mirna的提取。(2)polya加尾利用聚合酶e.colipoly(a)polymerasekit(invitrogen，usa)试剂盒对所提取mirna进行polya加尾，反应体系如表4。37℃恒温反应1h，产物-80℃保存。表4mirnapoly(a)加尾反应体系(3)cdna合成随后利用quantscriptrtkit(tiangenbio，beijing，china)进行反转录，反应体系如表5，oligodt引物序列为gcgagcacagaattaatacgactcactatagg(t)12vn，得到cdna稀释后作为模板用于后续qrt-pcr实验。表5cdna第一链合成反应体系2、qrt-pcr分析qrt-pcr液体体系则使用thunderbrirdsybrqpcrmixwithoutrox(toyobo,shanghai,china)系统，于bio-radcfx96(cfx96touch，bio-rad，usa)实时荧光定量pcr仪上操作，并自动读取数据。20μl液体反应体系同表3，其中目的基因、上下游引物及模板均稀释10倍，终浓度为10umol/l。反应程序包括：预变性95℃、30s；变性95℃、10min，退火温度为50-59.4℃(具体参考表2)15s，延伸72℃、15s，38个循环。每个样品均包含三个技术重复。3、候选内参基因在不同百合中的cq值通过qrt-pcr实验，获得了所选定的5个候选内参基因和3个对照内参基因在不同实验条件下，新铁炮百合(l.×formolongi)和岷江百合(l.regale)中的cq值。cq值与表达水平呈反比，cq值越高，代表其表达水平较低。如图3所示，每个内参基因在不同百合中cq值离散程度不同，与新铁炮百合相比，岷江百合中内参基因cq值的离散程度较大。而所有样本中，各内参基因在两种百合的cq均值有差异，最低值为岷江中5s(18.60)，最高值为新铁炮百合中的mir399a，其cq值平均值为38.60。在新铁炮中，mir399a的cq值最高，表达水平最低，为38.60，5.8s的cq值最低(16.90)，表达水平最高。然而在岷江百合中，u6的cq值最高(37.30)，cq值最低的为5s(11.87)。4、候选内参基因稳定性评价候选内参基因的稳定性通过三个基于excel软件的计算程序genorm、normfinder和bestkeeper(vandesompelej,depk,pattynf,poppeb,vanrn,depa,spelemanf.accuratenormalizationofreal-timequantitativert-pcrdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.genomebiol.2002；3:research0034；pfafflmw,tichopada,prgometc,neuvianstp.determinationofstablehousekeepinggenes,differentiallyregulatedtargetgenesandsampleintegrity:bestkeeper-excel-basedtoolusingpair-wisecorrelations.biotechnollett.2004；26(6):509-515；andersoncl,jensenjl,orntofttf.normalizaionofreal-timequantitativereversetranscription-pcrdata:amodel-basedvarianceestimationapproachtoidentifygenessuitedfornormalization,appliedtobladderandcoloncancerdatasets.cancerres.2004；64(15):5245-5250.)进行评价。qrt-pcr实验中，cq(rt-qpcr-derivedquantification)值直接反应了每个候选内参基因在某一实验条件下表达水平。三种程序基于所得到的cq值，根据指导手册中的基本原则和不同的计算方式，得到表达稳定值(m)，继而被进一步比较，对候选基因的稳定性进行排序。此外，采用deltact的方法利用同一样本中不同内参基因的cq的成对比较来评价这些候选基因的稳定性(vandesompelej,depk,pattynf,poppeb,vanrn,depa,spelemanf.accuratenormalizationofreal-timequantitativert-pcrdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.genomebiol.2002；3:research0034；；silvern,bests,jiangj,theinsl.selectionofhousekeepinggenesforgeneexpressionstudiesinhumanreticulocytesusingreal-timepcr.bmcmolbiol.2006；7(1):33-33.。最后，为了综合评价候选基因的稳定性，四种不同程序方法的排序结果被r安装包rankaggreg重新排序(pihurv,dattas,dattas.rankaggreg,anrpackageforweightedrankaggregation.bmcbioinformatics.2009；10(1):62-62.)，通过整合，获得候选基因稳定性比较的最终排名。候选内参基因的稳定性评价方法和结果具体如下：(1)genorm分析通过genorm程序的分析计算，获得了各候选内参基因在两种百合中不同实验条件下的稳定性表达的m值，并对他们的稳定性进行了排序。其中m值越小，候选内参基因在该实验条件下的稳定性越高。(2)normfinder分析利用normfinder对组间样本的表达变异进行了评价，并获得了每个候选基因的稳定值。同样，稳定值越小，其表达越稳定。(3)bestkeeper分析根据bestkeeper所得到的标准偏差(sd)和变异系数(cv)，对5个候选内参基因和3个对照内参基因的稳定性进行了排序。标准差值越小，代表候选内参基因的稳定性越高。(4)deltact和rankaggreg分析deltact(δct)法是利用比较相对表达水平(cq值)来比较每个样本中成对基因。通过比较两种百合中δct的绝对偏差，来对候选内参基因稳定性进行排序。最后，利用r包rankaggreg对前面所有方法程序所获得的候选内参基因的稳定性排名进行整合，获得最终排名，从而对候选内参基因进行综合评价(图4)。综上，通过对包括3个传统内参基因和5个从新铁炮百合smallrna文库中筛选的mirna候选内参基因在不同实验条件(包括不同的生长发育阶段，不同的器官组织及胁迫条件)下的新铁炮百合和岷江百合中进行了稳定性评价，所得到的实验结果表明，相较其他候选内参基因和传统内参基因，新的mirnamirn46在新铁炮百合所有样品中最为稳定(表6)，而mir399a则是不同实验条件下岷江百合中最适合的内参基因(表7)。表6候选内参基因在新铁炮百合中所有样本中的稳定性综合排名表7候选内参基因在岷江百合所有样本中的稳定性综合排名实施例4mirn46和mir399a作为候选内参基因在qrt-pcr检测中的稳定性验证为了进一步验证mirn46和mir399a作为内参在qrt-pcr检测中的应用效果，以参与生长发育调控的重要基因mir156a为检测对象，对其在两种百合生长过程中，当分别以两种百合中最稳定的内参基因，该条件下较为稳定的其他内参基因，以及较不稳定的内参基因(根据实施例3的评价结果确定)，三者为内参时的相对水平进行分析。在新铁炮百合中，使用的内参基因包括mirn46以及在该条件下较为稳定性的mir399a和较不稳定的5.8s(作为对照)为内参基因进行表达模式的分析。岷江百合中，则以mir399a、在该条件下较为稳定的mir2916及较不稳定的mirn46作为内参基因。以mirn46作为内参基因对新铁炮百合中的mir156a进行相对水平检测的结果如图5的a所示，以最稳定的mirn46和较为稳定的mir399a为内参基因时，mir156a的表达模式十分接近，均为先下降，后在s4时期呈现出上升的表达模式。而在较不稳定的5.8s为内参时，呈现出不同的表达模式。该结果可表明，mirn46可作为内参基因应用于新铁炮百合中，用于判断mirna的相对水平及其变化趋势，具有更好的标准化效果。以mir399a作为内参基因对岷江百合中mir156a进行相对水平检测的结果如图5的b所示，在岷江百合中，以mir399a作为内参基因，mir156a先保持上调表达，而后下调表达。其表达模式与以在生长过程中较为稳定的mir2916为内参时趋势一致。当以最不稳定的mirn46为内参时，mir156a的水平则呈现出逐渐上升的趋势，与以mir399a和mir2916为内参时的表达模式不同。以上结果表明，mir399a可作为内参基因应用于岷江百合，用于判断mirna的相对水平及其变化趋势，检测结果的准确性和可信度更高。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京林业大学<120>一种用于百合mirna检测的内参基因及其应用<130>khp201117722.3<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttcactgccaccatccgcctgc22<210>2<211>116<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtttctggagccgcaggagatcgtgagcagtgaagatgctcagatgctctgctttgcgga60gatctgagtatcttcactgccaccatccgcctgccgctcagaactccgctcttctt116<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgccaaaggagacttgccctg21<210>4<211>118<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgtgcagctgcattactgggcaacactcctctgacagtaggcggctcaggtgagttaatg60tggcctccaaaatttgtctactgccaaaggagacttgccctgcaatgcaatttgctct118<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ttcactgccaccatccgcctg21<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gcgagcacagaattaatacgac22<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tgccaaaggagaattgccc19<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8attcctatgtcgctcaatccaata24<210>9<211>138<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggaaagggagctgaaggatccggaatcaatttgggattgagaacagaggaatgaagagct60aaattttcattcctatgtcgctcaatccaatagattccggttcctcccattcctcgtcct120ctcactgtaacctttgta138<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ccataaacgatgccgacc18<210>11<211>91<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgggggctcgaagacgatcagataccgtcctagtctcaaccataaacgatgccgaccagg60gatcggcggatgttgcttttaggactccgcc91<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tcagactacaattatctgatc21<210>13<211>380<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tcctggcagttcttcagataatcagatttgtccatgaggtttcaactgttgcattccatt60gttgagttttattctgtttgcgtttctgtttgtttttgtcatggatctggctgattggag120gctgtgatgaccaaaaaatacctacctattttctgagggattccagtccttctgattgat180agaaaccaatggatccttctgagcctgccaagatcttcagattcttagttttgtattcgg240ctttttcgatttgtcttcgtatattgcattcttctaaaagcaagcaagattcgtaacagt300tgatgggatgataacctttcacagaaactgtatgtgttgacccaaaattcagactacaat360tatctgatcaactcagacat380<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14aaatgcccgacattaagctg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ttgcaatttctcaccatcca20<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gttgcagggtgcgatcata19<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17agggggtcacccatcctagt20<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gataaaattggaacgatacag21<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19atttggaccatttctcgattt21<210>20<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ccataaacgatgccgacc18<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tcagactacaattatctgatc21<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22attcctatgtcgctcaatccaata24当前第1页12当前第1页12