一种负载型金属催化剂催化再生NAD(P)H的方法

本发明属于生物化学催化以及生物制造领域，具体涉及一种负载型金属催化剂催化再生nad(p)h的方法。

背景技术：

生物催化具有反应条件温和，催化效率高和选择性高等优点，广泛用于包括日用化学品，高附加值药品生产在内的化学和制药工业领域(straathof,adriejj.chemicalreviews,2014,114(3):1871-908；bornscheuerut,huismangw,kazlauskasrj,etal.nature,2012,485(7397):185-194.)。氧化还原酶是参与生物催化过程的最大的一组酶(约占所有酶的25％)，氧化还原酶在双键氧化，醛和有机酸的氧化还原，生物固氮和生物制氢等领域具有广泛的应用前景(wuh,tianc,songx,etal.greenchemistry,2013,15(7):1773-1789.)。氧化还原酶在生物催化或转化反应中均需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或其磷酸化形式(nadph)的参与(两者均指生物活性1,4-nad(p)h)，已知的氧化还原酶中有80％需要nadh，而10％需要nadph(wuh,tianc,songx,etal.greenchemistry,2013,15(7):1773-1789.)。鉴于nad(p)h的高成本(nadh的批量价格为$3000/mol，nadph的价格比nadh高，其批量价格为$21500/mol)，并且还原型辅酶在环境中是不稳定的，很容易被氧化失活，因此，在氧化还原酶反应中加入化学计量的nad(p)h在经济上是不可行的(wangx,sabat,yiuhhp,etal.chem,2017,2(5):621-654.)。因此，nad(p)h的高效再生是辅酶依赖型生物催化反应的关键，使得生物催化生产过程中的nad(p)h通过再生而循环使用(lifl,zhouq,weiw,etal.internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2019,135.)。

目前报道的辅酶再生方法有酶法、化学法、光催化法和电化学法。但nad(p)h的酶促再生过程复杂且成本不经济(seelbachk,riebelb,hummelw,etal.1996,37(9):1377-1380；wangx,sabat,yiuhhp,etal.chem,2017,2(5):621-654.)。化学法需要昂贵的有毒金属螯合体作为电子介体([cp*rh(bpy)h2o]²⁺)或甲基紫精通常是已知nad(p)h参与，并且化学催化所用的催化剂自身对辅酶具有毒性(maenakay,suenobut,fukuzumis.journaloftheamericanchemicalsociety,2012,134(22):9417.)，光催化除了需要有毒的电子介体参与外，低的光转化效率同样制约着该方法的使用；电催化也需要有毒电子介体参与，并且选择性差。因此，有必要开发一种绿色的经济和高效的nad(p)h再生方法。近年来的研究表明，使用负载型金属催化剂再生辅酶具有高选择性优点，不需要有毒且昂贵的电子介体，例如，wang等研究发现三氧化二铝负载pt、rh、ru和ni均能够强化h2对nad⁺的还原活性，并且该方法再生的辅酶能够与生物催化转化结合(wangx,yiuhhp.acscatalysis,2016,6(3):1880-1886.)。但是目前多涉及的是负载型单金属纳米催化剂对辅酶的再生，这种负载型单金属催化剂对辅酶的再生效率并不高，并且反应时间长，而关于二元或多元金属纳米催化剂高效再生辅酶的方法仍未见报道。

近年来，基于温和、清洁、效率高以及选择性高等优点，依赖nad(p)h合成高附加值化学品、药品等生物催化反应引起了科学家们的广泛关注和研究。开发一种高效绿色的nad(p)h再生方法对解决生物催化反应中辅酶高效循环使用、降低生物催化的成本具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是要提供一种负载型双金属纳米催化剂催化再生nad(p)h的方法，这种负载型双金属纳米催化剂对nad(p)h的再生并不需要有毒的电子介体([cp*rh(bpy)h2o]²⁺)参与，再生的辅酶经过mtt法检测具有电子转移活性。该方法具有反应条件温和，辅酶再生效率高，反应快速，选择性高，环境友好、操作简便易行等优点。

为此，本发明提供了一种负载型金属催化剂催化再生nad(p)h的方法，其包括在负载型金属催化剂作用下对氧化型辅酶进行还原，得到还原型辅酶nad(p)h；其中，所述负载型金属催化剂为负载型双金属纳米催化剂。

本发明中，所述负载型双金属纳米催化剂由双金属纳米粒子负载于载体上构成，其中，所述双金属包括贵金属和/或过渡金属，其中，所述贵金属包括金、钯、铂和银等中的一种或几种；所述过渡金属包括铜、镍和钴等中的一种或几种；优选地，所述双金属包括金、钯和铂中的任意两种。

在本发明的一些实施例中，所述负载型双金属纳米催化剂的工作浓度为0.001-10mg/ml，优选为1-5mg/ml。

在本发明的另一些实施例中，所述负载型双金属纳米催化剂中的双金属的质量比值为0.25-4。

本发明中，所述载体以纳米材料的形式存在，其包括金属氧化物、非金属氧化物、非金属半导体、碳材料和金属有机框架材料(mofs)等中的一种或多种；其中，所述金属氧化物包括氧化锆、氧化钛和氧化镁中的一种或几种；所述非金属氧化物包括氧化硅和/或五氧化二磷等；所述非金属半导体包括石墨相氮化碳和/或石墨烯等；所述碳材料包括活性炭、碳纳米管和碳纤维等中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，双金属纳米粒子的负载量为0.001wt％-10wt％，优选为1wt％-5wt％。

根据本发明的一些实施方式，所述方法包括将氧化型辅酶、负载型双金属纳米催化剂和电子供体在缓冲液中混合后，搅拌反应，得到还原型辅酶nad(p)h。

根据本发明的另一些实施方式，所述方法包括：

步骤s1，将负载型双金属纳米催化剂和电子供体在缓冲液中混合后，搅拌反应，然后离心去除催化剂，获得具有辅酶还原活性物质的上清液；

步骤s2，向含具有辅酶还原活性物质的上清液中加入氧化型辅酶，搅拌反应，得到还原型辅酶nad(p)h；

其中的辅酶还原活性物质包括醛类化合物，所述醛类化合物包括乙醇醛、乙醛、乙二醛和甲醛中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述反应的温度为20-40℃，优选为25-37℃。

在本发明的另一些实施例中，所述反应的时间为10-480min，优选为60-240min。

本发明中，所述搅拌为磁力搅拌、机械搅拌或振荡。

在本发明的一些实施例中，所述搅拌的转速为0-800rpm，优选为100-600rpm。

本发明中，所述氧化型辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad⁺)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp⁺)或nad(p)+的模型化合物。

在本发明的一些实施例中，所述氧化型辅酶的浓度为0.001-1mmol/l。

本发明中，所述电子供体为能够提供电子小分子有机物，其包括胺类化合物、醇胺类化合物、氨基酸类化合物、有机羧酸类化合物、醇类化合物、醛类化合物和其他小分子有机物中的一种或多种；其中，所述醇胺类化合物包括三乙醇胺和/或乙醇胺；所述胺类化合物包括三乙胺和/或二乙胺等；所述氨基酸类化合物包括半胱氨酸和/或赖氨酸；有机羧酸类化合物包括甲酸、乙酸、丙酸和乳酸等中的一种或几种；所述醛类化合物包括甲醛、乙醛、乙二醛和乙醇醛中的一种或几种；醇类化合物包括甲醇、乙醇和乙二醇中的一种或几种；所述其他小分子有机物包括edta、edta钠盐和抗坏血酸中的一种或多种；优选地，所述电子供体包括三乙醇胺、乙醇胺、乙醇醛、乙二醛、抗坏血酸和甲酸中的一种或多种。

在本发明的一些实施例中，电子供体的工作浓度为0-2000mmol/l，优选为20-500mmol/l。

本发明中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或tis-hcl缓冲液。

在本发明的一些实施例中，所述缓冲液的ph为7.4-12.6，优选为8-11.6。

在本发明的另一些实施例中，所述缓冲液的工作浓度为10-500mmol/l，优选为50-200mmol/l。

根据本发明方法，所述反应的ph采用碱液或酸液来调控。

本发明中，所述碱液由碱溶于水形成；优选地，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所用碱液的浓度为0.1-10mol/l，选为0.5-5mol/l。

本发明中，所述酸液由酸溶于水形成；优选地，所述酸包括无机酸和/或有机酸；其中，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸和磷酸中的一种或几种；所述有机酸包括甲酸、乳酸和乙酸中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述酸液的浓度为0.01-12mol/l，优选为0.1-6mol/l。

本发明所述的负载型双金属纳米催化剂能够高效、高选择性的将氧化型辅酶nad(p)⁺还原生成还原型辅酶nad(p)h，具有不依赖有毒电子供体、反应快速等优点，同时可以通过本发明设计的两锅法再生技术使得催化剂不与nad(p)h直接接触，杜绝了金属催化剂自身对还原型nad(p)h可能存在的金属毒性。

本发明具有反应条件温和、高效快速、操作简便、易控、环境友好等优点，在nad(p)h依赖型的氧化还原酶参与的生物催化转化领域具有广阔的应用潜力。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1示出负载型双金属纳米催化剂与负载型单金属纳米催化剂对nadp⁺还原的对比结果。

图2示出340nm紫外吸收法与mtt法检测的负载型双金属纳米催化剂再生的nad(p)h浓度对比结果。

图3示出反应体系温度对负载型双金属催化剂再生nadph的影响。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

ⅰ.术语

本发明中所述“水”一词，在没有特别说明或限定的情况下是指去离子水、蒸馏水或超纯水。

本发明所述用语“一步法”是指负载型双金属催化剂直接与电子供体和氧化型辅酶混合进行反应。

本发明所述用语“两步法”是指首先将负载型双金属纳米催化剂与电子供体混合反应一定时间后，离心弃掉催化剂，在上清液中加入氧化型辅酶进行反应，利用负载型双金属催化剂氧化电子供体生成的醛类物质还原氧化型辅酶。

本发明所述用语“反应体系”是指化学反应中各反应相关的部分组合而成的整体，亦即化学反应中的反应物与溶剂、催化剂和反应生成物中的一种或几种组成的整体，例如，在采用催化剂与辅酶直接接触的一步法反应进行辅酶再生时，反应体系是指由负载型双金属纳米催化剂、缓冲液、电子供体和氧化型辅酶构成的整体；又例如，在采用催化剂不与辅酶直接接触的两步法反应进行辅酶再生时，反应体系是指由含具有辅酶还原活性物质的上清液和氧化型辅酶构成的整体。

本发明所述用语“工作浓度”是指该反应物在反应体系中的浓度。

ⅱ.实施方案

如前所述，现有的nad(p)h再生工艺不尽如人意，存在这样或那样一些问题，例如，有的nad(p)h再生工艺需要有毒且昂贵的电子介体([cp*rh(bpy)h2o]²⁺)参与，且选择性差；有的nad(p)h再生工艺再生效率低，且反应时间长；鉴于此，本发明人对于nad(p)h再生工艺进行了大量的研究。

本发明人研究发现，采用一种负载型双金属纳米催化剂对nad(p)h进行再生并不需要有毒的电子介体([cp*rh(bpy)h2o]²⁺)参与，再生的辅酶经过mtt法检测具有电子转移活性。该方法具有反应条件温和，辅酶再生效率高，反应快速，选择性高，环境友好、操作简便易行等优点；由此获得本发明。

因此，本发明所涉及的负载型金属催化剂催化再生nad(p)h的方法可以理解为一种负载型双金属纳米催化剂催化氧化型辅酶，例如nad(p)⁺加氢还原生成nad(p)h的方法，该方法包括在负载型金属催化剂作用下对氧化型辅酶进行还原，得到还原型辅酶nad(p)h；其中，所述负载型金属催化剂为负载型双金属纳米催化剂。

本发明中，所述负载型双金属纳米催化剂由双金属纳米粒子负载于载体上构成；或者说，所述负载型双金属纳米催化剂由载体和负载于载体上的双金属纳米粒子构成；其中，所述双金属包括贵金属和/或过渡金属；具体地，所述双金属包括贵金属如金、钯、铂和银等，以及过渡金属如铜、镍和钴等中的任意两种，优选为贵金属如金、钯和铂中的任意两种，进一步优选为金和钯。

在本发明的一些实施例中，所述负载型双金属纳米催化剂的工作浓度为0.001-10mg/ml，优选为1-5mg/ml，进一步优选为2.5-5mg/ml。

在本发明的另一些实施例中，所述负载型双金属纳米催化剂中的双金属的质量比值为0.25-4。

本发明中，所述负载型双金属纳米催化剂所采用的载体以纳米材料的形式存在，其包括金属氧化物、非金属氧化物、非金属半导体、碳材料以及金属有机框架材料(mofs)等中的一种或多种；具体地，所述负载型双金属纳米催化剂采用的载体包括金属氧化物如氧化锆、氧化钛和氧化镁等，非金属氧化物如氧化硅和/或五氧化二磷等，非金属半导体如石墨相氮化碳和/或石墨烯等，碳材料如活性炭、碳纳米管和碳纤维等中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，双金属纳米粒子的负载量为0.001wt％-10wt％，优选为1wt％-5wt％。

本发明的一些实施方式中，采用催化剂与辅酶直接接触的一步法反应进行辅酶再生，所述方法包括将氧化型辅酶、负载型双金属纳米催化剂和电子供体在缓冲液中混合均匀，在20-40℃，优选为25-37℃，进一步优选为37℃下，以0-800rpm，优选为100-600rpm，进一步优选为600rpm的转速搅拌反应10-480min，优选为60-240min，进一步优选为240min，得到还原型辅酶nad(p)h。

本发明中对于“将氧化型辅酶、负载型双金属纳米催化剂和电子供体在缓冲液中混合”的顺序没有限制，例如，既可以将负载型双金属纳米催化剂加入缓冲液中，然后加入电子供体和氧化型辅酶(例如，nad(p)⁺)，混合，也可以将电子供体和氧化型辅酶(例如，nad(p)⁺)加入缓冲液中，然后加入负载型双金属纳米催化剂，混合。

本发明的另一些实施方式中，采用催化剂不与辅酶直接接触的两步法反应进行辅酶再生，所述方法包括：

步骤s1，将负载型双金属纳米催化剂和电子供体在缓冲液中混合后，在20-40℃，优选为25-37℃，进一步优选为37℃下，以0-800rpm，优选为100-600rpm，进一步优选为600rpm的转速搅拌反应10-480min，优选为60-240min，进一步优选为240min，然后离心(5000-12000rpm)去除催化剂，获得具有辅酶还原活性物质的上清液；

步骤s2，向含具有辅酶还原活性物质的上清液中加入氧化型辅酶，在20-40℃，优选为25-37℃，进一步优选为37℃下，以0-800rpm，优选为100-600rpm，进一步优选为600rpm的转速搅拌反应10-480min，优选为60-240min，进一步优选为240min，得到还原型辅酶nad(p)h；

其中的辅酶还原活性物质包括但不限于醛类化合物，所述醛类化合物包括乙醇醛、乙醛、乙二醛和甲醛等中的一种或几种。

本发明人研究发现，双金属催化剂氧化醇胺类电子供体生成的辅酶还原活性物质主要包括乙醇醛、乙醛和乙二醛等，其中乙醇醛对辅酶的还原活性很高。

本发明中，所述搅拌为磁力搅拌、机械搅拌或振荡。

在本发明的一些实施例中，所述搅拌的转速为0-800rpm，优选为100-600rpm。

本发明中，所述氧化型辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad⁺)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp⁺)或nad(p)+的模型化合物。

在本发明的一些实施例中，所述氧化型辅酶的浓度为0.001-1mmol/l，优选为0.5-1mmol/l，进一步优选为0.5mmol/l。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中所述氧化型辅酶的浓度是指所述氧化型辅酶在反应体系中的浓度，例如，在采用催化剂与辅酶直接接触的一步法反应进行辅酶再生时，是指包括负载型双金属纳米催化剂、缓冲液、电子供体和氧化型辅酶的反应体系中的氧化型辅酶的浓度；又例如，在采用催化剂不与辅酶直接接触的两步法反应进行辅酶再生时，是指在含具有辅酶还原活性物质的上清液和氧化型辅酶的反应体系中的氧化型辅酶的浓度。

本发明中，所述电子供体为能够提供电子小分子有机物，其包括胺类化合物、醇胺类化合物、氨基酸类化合物、有机羧酸类化合物、醇类化合物、醛类化合物和其他小分子有机物中的一种或多种；具体地，所述电子供体包括醇胺类化合物如三乙醇胺、乙醇胺等，胺类化合物如三乙胺和/或二乙胺等，氨基酸类化合物如半胱氨酸、赖氨酸等，有机羧酸如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸等，醛类化合物如甲醛、乙醛、乙二醛和乙醇醛等，醇类化合物如甲醇、乙醇、乙二醇等和其他小分子有机物如edta、edta钠盐、抗坏血酸等中的一种或多种，优选为醇胺类化合物如三乙醇胺、乙醇胺等，醛类化合物如乙醇醛、乙二醛等和抗坏血酸、甲酸等中的一种或多种；优选地，所述电子供体包括三乙醇胺、乙醇胺、半胱氨酸、赖氨酸、甲酸、乙酸、乳酸、甲醛、乙醛、乙二醛、乙醇醛、甲醇、乙醇、乙二醇、edta、edta钠盐和抗坏血酸等中的一种或多种，优选为三乙醇胺、乙醇胺、乙醇醛、乙二醛、抗坏血酸和甲酸等中的一种或多种，更优选为三乙醇胺。

在本发明的一些实施例中，电子供体的工作浓度为0-2000mmol/l，优选为20-500mmol/l，更优选为50-200mmol/l，更进一步优选为200mmol/l。

本发明中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或tis-hcl缓冲液；所述缓冲液的ph为7.4-12.6，优选为8-11.6；所述缓冲液的工作浓度为10-500mmol/l，优选为50-200mmol/l。

根据本发明方法，所述反应的ph采用碱液或酸液来调控。

本发明中，所述碱液由碱溶于水形成；优选地，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所用碱液的浓度为0.1-10mol/l，优选为0.5-5mol/l。

本发明中，所述酸液由酸溶于水形成；优选地，所述酸包括无机酸和/或有机酸；其中，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸和磷酸中的一种或几种；所述有机酸包括甲酸、乳酸和乙酸中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述酸液的浓度为0.01-12mol/l，优选为0.1-6mol/l。

本发明中还原型辅酶nad(p)h的检测方法

(1)本发明中利用340nm紫外吸收法对体系中的还原型辅酶nad(p)h总量进行检测，证实nad(p)⁺被还原。

(2)本发明中利用双酶循环反应法(mtt)对体系中具有电子转移活性的1,4-nad(p)h进行检测，证实负载型双金属纳米催化剂再生的辅酶是具有电子转移活性的1,4-nad(p)h。

以上两种检测方法均使用n4型紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)作为检测仪器。

ⅲ.实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。

负载型双金属纳米催化剂制备：将两种金属纳米粒子的前体离子溶液和载体混合搅拌，然后加入硼氢化钠还原金属离子形成负载型双金属纳米催化剂，用纯水洗涤掉负载不牢固的双金属纳米粒子，真空干燥后直接作为催化剂使用。

实施例1：负载型双金属纳米催化剂与负载型单金属纳米催化剂对nadp⁺还原

在2ml含有0.5mmol/l氧化型辅酶nadp⁺和200mmol/l三乙醇胺的缓冲液中加入5mg负载型金属催化剂，使得催化剂的工作浓度为2.5mg/ml，控制温度25℃，600rpm搅拌240min，利用340nm紫外吸收法检测反应体系中还原型辅酶nadph的浓度，负载型双金属纳米催化剂与负载型单金属纳米催化剂对nadp⁺还原的对比结果如图1所示。

对比图1中的负载型双金属纳米催化剂与负载型单金属纳米催化剂对nadp⁺还原结果可以看出。负载型单金属催化剂铜、金对nadph的再生活性很低，单金属钯对nadph的再生效率能够达到26％，而将两种金属一起负载在载体上形成的负载型双金属纳米催化剂均具有较好的辅酶再生活性，其中负载在非金属半导体c3n4上的双金属催化剂对辅酶的再生效率能够达到60％，金属氧化物负载的双金属催化剂具有更好的辅酶再生活性，如负载在氧化镁、氧化钛以及氧化锆上的金-钯双金属纳米催化剂对辅酶的再生效率均在90％以上。以上结果表明，负载型双金属催化剂对辅酶的在生活性比单金属催化剂高，同时金属氧化物更适合作为双金属催化剂的载体。

实施例2：340nm紫外吸收法与mtt法检测的负载型双金属纳米催化剂再生的nad(p)h浓度

在2ml含有0.5mmol/l氧化型辅酶nad(p)⁺和200mmol/l三乙醇胺的缓冲液中加入5mg负载型金-钯双金属纳米催化剂，使得催化剂的工作浓度为2.5mg/ml，控制温度25℃，600rpm搅拌240min，利用340nm紫外吸收法检测反应体系中还原型辅酶nad(p)h的总量；利用mtt法检测反应体系中具有电子转移活性的1,4-nad(p)h的浓度，结果如图2所示。

对比图2中340nm紫外吸收法与mtt法检测的负载型双金属纳米催化剂再生的nad(p)h结果可知，负载型金-钯双金属纳米催化剂对nad⁺和其磷酸化的nadp⁺均具有很好的还原活性，这表明磷酸化并不影响催化剂对氧化型辅酶的还原；并且采用mtt法测定的具有电子转移活性的还原型辅酶浓度与340nm紫外吸收法测定的还原型辅酶总浓度是一致的，这说明负载型双金属纳米催化剂再生的辅酶是具有电子转移活性的1,4-nad(p)h。

实施例3：负载型双金属纳米催化剂在不同电子供体体系中通过一步法和两步法再生nadph

一步法再生辅酶：在2ml含有0.5mmol/l氧化型辅酶nadp⁺和电子供体的缓冲液中加入5mg负载型金-钯双金属纳米催化剂，控制温度25℃，600rpm搅拌240min，利用340nm紫外吸收法检测反应体系中还原型辅酶nadph的浓度，结果如表1所示。

两步法再生辅酶：首先在1.8ml含有200mmol/l电子供体的缓冲液中加入5mg负载型金-钯双金属纳米催化剂(催化剂的工作浓度为2.78mg/ml)，混合均匀，控制温度25℃，600rpm搅拌240min后12000rpm离心弃掉催化剂，然后在上清液中加入氧化型辅酶nadp⁺，使得2ml体系中nadp⁺的工作浓度为0.5mmol/l,控制温度25℃，600rpm再搅拌240min，利用340nm紫外吸收法检测反应体系中还原型辅酶nadph的浓度，结果如表1所示。

对比表1中不同电子供体对负载型双金属催化剂再生nadph的结果可以看出，在没有有机电子供体的体系中，负载型金钯双金属纳米催化剂对nadph的再生效率最低，只有0.74％，几乎可以忽略不计。而不同有机电子供体体系中辅酶的再生效率差异性很大，这和不同电子供体给电子活性的强弱相关。其中有机酸、醇如甲酸、乙酸、乙醇等虽然能够给电子实现辅酶再生，但给电子能力过低，辅酶再生效率不足10％，而碱性电子供体三乙醇胺、乙醇胺、三乙胺具有较好的电子供体活性，负载型金钯双金属纳米催化剂利用这三种碱性电子供体在一锅法和两锅法操作再生辅酶的过程中具有较好的辅酶再生效率，特别是三乙醇胺电子供体的负载型双金属催化剂对nadph再生效率能够达到97％以上。

表1

实施例4：

在2ml含有0.5mmol/l氧化型辅酶nadp⁺和200mmol/l三乙醇胺的缓冲液中加入5mg负载型金-钯双金属纳米催化剂，控制温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃，600rpm搅拌60min，利用340nm紫外吸收法检测反应体系中还原型辅酶nad(p)h的浓度，结果如图3所示。

对比图3可知，随着温度的升高，负载型双金属纳米催化剂对nadph的再生活性先增加后减小，在37℃时催化剂对辅酶的再生速率最快，再生效率最高，之后温度再升高时可能使得辅酶的热稳定性变差从而导致辅酶再生效率下降。为了节省外界能量输入，可以采用在室温进行辅酶再生，通过延长辅酶再生时间至240min，同样能够获得高的还原型辅酶收率。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。