单核苷酸多态性rs1553607744在检测着色性干皮病基因中的应用的制作方法

本发明涉及单核苷酸多态性rs1553607744在检测着色性干皮病基因中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

着色性干皮病(xerodermapigmentosum，xp)是一种常染色体隐性遗传疾病。患者临床表现症状多样，以皮肤、眼、神经系统改变最为常见。典型临床表现为皮肤对日光高度敏感、皮肤色素沉着、暴露部位皮肤易发生光损伤和皮肤癌变。皮肤损害通常出现于6个月～3岁，好发于面部、颈部、前臂伸侧等曝光部位。早期皮损可见雀斑样改变、水疱、色素脱失、皮肤干燥、萎缩或瘢痕形成，后期逐渐出现多发性日光角化病，角化棘皮瘤及多种皮肤恶性肿瘤。着色性干皮病患者患皮肤癌的概率约为正常人的1000倍，几乎90％的患者会在十多岁发生基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等皮肤癌。

紫外线照射可诱发dna损伤，dna损伤和基因结构异常所致的癌基因和抑癌基因表达或功能上的异常，是细胞恶性转化的前提。dna损伤主要通过修复系统(核苷酸切除修复和转位合成)完成。dna修复在修复dna损伤、维持细胞遗传稳定性中起重要作用，对预防皮肤癌至关重要。核酸切除修复最重要的功能是修复由紫外线照射引起的光产物、致癌原引起的庞大化合物以及化疗药物产生的dna交联。通常情况下核苷酸切除修复包括整组修复及转录偶联修复，其中，整组修复可修复整基因组范围内的损伤。核酸切除修复过程包括dna损伤识别、损伤周围dna链开放、dna酶切、合成新的互补dna链和连接。dna切除修复系统相关基因缺陷是着色性干皮病的主要病因，当紫外线诱导dna损伤后，修复系统障碍，导致疾病发生。

有8种基因与着色性干皮病相关：xpa、xpb、xpc、xpd、xpe、xpf、xpg和xpv，目前我国报道的患者多为xpc(着色性干皮病基因组c)型，xpc基因缺陷与着色性干皮病色素型相关，并易发生皮肤肿瘤。xpc基因位于3号染色体(3p25)，由16个外显子组成，长约17kb，其编码核苷酸切除修复复合物中的dna损伤结合蛋白，对识别和结合dna光产物非常重要，是xpc复合物(xpc-hhr23b)的重要组成部分。该复合物是整组修复最初的识别因子，在泛基因组核酸切除修复的早期阶段识别并结合损伤dna，启动dna修复功能，维持细胞的遗传稳定性。xpc蛋白水平表达的高低是影响细胞损伤识别的关键因子之一。

在omim数据库中已在xpc基因编码区发现多个单核苷酸多态性位点与着色性干皮病相关，虽然其遗传流行病学取得了一些研究进展，但仍有许多患者的致病基因或突变尚未鉴定出来。

技术实现要素：

本发明的目的在于单核苷酸多态性rs1553607744在着色性干皮病检测产品方面的新用途。

本发明所述新用途主要包括：

(1)检测xpc基因中rs1553607744的多态性或基因型的物质在制备检测与着色性干皮病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

(2)检测xpc基因中rs1553607744的多态性或基因型的物质在制备鉴定或者辅助鉴定与着色性干皮病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

(3)检测xpc基因中rs1553607744的多态性或基因型的物质在制备筛查着色性干皮病产品中的应用。

(4)检测xpc基因中rs1553607744的多态性或基因型的物质在制备治疗着色性干皮病产品中的应用。

(5)xpc基因中的单核苷酸多态性在制备检测着色性干皮病产品中的应用，所述单核苷酸多态性是refsnpid为rs1553607744的dna序列多态性。

(6)xpc基因中的单核苷酸多态性在制备鉴定或者辅助鉴定着色性干皮病基因的产品中的应用：所述单核苷酸多态性是refsnpid为rs1553607744的dna序列多态性。

(7)xpc基因中rs1553607744的多态性在制备筛查着色性干皮病产品中的应用。

(8)xpc基因中rs1553607744的多态性在制备产前筛查着色性干皮病产品中的应用。

(9)含有检测xpc基因中rs1553607744的多态性的物质的产品，包括以下任意一种产品：

检测与着色性干皮病相关的单核苷酸多态性的产品；

鉴定或辅助鉴定与着色性干皮病相关的单核苷酸多态性的产品；

筛查着色性干皮病患者产品；

制备着色性干皮病治疗性产品。

本发明所述检测xpc基因中rs1553607744的多态性的物质含有扩增包括rs1553607744在内的基因组dna片段的pcr引物。

在本发明的实施例中，所述着色性干皮病具体为中国汉族着色性干皮病家系。

位点rs1553607744是人类3号染色体上的一个二等位多态性的snp位点(grch37.p13chr3nc_000003.11:g.14214366c>t)；基因组dna上rs1553607744位点位于xpc基因第2外显子最后一个碱基299位后面内含子的第一个碱基(nm_004628:exon2:c.299+1g>a)，位于剪切区；位点rs1553607744的变异是置换(c/t，在其互补链上则为g/a)；所述rs1553607744基因型是cc、ct或tt；所述cc是rs1553607744位点的野生纯合型，所述ct是rs1553607744位点的突变杂合型，所述tt是rs1553607744位点的突变纯合型。

本发明通过对患者基因的全外显子组测序分析、突变的剪切位点对xpc基因mrna转录本的影响、xpc蛋白的表达情况等方面的研究，证明了rs1553607744的多态性与着色性干皮病相关。

本发明的有益效果：本发明通过对着色性干皮病家系进行外显子测序、dna及转录本sanger测序分析、免疫印迹分析，鉴定了着色性干皮病基因组c--xpc基因上一个致病的单核苷酸变异位点rs1553607744。该变异位点定位于xpc基因2号外显子后的内含子区内，具有选择性剪切功能，与该基因的截短转录本、提前终止的蛋白相关。

实验证明，rs1553607744的c碱基置换为t与xpc基因转录的截短型转录本相关，该截短型转录本是xpc基因第二外显子序列上一段68个碱基片段的缺失所致(nm_004628.5:c.265_332del)；该截短型转录本可影响xpc的蛋白表达，序列缺失使其在第2外显子上产生了提前终止密码子，xpc蛋白翻译提前终止，xpc蛋白缺陷可致着色性干皮病发生。

针对该其编码区序列设计诊断引物，发明检测试剂盒应用于pcr体外扩增dna，结合sanger测序，检测着色性干皮病xpc基因rs1553607744位点的基因分型，可应用于疾病临床基因诊断及孕早期筛查等应用。rs1553607744位点的隐性纯合突变型(tt)可通过影响选择性剪切功能，产生截短的转录本，并在第2外显子翻译时产生提前终止密码子，导致xpc蛋白缺陷，致着色性干皮病。rs1553607744位点的杂合突变型ct可与其他xpc上影响xpc蛋白表达及功能的杂合型突变共同组成复合杂合突变，而导致着色性干皮病发生；因此，可以将检测该新位点的物质及其他位点(如实施例1中的rs121965088)联合用于检测着色性干皮病。

附图说明

图1为着色性干皮病患者家系图；

图2xp家系个体3号染色体上xpc基因rs121965088的sanger测序结果；

图3xp家系个体3号染色体上xpc基因rs1553607744的sanger测序结果；

图4xp家系个体外周血白细胞逆转录的cdna扩增的含rs1553607744位点的pcr产物电泳图谱；

图5xp家系个体外周血白细胞逆转录的cdna扩增的含rs1553607744位点的pcr产物的sanger测序结果；

图6xp家系及健康对照的xpc蛋白的蛋白印迹结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中所有患者及健康对照者均签署了知情同意书。

实施例1

一、xpc基因上的2个突变位点的发现过程：

患儿(ⅱ:2)自出生8个月开始，面部反复出现多发雀斑样色素沉着斑；经检查，其面部、颈前等曝光部位可见密集分布的褐色雀斑样色素沉着斑疹，全身皮肤干燥；其姐姐(ⅱ:1)10岁，临床特征也与相似，且其右侧鼻部有一个0.5cm×1cm的色素沉着结节，经皮肤活检，该色素沉着结节为基底细胞癌；父母(ⅰ:1，ⅰ:2)健康，无类似临床表现。根据儿童早期出现光过敏，雀斑样疹，并逐渐出现皮肤肿瘤等临床表现，临床诊断着色性干皮病，家系图如图1所示。

为了检测该家系患者的遗传突变，本发明对该家系进行了全外显子测序分析及系列相关实验分析。

二、全外显子测序分析

逐一提取家系个体外周血的基因组dna，标准化后，采用液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域dna进行高效富集，构建的文库库检合格后，进行高通量测序。下机的测序数据经质量评估后，在grch37/hg19的参考基因组下，进行变异检测、变异筛选及与着色性干皮病相关性的预测。由于该家系符合隐性遗传病的模式，其致病变异一般是来自父母双方的纯合或者复合杂合变异。基于孟德尔隐性遗传疾病模式，本发明对该家系4个样本的突变进行筛选，包括来自父母双的基因纯合变异以及复合杂合变异；结果发现该家系没有符合隐性遗传模式的基因纯合变异，但筛选到了2个位于xpc基因的基因复合杂合变异，如表1所示。

表1为2个位于xpc基因的基因复合杂合变异

三、sanger测序验证家系中xpc基因上的2个杂合突变位点

rs121965088是人类3号染色体上的一个二等位多态性的snp位点(grch37.p13chr3,nc_000003.11:g.14199648g>a)；该变异是置换(g/a，在其互补链上则为c/t)。所述rs121965088基因型是gg、ga或aa；所述gg是rs121965088位点的野生纯合型，所述ga是rs121965088位点的突变杂合型，所述aa是rs121965088位点的突变纯合型；基因组dna上rs121965088主要等位基因g置换为次要等位基因a，可导致xpc基因转录的cdna上第9外显子1735位c碱基置换为t，导致xpc编码蛋白上第579氨基酸arg突变为终止密码子(xpc:nm_004628:exon9:c.c1735t:p.r579x2)；在隐性遗传的着色性干皮病中，突变纯合型aa是rs121965088位点是着色性干皮病的致病基因型。

为了验证基因组dna上rs121965088位点的突变，本发明设计了覆盖该位点所在dna片段的特异性引物扩增。引物序列为rs121965088-f：acctgggctcaagcaccg(序列表中序列1)；rs121965088-r：gtgggagccatcgtaaggac(序列表中序列2)，产物大小631碱基。分别以家系中4个成员的基因组dna为模板，进行聚合酶链式反应(pcr)扩增，扩增条件如表2；将前述pcr反应产物经纯化后进行sanger测序得到序列，将前述序列与xpc基因标准序列比对，确定rs121965088位点的基因型。

结果发现家系中健康个体ⅰ:1，患者ⅱ:1及ⅱ:2其rs121965088位点基因型均为杂合突变型(ga)，家系中健康个体ⅰ:1该位点的基因型为野生纯合型(gg)，如图2所示。rs121965088位点的杂合突变型并不能直接致病，为此，本发明继续检测了xpc上的另一个突变位点。

表2为pcr扩增过程的条件

为了验证rs1553607744在家系个体中的基因分型，本发明设计了覆盖该位点所在dna片段的特异性引物扩增；引物序列为rs1553607744-f：cgtgcttgggacagtaagtatgag(序列表中序列1)；rs1553607744-r：cctcaccttatgttctgtgttgtc(序列表中序列2)；产物大小578碱基。分别以家系中4个成员的基因组dna为模板，进行pcr扩增及sanger测序，序列比对后确定rs1553607744位点在不同个体中的基因分型。结果发现家系中ⅰ:2，ⅱ:1及ⅱ:2为杂合突变型ct，家系中i:1为野生纯合型cc，如图3所示。该位点预测为剪切位点区域变异，然而，目前基因组上rs1553607744位点突变对xpc基因转录本、xpc蛋白及着色性干皮病的影响未知。

四、分析剪切区位点突变rs1553607744对xpc基因mrna转录本的影响

为了分析位于剪切区的rs1553607744(nm_004628:exon2:c.299+1g>a)位点突变对xpc基因mrna转录本的影响。本发明逐一分离了该家系4个个体的外周血白细胞，提取其总rna后，逆转为cdna，利用覆盖xpcmrna第2外显子的引物进行pcr扩增(xpc-cdna-f:agccagaaatccaaggccaa(序列表中序列3)；xpc-cdna-r:gtgaaccttgtgtgtgtcctc(序列表中序列4))，野生型转录本扩增产物预期大小为575bp。将扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，如图4所示，结果发现携带剪切位点突变的家系个体ⅰ:2，ⅱ:1及ⅱ:2中该基因编码的mrna的扩增产物除预期大小的条带外，还有一个大小约500bp的条带产生；而家系ⅰ:1个体及非家系的健康对照个体(nc)只扩增出一条预期大小的条带，无其他转录本条带；结果提示ⅰ:2，ⅱ:1及ⅱ:2携带的rs1553607744突变杂合型产生了一个截短型的xpc转录本。

五、sanger测序分析剪切区位点突变rs1553607744产生的xpc截短型转录本的序列

为了分析突变剪切rs1553607744产生的截短型xpc转录本的序列缺失情况，将上述家系4个个体外周血白细胞提取总rna，逆转为cdna后，利用上述引物即xpc-cdna-f:agccagaaatccaaggccaa(序列表中序列3)；xpc-cdna-r:gtgaaccttgtgtgtgtcctc(序列表中序列4)扩增的pcr产物进行t载体连接后，送克隆进行sanger测序分析；测序样品包括ⅰ:1，ⅰ:2，ⅱ:1及ⅱ:2；每个样品均做了5个克隆以上的测序鉴定，如图5所示；结果显示ⅰ:2，ⅱ:1及ⅱ:2三个样品中，xpc基因第二外显子序列有68个碱基片段的缺失(nm_004628.5:c.265_332del)；家系中ⅰ:1的xpc扩增产物为野生型，无序列缺失现象。为了进一步明确该转录本上此碱基片段的缺失对氨基酸及蛋白编码的影响，本发明分析了截短型xpc转录本的读码框，发现序列缺失导致提前终止密码子产生，可致xpc蛋白翻译提前终止。

六、检测家系个体xpc蛋白的表达情况

由于该家系患者ⅱ:1及ⅱ:2并未携带上述rs121965088位点或rs1553607744位点的纯合型突变，而是分别携带了来源于父本的rs121965088位点的杂合突变型ga以及来源于母本的rs1553607744杂合突变型ct。复合杂合突变是否影响了患者xpc蛋白的表达。为了检测家系个体中xpc蛋白的表达情况，本发明利用个体样本的外周血白细胞开展了xpc蛋白的蛋白印迹检测；本发明提取了家系个体外周血白细胞的总蛋白，利用westernblot检测xpc蛋白的表达，以β-actin作为内参，如图6所示，结果显示：与正常个体相比，xpc蛋白在携带复合杂合突变的ⅱ:1及ⅱ:2中几乎无表达；xpc蛋白在仅携带杂合剪切突变的ⅰ:2样本中有少量表达；xpc蛋白在携带9号外显子杂合突变型的ⅰ:1样本中有所减少。该家系位于xpc基因上rs121965088的杂合突变xpc:nm_004628:exon9:c.c1735t:p.r579x2导致了转录本第9外显子上提前终止密码子的产生，家系中ⅱ:1及ⅱ:2的此突变来源于ⅰ:1；位于xpc基因的nm_004628:exon2:c.299+1g>a杂合突变导致了xpc基因转录本第2外显子上提前终止密码子的产生，家系中ⅱ:1及ⅱ:2的此突变来源于ⅰ:2。该家系中患者位于dna损伤修复基因xpc上的2个复合杂合突变导致蛋白表达缺失；紫外线诱导dna损伤后，修复系统障碍导致家系中患者发生疾病。

综上所述，rs1553607744位点的纯合突变型(tt)可通过选择性剪切，产生转录截短的mrna，导致蛋白的提前终止，造成xpc蛋白缺陷。xpc表达缺失使得紫外线所致的dna损伤无法被xpc复合物识别和结合，影响核苷酸切除修复功能，从而引发着色性干皮病。

总结性分析：rs1553607744位点隐性纯合突变型(tt)可通过影响选择性剪切功能，产生68个碱基片段缺失的转录本，并在第2外显子翻译时产生提前终止密码子，导致xpc蛋白缺陷，致着色性干皮病。此外，rs1553607744位点的杂合突变型(ct)也可与其他影响xpc蛋白的杂合型突变位点组成复合杂合突变，导致xpc蛋白缺陷，核苷酸切除修复功能受损而致着色性干皮病。

序列表

<110>昆明医科大学第一附属医院

<120>单核苷酸多态性rs1553607744在检测着色性干皮病基因中的应用

<130>2020.12.30

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>单核苷酸多态性(xerodermapigmentosum，xp)

<400>1

gtgaaccttgtgtgtgtcctc21

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>单核苷酸多态性(xerodermapigmentosum，xp)

<400>2

cgtgcttgggacagtaagtatgag24

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>单核苷酸多态性(xerodermapigmentosum，xp)

<400>3

agccagaaatccaaggccaa20

<210>4

<211>20

<212>rna

<213>单核苷酸多态性(xerodermapigmentosum，xp)

<400>4

gtgaaccttgtgtgtgtcctc21