α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及应用。

背景技术：

2’-岩藻糖基乳糖是一种新型稀有母乳寡糖，具有选择性刺激肠道益生菌的生长，阻止病原菌对小肠上皮细胞的粘附从而保护婴幼儿肠道健康，提高免疫系统等生理功能。目前2’-岩藻糖基乳糖已经被欧盟，fda等批准为婴幼儿奶粉添加剂，具有广阔的应用前景。

α-1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltransferase,fuct)是催化合成2’-岩藻糖基乳糖的关键酶，负责将供体gdp-l-岩藻糖转移到受体分子乳糖。虽然已经有报道多条α-1,2-岩藻糖基转移酶。但是大多数α-1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌中可溶性表达量很低，限制了大规模合成2’-岩藻糖基乳糖。寻找可溶性表达及酶活较高α-1,2-岩藻糖基转移酶，也是提高2’-岩藻糖基乳糖产量的重要手段。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，本发明的目的之二在于提供一种编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，本发明的目的之四在于提供一种重组表达载体的构建方法，本发明目的之五在于提供一种基因工程菌，本发明的目的之六在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶在催化gdp-l-岩藻糖形成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列如seqidno.1所示。

2、一种编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

3、一种重组表达载体，所述载体包含所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列。

4、一种重组表达载体的构建方法，所述方法为，以菌株kosakoniasp.zx03cctccm2018092为模板，用上、下游引物扩增编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，再与表达载体连接，得到重组表达载体，所述上游引物核苷酸序列为seqidno.5，所述下游引物核苷酸序列为seqidno.6。

作为优选的技术方案之一，所述载体的结构骨架为pet21c。

5、一种基因工程菌，所述基因工程菌由所述重组表达载体转化至宿主细胞中获得。

6、利用α-1,2-岩藻糖基转移酶在催化gdp-l-岩藻糖形成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

有益效果：

本发明发现了一种新的α-1,2-岩藻糖基转移酶，具有催化gdp-fucose产生岩藻糖基乳糖的能力，为岩藻糖基转移酶的酶库提供新的选择，并为岩藻糖基转移酶定向进化提供新的起点。

生物材料保藏

菌株kosakoniasp.zx03于2018年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为cctccm2018092。

附图说明

图1为不同α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白同源性比对；

图2为pet-fkp质粒构建图；

图3为质粒构建电泳图，a为pet-futcks质粒构建图，b为pet-futcks-fkp质粒构建图；

图4为pet-futcks-fkp质粒构建图谱；

图5为futcks蛋白电泳图，t为菌液全蛋白，s为上清，i为沉淀；

图6为重组菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的液相检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

α-1,2-岩藻糖基转移酶的发现

(1)α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白同源性比对

将幽门螺旋杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶futc的蛋白序列与菌株kosakoniasp.zx03cctccm2018092的蛋白序列进行blastp比对分析。结果如表1所示，菌株kosakoniasp.zx03cctccm2018092基因组存在与futc蛋白序列相似度为29.642％的蛋白序列，将其命名为futcks，氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示，这条蛋白序列与进行比对的序列同源性并不高，但是它的e值以及得分非常高，表明这条蛋白可能是α-1,2-岩藻糖基转移酶。

表1α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白比对结果

(2)α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白核心基序比对

不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶的同源性都存在较低的同源性，而这些α-1,2-岩藻糖基转移酶只要有共同的催化基序就可以行使α-1,2-岩藻糖基转移酶的功能，进一步对futcks蛋白序列与已经报道的α-1,2-岩藻糖基转移酶利用geneious比对分析，结果如图1所示，futcks蛋白序列与文献报道的α-1,2-岩藻糖基转移酶有着共同的基序，这也表明futcks蛋白序列可能具有α-1,2-岩藻糖基转移酶的活性。

实施例2

α-1,2-岩藻糖基转移酶质粒构建

(1)构建pet-fkp、pet-futcks与pet-futcks-fkp质粒

利用岩藻糖经补救途径合成gdp-岩藻糖是一种产生岩藻糖供体的有效方式，这一步骤需要l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化酶双功能酶基因(fkp)的参与，因此，构建fkp与futcks两个基因同时表达的质粒。

由江苏金唯智生物经过密码子优化后合成，用引物fkp-f(seqidno.3)和fkp-r(seqidno.4)扩增fkp基因，

pcr体系：

pcr程序：

获得pcr产物经过天根琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(增强型)纯化后，与经过ndei和saci双酶切的pet21c连接，构建pet-fkp质粒，构建结果如图2所示。

用引物futcks-f(seqidno.5)和futcks-r(seqidno.6)扩增futcks基因，

pcr体系：

pcr程序：

获得pcr产物经过天根琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(增强型)纯化后，与经过ndei和saci双酶切的pet21c连接，构建pet-futcks质粒，结果如图3中a、b所示，菌落pcr结果显示，成功构建pet-futcks质粒(图3中a)，双酶切结果也显示pet-futcks质粒条带大小正确(图3中b)。将构建成功的质粒pet-futcks与pet-fkp通过同尾酶连接biobrick的方法连接起来，构建pet-futcks-fkp，构建图谱如图4所示。

pet-futcks酶切体系：

pet-fkp酶切体系：

获得酶切产物经过天根琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(增强型)纯化后，用t4连接酶(newenglandbiolabs，m0202v)连接，反应条件：1×t4dna连接酶反应缓冲液中，加入1μldnaligase，双酶切的pet-futck的质粒加入1.5μl，双酶切的fkp片段加入3.5μl，用水补足20μl，16℃过夜连接，转化进入dh10b感受态细胞中，在carb抗性平板上进行转化子筛选。

fkp-f：taagaaggagatatacatatgcagaaactgctcagtctg(seqidno.3)；

fkp-r：gcaagcttgtcgacggagctcactagtttaactacggctaacttggaaac(seqidno.4)；

futcks-f：taagaaggagatatacatatgatcgttagattatcaggtgg(seqidno.5)；

futcks-r：gcaagcttgtcgacggagctcactagtttacagcttaatccagccatc(seqidno.6)；

t7promoter-f：taatacgactcactatagggg(seqidno.7)；

t7terminator-r：gctagttattgctcagcgg(seqidno.8)；

(2)重组质粒在大肠杆菌jm109(de3)中的表达

将构建成功的质粒pet-futcks，pet-futcks-fkp，分别转入大肠杆菌中jm109(de3)宿主中，挑选单菌落于37℃，220rpm过夜培养。第二天以1％的接种量转接到30mltb培养基中，37℃，220rpm培养至菌液od600＝0.6左右时，冰上静止10-15min后加入终浓度为0.1mm的iptg，置于25℃，220rpm培养条件下，sds-page检测基因的蛋白表达水平。结果如图5所示，sds-page结果表明，pet-futcks-fkp重组质粒所表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶futcks在大肠杆菌宿主中有很好的可溶性表达。

实施例3

pet-futcks-fkp重组表达蛋白在2’-岩藻糖基乳糖合成中的应用

通过对补救途径质粒pet-futcks-fkp进行摇瓶发酵实验，验证pet-futcks-fkp重组质粒所表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶futcks是否具有催化gdp-l-岩藻糖形成2’-岩藻糖基乳糖的功能。具体方法如下：

构建成功的pet-futcks-fkp质粒转入大肠杆菌jm109(de3)宿主菌中，挑选单菌落接种到tb液体培养基37℃，220rpm过夜培养。以1％接种量接种到10ml含有1％甘油tb发酵培养基，37℃，220rpm培养培养至od＝0.6左右，冰上静止10-15min，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导目的基因的表达，同时加入0.5％l-岩藻糖，0.6％乳糖。25℃，220rpm发酵48h，hplc检测2’-岩藻糖基乳糖产量。取1ml发酵液，设置超声功率350w，超声时间超3s，停7s，时间10min。12000rpm离心20min。采用示差检测器(bensoncarbohydratecolumnbp-800)检测2’-岩藻糖基乳糖，检测条件：pb++色谱柱，流动相为纯水，流速0.8ml/min，柱温80℃。

结果如图6所示，摇瓶发酵结果显示产生580mg/l的2’-岩藻糖基乳糖，说明补救途径质粒pet-futcks-fkp能够产生2’-岩藻糖基乳糖，表明pet-futcks-fkp重组质粒所表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶futcks具有催化功能，这是一种新的α-1,2-岩藻糖基转移酶。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>西南大学

<120>α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>298

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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