一种鱿鱼软骨
β-壳寡糖的制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及壳质多糖的制备，尤其是一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法。
背景技术：
[0002]
甲壳素(chitin)是一种由n-乙酰-d-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子线性多糖，以有序的晶体微纤维形式存在，导致不溶于水。在自然界中甲壳素广泛存在，数量是仅次于纤维素的天然多糖类。
[0003]
鱿鱼生产生成大量鱿鱼软骨，因其不可食性，作为加工废弃物丢弃。鱿鱼软骨中含有平行糖链组成的β-甲壳素，常与胶原蛋白相结合，具有防“三高”，抑制细菌活性，排重金属功效。鱿鱼软骨有效利用，将变废为宝，原料资源充分利用，由于β-甲壳素在水介质无溶解性，限制了其应用，因此需要一种有效、简便的β-壳寡糖的制备方法。
[0004]
现有壳聚糖提取技术中，中国专利201510129839.x、cn110452316a公开了β-壳寡糖的制备方法，经过稀酸溶液脱盐、稀碱溶液脱有机物和浓碱去除乙酰基，获得β-壳寡糖，但是采用酸碱法提取甲壳素已不适宜节能要求，此工艺已经被禁用。中国专利cn111171181a公开了酶法加工β-壳寡糖的方法，通过酶解脱除乙酰基，得到含高蛋白质和灰分的β-壳寡糖，利用酶虽然减少了对环境的污染，但耗时长，杂质多，降低了生产的有效性。
技术实现要素：
[0005]
为了克服现有酶法加工β-壳寡糖存在耗时长、杂质多、提取率及纯度低的不足，本发明的目的在于提供一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法，本发明的制备方法工艺温和环保，耗时短，效率高，成本低；产物脱乙酰度和纯度高，且水溶性好。
[0006]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用ph4-7的淋洗液淋洗3-5次，静置5-8h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；2）β-壳聚糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在18-45℃反应5-10h，升温至62-85℃搅拌1.5-3.2h，1500-3000r/min离心，取上清液，即得β-壳聚糖提取物溶液；3）β-壳寡糖制备：利用多枝横梗霉分泌的壳聚糖酶制备工程菌毕赤酵母，收集毕赤酵母分泌的壳聚糖酶，加入步骤2）获得的β-壳聚糖提取物溶液中，酶解2-4h，离心、取上清液，即得β-壳寡糖溶液；4）β-壳寡糖精制：取步骤3）所得的β-壳寡糖溶液，加入乙醇至乙醇质量百分含量为65-85%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作3-5次，得清洗后的β-壳寡糖；清洗后的β-壳寡糖进行超滤，截留8000da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入3000da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液即为精制β-壳寡糖溶液；
5）喷雾干燥：将步骤4）所得精制β-壳寡糖溶液喷雾干燥，得到β-壳寡糖；6）脱色：将步骤5）所得β-壳寡糖用超临界二氧化碳装置处理，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳寡糖成品。
[0007]
作为优选，在步骤1）中，所述的淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成。
[0008]
作为优选，在步骤2）中，所述的磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:5-15:45-60。
[0009]
作为优选，在步骤3）中，所述的壳聚糖酶含水量20%，壳聚糖酶与β-壳聚糖提取物溶液重量比为0.3-0.5:100。
[0010]
作为优选，在步骤3）中，所述的壳聚糖酶是由甘油和甲醇诱导产生的。
[0011]
作为优选，在步骤5）中，所述的喷雾干燥条件为喷头转速20000-22000r/min、进口温度180-220℃、进料速度100-180ml/min、出料口温度65-80℃、风速1-3m/s。
[0012]
作为优选，在步骤6）中，所述的超临界二氧化碳装置参数设置为二氧化碳流速15-25kg/h、萃取压力25-34mpa、萃取温度30-45℃、时间60-90min。
[0013]
作为优选，在步骤2）中，所述的搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件为：超声频率10-15khz，超声功率0.5-2w/cm2，超声波施加周期5-8min/h。
[0014]
作为优选，所述的淋洗液各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸5-8%和丙酮15-30%，余量为水。
[0015]
本发明有益效果：(1)本发明采用聚磷酸和磷酸酶提取壳聚糖，利用磷酸酶分解鱿鱼软骨中的有机物，释放磷酸，启动聚磷酸的分解和鱿鱼软骨中矿物质释放，进而聚磷酸在磷酸酶作用下进行可控释放并协助进行壳聚糖提取，制备的壳聚糖分子量大，水溶性好；(2)本发明采用醇沉联合超滤和透析进行壳聚糖的纯化，最大限度的去除了有机物、无机盐等杂质，使壳聚糖提取率和纯度较传统方法大为提高，分别为98.98%和97.62%；（3）本发明采用酶法联合氧化对大分子壳聚糖进行分解，制备小分子的壳寡糖，不产生废弃物，获得的产品水溶性好。
具体实施方式
[0016]
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
[0017]
实施例1一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用ph5.2的淋洗液淋洗4次，静置7h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸6.3%和丙酮24%，余量为水；2）β-壳寡糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在32℃反应8h，升温至80℃搅拌2.8h，2000r/min离心，取上清液，即得β-壳寡糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:12:50；在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率12khz，超声功率1.2w/cm2，超声波施加周期6min/h；
3）β-壳寡糖制备：利用多枝横梗霉分泌的壳聚糖酶制备工程菌毕赤酵母，收集毕赤酵母分泌的壳聚糖酶，加入步骤2）获得的β-壳聚糖提取物溶液中，酶解3h，离心、取上清液，即得β-壳寡糖溶液；其中，壳聚糖酶含水量20%，壳聚糖酶与β-壳聚糖提取物溶液重量比为0.4:100；4）β-壳寡糖精制：取步骤2）所得的β-壳寡糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为75%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作4次，得清洗后的β-壳寡糖；清洗后的β-壳寡糖进行超滤，截留30万da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液即为精制β-壳寡糖溶液；5）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳寡糖溶液喷雾干燥，得到β-壳寡糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速21000r/min、进口温度195℃、进料速度150ml/min、出料口温度70℃、风速2m/s；6）脱色：将步骤4）所得β-壳寡糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速20kg/h、萃取压力29mpa、萃取温度35℃、时间82min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳寡糖成品。
[0018]
实施例2一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用ph4的淋洗液淋洗3次，静置5h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸5%和丙酮15%，余量为水；2）β-壳寡糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在18℃反应5h，升温至62℃搅拌1.5h，1500r/min离心，取上清液，即得β-壳寡糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:5:45；在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率10khz，超声功率0.5w/cm2，超声波施加周期5min/h；3）β-壳寡糖制备：利用多枝横梗霉分泌的壳聚糖酶制备工程菌毕赤酵母，收集毕赤酵母分泌的壳聚糖酶，加入步骤2）获得的β-壳聚糖提取物溶液中，酶解2h，离心、取上清液，即得β-壳寡糖溶液；其中，壳聚糖酶含水量20%，壳聚糖酶与β-壳聚糖提取物溶液重量比为0.5:100；4）β-壳寡糖精制：取步骤2）所得的β-壳寡糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为65%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作3次，得清洗后的β-壳寡糖；清洗后的β-壳寡糖进行超滤，截留30万da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液即为精制β-壳寡糖溶液；5）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳寡糖溶液喷雾干燥，得到β-壳寡糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速20000r/min、进口温度180℃、进料速度100ml/min、出料口温度65℃、风速1m/s；6）脱色：将步骤4）所得β-壳寡糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速15kg/h、萃取压力25mpa、萃取温度30℃、时间60min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳寡糖成品。
[0019]
实施例3一种鱿鱼软骨β-壳寡糖的制备方法，其经过以下工艺步骤：
1）磷酸酶提取：取缺磷土地中植物根部土壤，粉碎后放入200目的筛网中，用ph7的淋洗液淋洗5次，静置8h，取上清液，冷冻干燥，即得磷酸酶；其中，淋洗液由磷酸铵、磷酸、丙酮和水组成，各组分质量百分含量为磷酸铵4.2%、磷酸8%和丙酮30%，余量为水；2）β-壳寡糖提取：将步骤1）中得到的磷酸酶加到聚磷酸和鱿鱼软骨混合物中，充分搅拌均匀，在45℃反应10h，升温至85℃搅拌3.2h，3000r/min离心，取上清液，即得β-壳寡糖粗提取物；其中，磷酸酶、聚磷酸和鱿鱼软骨质量比为1:15:60；在搅拌的同时还进行超声处理，超声处理条件：超声频率15khz，超声功率2w/cm2，超声波施加周期8min/h；3）β-壳寡糖制备：利用多枝横梗霉分泌的壳聚糖酶制备工程菌毕赤酵母，收集毕赤酵母分泌的壳聚糖酶，加入步骤2）获得的β-壳聚糖提取物溶液中，酶解4h，离心、取上清液，即得β-壳寡糖溶液；其中，壳聚糖酶含水量20%，壳聚糖酶与β-壳聚糖提取物溶液重量比为0.3:100；4）β-壳寡糖精制：取步骤2）所得的β-壳寡糖粗提取物，加入乙醇至乙醇质量百分含量为85%，离心取沉淀，用去离子水复溶和乙醇沉淀反复操作5次，得清洗后的β-壳寡糖；清洗后的β-壳寡糖进行超滤，截留30万da分子量的壳聚糖，截留液浓缩后，放入15万da的透析袋中去除杂质，透析袋中溶液即为精制β-壳寡糖溶液；5）喷雾干燥：将步骤3）所得精制β-壳寡糖溶液喷雾干燥，得到β-壳寡糖；其中，喷雾干燥条件为喷头转速22000r/min、进口温度220℃、进料速度180ml/min、出料口温度80℃、风速3m/s；6）脱色：将步骤4）所得β-壳寡糖用超临界二氧化碳装置处理，参数设置为二氧化碳流速25kg/h、萃取压力34mpa、萃取温度45℃、时间90min，萃取釜中剩余物料加入氧化剂进行脱色，获得β-壳寡糖成品。
[0020]
对比例1在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）不使用聚磷酸。
[0021]
对比例2在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）中不接种磷酸菌。
[0022]
对比例3在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤2）中不进行超声处理。
[0023]
对比例4在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤4）不醇沉处理。
[0024]
对比例5在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤6）不进行超临界二氧化碳除杂处理。
[0025]
对比例6在本对比例中，方法和实施例1基本相同，其区别在于：在步骤3）不进行酶解处理。
[0026]
对比例7采用中国专利cn110615855a中的实施例4。
[0027]
按照国家标准gb/t5009.4-2003《食品中灰分的测定》用灼烧称量法测定所提取得到的可溶性β-甲壳素中残留的灰分，按照国家标准gb/t5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》用紫外分光光度法测定提取后的可溶性β-甲壳素的蛋白质含量，水分结合能力、脂肪结
合能力、相对分子量和脱乙酰度参照中国专利cn110452316a中检测方法。检测结果如表1所示。
[0028]
表1 不同处理条件提取物理化学特性测定结果
组别实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5对比例6对比例7灰分/%0.070.090.081.410.880.620.290.270.170.19氮含量/%7.306.856.421.376.545.296.416.386.256.31水分结合能力/%25223823219201226229190212204相对分子量/kda1.3291.4961.2141.4331.3761.3411.3521.4274311.811脱乙酰度/%98.6297.1198.05
---
92.1383.3796.1596.2489.5196.46
由表1可知，聚磷酸和磷酸酶均对甲壳素分解制备壳聚糖有重要影响，对比例1表明磷酸酶是聚磷酸作用于甲壳素的控制因素，两者具有协同效果；实施例1和对比文件2相比，相对分子量差别显著，说明磷酸酶对聚磷酸作用具有调节效果，利于大分子壳聚糖的产生；对比例1、2和3表明超声处理、醇沉和超临界二氧化碳处理均对壳聚糖的制备有影响。产物的脱乙酰度和氮含量差异不大，但实施例1均最高，表明实施例1壳聚糖制备方法在保证高脱乙酰度的同时保持了氨基保留量，增加了产物分子的含氮量。实施例1和对比例3相比较可知，两者产物的脱乙酰度和氮含量差异均显著，说明超声处理对产物的脱乙酰度和高氨基保留量影响显著。对比文件6显示壳聚糖酶显著影响产物分子量大小和脱乙酰度，其使用有利于壳寡糖的制备。
[0029]
以β-壳寡糖提取率和纯度为指标，分析工艺提取效果。提取率（%）=提取物重量*100/原料重量；纯度（%）=提取物中β-壳寡糖*100/提取物总重量。
[0030]
表2 β-壳寡糖提取率和纯度分析结果
组别实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5对比例6对比例7提取率/%98.7597.9498.064.1275.2688.9197.0497.5597.8990.42纯度/%98.1397.9297.9996.7497.2897.0995.7695.8192.7893.53
由表2可知，本发明制备β-壳寡糖提取率和纯度优于对比例7。对比例1、2和3表明磷酸酶、聚磷酸和超声处理对β-壳寡糖提取具有显著影响，三者协同可显著提高β-壳寡糖制备工艺的效果。壳聚糖酶影响产物纯度，表明壳聚糖酶的使用，生成部分小分子量杂质。