一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。

背景技术：

二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度，但是密度过高随之而来的就是倒伏的风险，可能会降低产量，因此在一定程度上降低玉米株高有助于提高玉米产量。上世纪60年代末，闻名于世的“绿色革命”掀起了半矮化植株可以提高产量的狂潮。在“绿色革命”期间成功创制了半矮化水稻和小麦的高产品种。在过去的几十年中许多玉米矮化突变体被鉴定，但没有完全应用到玉米育种中。

传统矮杆玉米的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。

赤霉素(gas)是一种天然的四环二萜羧酸，在植物种子萌发、茎的伸长以及花的形成等生长发育过程中起着重要的作用。目前发现的赤霉素种类已经有130多种，其中有活性的赤霉素有四种，分别是ga1、ga3、ga4和ga7。在植物体内ga有两种存在形式，一种以游离态形式存在，参与植物生长代谢途径，另一种以结合态的形式存在，是不具有活性的，植物体内ga正常的含量由结合态ga与游离态ga的动态平衡来维持。ga的生物合成包括以下几个步骤：1)在原生质体中牻牛儿基二磷酸合成内根-贝壳杉烯；2)在内质网上内根-贝壳杉烯氧化生成ga12，ga12进一步转化成ga53；3)ga12和ga53进入到细胞质中，在一系列赤霉素氧化酶的作用下生成有活性的ga分子。

因此，提供一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)针对基因zmga3ox1设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；

所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：

5’-gggttcttgttgaggtgcgacgg-3’；seqidno.3；和

5’-gaagctggtgtagtcgtcgccgg-3’；seqidno.4；

(2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0，mt2t2-r0，mt2t2-r为引物，pcr扩增目的片段；

所述引物序列如下：

mt1t2-f：5’-aataatggtctcaggcgggttcttgttgaggtgcga-3’；seqidno.5；

mt1t2-f0：5’-gggttcttgttgaggtgcgagttttagagctagaaatagc-3’；seqidno.6；

mt1t2-r0：5’-gcgacgactacaccagcttcgcttcttggtgcc-3’；seqidno.7；

mt1t2-r：5’-attattggtctctaaacgcgacgactacaccagctt-3’；seqidno.8；

所述pcr反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f0.5μl，mt1t2-f00.5μl，mt1t2-r00.5μl，mt1t2-r0.5μl，2×mix10μl，ddh2o7μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。

(3)将步骤(2)获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，构建得到zmga3ox1基因编辑载体pbue411-2gr-zmga3ox1；

所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pbue4112μl，10xnebt4buffer1.5μl，10xbsa1.5μl，bsai1μl，t4ligase1μl，ddh2o6μl，total15μl；

(4)将步骤(3)获得的基因编辑载体pbue411-2gr-zmga3ox1转入农杆菌lba4404，进行玉米遗传转化，经筛选鉴定获得玉米矮化材料。

将两个sgrna作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。

携带cas9的载体为pbue411。

所述玉米为自交系c01。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法，基因编辑技术能精准对目的基因进行编辑，并且没有外缘基因的导入，本发明通过基因编辑技术精准编辑赤霉素合成基因zmga3ox1，可以精准降低玉米株高，并且不改变其它农艺性状。

本发明首次揭示了玉米zmga3ox1基因的生物学功能，通过crispr/cas9技术对玉米zmga3ox1基因进行基因编辑，并进一步筛选获得目的基因功能缺失的突变体材料，这些玉米矮化材料具有重要的育种价值。本发明创制的玉米矮化材料属于高度矮化材料，节间发育变短但正常结实，通过合理的栽培管理措施可以应用于杂交玉米生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明测序比对结果；

图2附图为本发明突变体株系；

其中，a为野生型玉米植株；b为突变体玉米植株。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明利用基因编辑技术创制玉米矮化材料，针对玉米中的目标基因zmga3ox1设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接到携带cas9的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因zmga3ox1的定点突变，进而获得zmga3ox1基因功能缺失的玉米植株。

实施例1基因编辑载体的构建

(1)控制玉米株高的基因为zmga3ox1基因，其核苷酸序列如下：

atgccgacgccgtcgcacctcaacaagaacccgcgctacctggacttccgggcggcgcggcgggtgccggagtcgcacgcctggccgggcctgcacgaccaccccgtcgtggacggcggcgcgccgggccccgacgccgtgccggtggtggacctgggcgccgcggacccggcgccggcgccggcggcggcggtggcccgcgccgccgagcaatggggcgcgttcctgctcacgggccacggcgtccccgcggacctgctggcgcgcgtggaggaccggatcgccaccatgttcgcgctgccggccgacgacaagatgcgcgccgtgcgcgggcccggcgacgcctgcggctacggctccccgcccatctcctccttcttctccaagtgcatgtggtccgagggctacaccttctcgccggcctccctccgcgccgacctccgcaagctctggcccaaggccggcgacgactacaccagcttctgtgatgtgatggaggagttccacaagcacatgcgcgccctcgcggacaagctgctggagctgttcctcatggcgctggggctcaccgacgagcaggccagcgccgtcgaggccgagcggaggatcgccgagacgatgaccgccaccatgcatctcaactggtacccgaggtgcccggacccgcggcgcgcgctggggctgatcgcgcacaccgactcgggcttcttcaccttcgtgatgcagagcctcgtgcccgggctgcagctcttccgccacgccccggaccggtgggtggcggtgccggccgtgccgggcgccttcgtcgtcaacgtgggcgacctcttccacatcctcaccaacggccggttccacagcgtgtaccaccgcgccgtcgtgaaccgggacctcgacaggatctcgctcggctacttcctcggcccgccgccgcacgccaaggtggcgccgctgcgcgaggccgtgccgcccggccgggcccccgcgtaccgcgccgtcacgtggcccgagtacatgggcgtccgcaagaaggccttcaccaccggcgcctccgcgctcaagatggtcgccctcgccgccgccgccgacctcgacgacgacggcgacgccgccgtcgtccatcagcagcagcagctagtcgtctcgtcgtag；seqidno.1。

zmga3ox1蛋白的氨基酸序列如下：

mptpshlnknpryldfraarrvpeshawpglhdhpvvdggapgpdavpvvdlgaadpapapaaavaraaeqwgaflltghgvpadllarvedriatmfalpaddkmravrgpgdacgygsppissffskcmwsegytfspaslradlrklwpkagddytsfcdvmeefhkhmraladkllelflmalgltdeqasaveaerriaetmtatmhlnwyprcpdprralgliahtdsgfftfvmqslvpglqlfrhapdrwvavpavpgafvvnvgdlfhiltngrfhsvyhravvnrdldrislgyflgppphakvaplreavppgrapayravtwpeymgvrkkafttgasalkmvalaaaadldddgdaavvhqqqqlvvss；seqidno.2。

(2)针对基因zmga3ox1，sgrna作用位点的核苷酸序列为:

5’-gggttcttgttgaggtgcgacgg-3’；seqidno.3；(靶点1)和5’-gaagctggtgtagtcgtcgccgg-3’；seqidno.4；(靶点2)。

根据所选的编辑位点以及载体pcbc-mt1t2和pbue411多克隆位点处的酶切位点设计引物，引物序列如下：

mt1t2-f：5’-aataatggtctcaggcgggttcttgttgaggtgcga-3’；seqidno.5；

mt1t2-f0：5’-gggttcttgttgaggtgcgagttttagagctagaaatagc-3’；seqidno.6；

mt1t2-r0：5’-gcgacgactacaccagcttcgcttcttggtgcc-3’；seqidno.7；

mt1t2-r：5’-attattggtctctaaacgcgacgactacaccagctt-3’；seqidno.8。

(3)用一轮pcr方法扩增目的片段，pcr反应使用两对引物mt1t2-f，mt1t2-f0，mt2t2-r0，mt2t2-r，以pcbc-mt1t2质粒为模板扩增。

pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f0.5μl，mt1t2-f00.5μl，mt1t2-r00.5μl，mt1t2-r0.5μl，2×mix10μl，ddh2o7μl。

pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。

将获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，反应体系如下：

目的片段(964bp)2μl，pbue4112μl，10xnebt4buffer1.5μl，10xbsa1.5μl，bsai(neb)1μl，t4ligase(neb)/高浓度1μl，ddh2o6μl，total15μl。

反应条件：37℃5h，50℃5min，80℃10min。

构建得到zmga3ox1基因编辑载体pbue411-2gr-zmga3ox1。

实施例2基因编辑载体转入农杆菌lba4404

1)cacl2法制备根癌农杆菌感受态细胞

(1)从yep平板(rif^r，str^r)上挑取新鲜的eha105单菌落接种于含50mg/lstr和25mg/lrif的yep液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜24～36h；

(2)取2ml过夜活化的对数生长期的菌液，接种于50mlyep液体培养基中，20℃培养菌液od600至0.4～0.6左右；

(3)将菌液转移到冰预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4,000×g离心10min，富集菌体；

(4)用10ml冰预冷0.05mcacl2悬浮菌体，冰浴30min，4℃，4,000×g离心10min，富集菌体；

(5)用1ml冰预冷0.05mcacl2重悬菌体，将制备好的感受态细胞于4℃保存，24～48h内使用转化效率最高，也可按每管100μl分装于无菌管中，加入终浓度20％甘油，并用液氮速冻后置于-80℃保存。

2)冻融法转化根癌农杆菌感受态细胞

(1)取出农杆菌感受态(200μl)，置于冰上，待刚解冻时加入质粒dna(1μg)，放入液氮中1min，而后放入37℃金属浴中5min；

(2)取出离心管，加入1mlyeb液体培养基(不含抗生素)，置于摇床上，28℃，180r/min培养35h；

(3)3000rpm离心1min，取出多余上清液，保留100μl，重悬，倒入yeb平板培养基(kan，rif)上，涂抹均匀，在恒温培养箱中28℃培养36-48h；

(4)挑取单克隆，检测，保留阳性菌落。利用引物osu3-fd3/tau3-rd进行菌液pcr鉴定。

其中，osu3-fd3/tau3-rd引物序列如下：

osu3-fd3：5’-gacaggcgtcttctactggtgctac-3’；seqidno.9；

tau3-rd：5’-ctcacaaattatcagcacgctagtc-3’；seqidno.10。

反应体系：

菌液1μl，osu3-fd31μl，tau3-rd1μl，2×mix10μl，ddh2o7μl，total20μl。

pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。

菌落pcr产物大小为831bp。

实施例3玉米遗传转化

(1)取胚材料为玉米自交系c01，在授粉后第九天开始观察玉米幼胚，待其长到1.5mm左右时，将果穗取回实验室进行取胚工作。

(2)准备农杆菌侵染液，经过活化的农杆菌在yeb液体培养基中摇菌至特定浓度时(od550＝0.5)，低速离心收集菌体沉淀，然后用inf(每升组成：n6盐和维生素(sigma)2克，蔗糖68.5克，葡萄糖36克，l-proline0.7克，mes0.5g，1mg/ml2,4-d1.5ml)+as(acetosyringone，(100mm)，1ml))液体培养基重悬，25℃75r/min摇菌24h，至浓度为od550＝0.3-0.4即可。

(3)将(1)中取出的幼胚用inf+as(同上)液体培养基洗涤2次，然后加入农杆菌侵染液，侵染20min-30min。

(4)将侵染过后的幼胚转移到共培养培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline0.7克，mes0.5g，1mg/ml2,4-d1.5ml，琼脂糖(低eeo)5g，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/mll-半胱氨酸0.4g，0.5m/ldtt0.154g)中，幼胚的盾片朝上，胚轴与培养基表面接触，用封口膜封住培养皿，在20℃培养箱中暗培养3天。

(5)把幼胚从共培养培养基转移到静息培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline0.7克，mes0.5g，1mg/ml2,4-d1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/mll-半胱氨酸0.4g，0.5m/ldtt0.154g，timentin(蒂门汀，sigma)100mg)中，用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。

(6)再将所有的幼胚转移到选择培养基ⅰ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline0.7克，mes0.5g，1mg/ml2,4-d1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/mll-半胱氨酸0.4g，0.5m/ldtt0.154g，timentin100mg，3mg/mlbialaphos0.5ml)上，28℃暗培养两周。

(7)将所有的幼胚转移到选择培养基ⅱ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline0.7克，mes0.5g，1mg/ml2,4-d1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/mll-半胱氨酸0.4g，0.5m/ldtt0.154g，timentin100mg，3mg/mlbialaphos1ml)上，此时可以进行挑选，挑选颜色鲜艳的幼胚28℃暗培养两周。

(8)经过两次选择之后，开始进行再生，在再生培养基i(每升组成：ms(murashigeandskoog)盐(sigma)4.3g，蔗糖60g，凝胶2.5克，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin100mg)中进行发芽生根，待见到明显叶片及根生长出来时转移到再生培养基ⅱ(每升组成：mssalts2.9g，蔗糖30g，凝胶2.5g，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin100mg)上。从此步骤开始，进行光照培养。

(9)待再生苗长出3-4片叶时，将其转移至温室，并进行检查，阳性植株保留，缓苗2-3天后转移到土中，而后进行正常的玉米生长管理，开花一周后进行株高测量。

实施例4发生编辑的转基因玉米植株的鉴定

经过草铵膦筛选后成活的玉米叶片采用ctab法提取dna，用zmga3ox1基因特异性引物进行pcr鉴定，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

zmga3ox1基因特异性引物序列如下：

zmga3ox1-crispr-f1：5’-gtcctagatttacacttggtgct-3’；seqidno.11；

zmga3ox1-crispr-r1：5’-cgatgatgtatcatatcggtgct-3’；seqidno.12；

zmga3ox1-crispr-f2：5’-ctctcatgccaccataccac-3’；seqidno.13；

zmga3ox1-crispr-r2：5’-ctagcaagccaaaagggcta-3’；seqidno.14。

反应体系为：

dna1μl，zmga3ox1-crispr-f1(f2)1μl，zmga3ox1-crispr-r1(r2)1μl，2×mix10μl，ddh2o7μl，total20μl。

反应程序为：94℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃∞。

引物对(zmga3ox1-crispr-f1/r1)用于扩增靶点1突变，产物大小约为0.9kb；引物对(zmga3ox1-crispr-f2/r2)用于扩增靶点2突变，产物大小约为1kb；分别将扩增产物条带大小正确的pcr产物送去测序，测序结果与野生型进行比对，结果见图1(仅显示突变位点)。筛选到1个zmga3ox1基因编辑的突变体株系(图2，b)。发生编辑的纯合突变体材料明显比野生型玉米(图2，a)植株矮。这个玉米矮化材料具有重要的育种价值。

对野生型和突变体株系的株高进行统计，野生型植株平均株高为241.1cm，突变体株系平均株高为86.3cm，二者差异显著。

本发明提供一种创制玉米矮化材料的方法，按照上述方法对zmga3ox1目的基因进行编辑，获得zmga3ox1基因功能缺失的玉米植株，然后基因功能缺失的玉米植株进行杂交、回交、自交或无性繁殖，从而创制玉米矮化材料。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1149

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

atgccgacgccgtcgcacctcaacaagaacccgcgctacctggacttccgggcggcgcgg60

cgggtgccggagtcgcacgcctggccgggcctgcacgaccaccccgtcgtggacggcggc120

gcgccgggccccgacgccgtgccggtggtggacctgggcgccgcggacccggcgccggcg180

ccggcggcggcggtggcccgcgccgccgagcaatggggcgcgttcctgctcacgggccac240

ggcgtccccgcggacctgctggcgcgcgtggaggaccggatcgccaccatgttcgcgctg300

ccggccgacgacaagatgcgcgccgtgcgcgggcccggcgacgcctgcggctacggctcc360

ccgcccatctcctccttcttctccaagtgcatgtggtccgagggctacaccttctcgccg420

gcctccctccgcgccgacctccgcaagctctggcccaaggccggcgacgactacaccagc480

ttctgtgatgtgatggaggagttccacaagcacatgcgcgccctcgcggacaagctgctg540

gagctgttcctcatggcgctggggctcaccgacgagcaggccagcgccgtcgaggccgag600

cggaggatcgccgagacgatgaccgccaccatgcatctcaactggtacccgaggtgcccg660

gacccgcggcgcgcgctggggctgatcgcgcacaccgactcgggcttcttcaccttcgtg720

atgcagagcctcgtgcccgggctgcagctcttccgccacgccccggaccggtgggtggcg780

gtgccggccgtgccgggcgccttcgtcgtcaacgtgggcgacctcttccacatcctcacc840

aacggccggttccacagcgtgtaccaccgcgccgtcgtgaaccgggacctcgacaggatc900

tcgctcggctacttcctcggcccgccgccgcacgccaaggtggcgccgctgcgcgaggcc960

gtgccgcccggccgggcccccgcgtaccgcgccgtcacgtggcccgagtacatgggcgtc1020

cgcaagaaggccttcaccaccggcgcctccgcgctcaagatggtcgccctcgccgccgcc1080

gccgacctcgacgacgacggcgacgccgccgtcgtccatcagcagcagcagctagtcgtc1140

tcgtcgtag1149

<210>2

<211>382

<212>prt

<213>artificialsequence

<400>2

metprothrproserhisleuasnlysasnproargtyrleuaspphe

151015

argalaalaargargvalprogluserhisalatrpproglyleuhis

202530

asphisprovalvalaspglyglyalaproglyproaspalavalpro

354045

valvalaspleuglyalaalaaspproalaproalaproalaalaala

505560

valalaargalaalagluglntrpglyalapheleuleuthrglyhis

65707580

glyvalproalaaspleuleualaargvalgluaspargilealathr

859095

metphealaleuproalaaspasplysmetargalavalargglypro

100105110

glyaspalacysglytyrglyserproproileserserphepheser

115120125

lyscysmettrpsergluglytyrthrpheserproalaserleuarg

130135140

alaaspleuarglysleutrpprolysalaglyaspasptyrthrser

145150155160

phecysaspvalmetglugluphehislyshismetargalaleuala

165170175

asplysleuleugluleupheleumetalaleuglyleuthraspglu

180185190

glnalaseralavalglualagluargargilealagluthrmetthr

195200205

alathrmethisleuasntrptyrproargcysproaspproargarg

210215220

alaleuglyleuilealahisthraspserglyphephethrpheval

225230235240

metglnserleuvalproglyleuglnleuphearghisalaproasp

245250255

argtrpvalalavalproalavalproglyalaphevalvalasnval

260265270

glyaspleuphehisileleuthrasnglyargphehisservaltyr

275280285

hisargalavalvalasnargaspleuaspargileserleuglytyr

290295300

pheleuglyproproprohisalalysvalalaproleuarggluala

305310315320

valproproglyargalaproalatyrargalavalthrtrpproglu

325330335

tyrmetglyvalarglyslysalaphethrthrglyalaseralaleu

340345350

lysmetvalalaleualaalaalaalaaspleuaspaspaspglyasp

355360365

alaalavalvalhisglnglnglnglnleuvalvalserser

370375380

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

gggttcttgttgaggtgcgacgg23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

gaagctggtgtagtcgtcgccgg23

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

aataatggtctcaggcgggttcttgttgaggtgcga36

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>6

gggttcttgttgaggtgcgagttttagagctagaaatagc40

<210>7

<211>33

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>7

gcgacgactacaccagcttcgcttcttggtgcc33

<210>8

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>8

attattggtctctaaacgcgacgactacaccagctt36

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

gacaggcgtcttctactggtgctac25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>10

ctcacaaattatcagcacgctagtc25

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>11

gtcctagatttacacttggtgct23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>12

cgatgatgtatcatatcggtgct23

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>13

ctctcatgccaccataccac20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>14

ctagcaagccaaaagggcta20