抗bag2抗体和治疗癌症的方法1.发明背景1.
技术领域：
：：2.本公开涉及一种特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。本技术还涉及一种使用本发明组合物的抗癌治疗剂。3.2.一般背景和现有技术：4.共伴侣蛋白bcl-2相关永生基因(bag)蛋白家族介导包括细胞内蛋白折叠、应激反应、神经元分化、细胞凋亡和细胞增殖在内多种生理过程，并且在功能上与各种协同蛋白结合。bag2(具有抗细胞凋亡活性的bag结构域家族成员之一)是hsc70相互作用蛋白(chip)的c末端的负调控因子，其是伴侣蛋白相关的泛素连接酶。bag2在通过抑制chip活性调控蛋白质中的主要作用是通过稳定伴侣蛋白相关蛋白质(如pink1和cftr)而与神经变性疾病和常染色体隐性遗传疾病相关。据报告，bag2以使得bag2的表达增加蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡的方式具有促凋亡活性，并且当甲状腺癌细胞暴露于蛋白酶体抑制剂mg132中时，bag2敲低可部分抑制细胞凋亡。除了bag2-hsp70复合物的形成外，bag蛋白在功能上与多种结合配偶体相互作用，并且调控各种细胞过程，如应激信号传导、细胞分裂、细胞凋亡和细胞分化。还据报告，在各种突变型k-ras诱导的肿瘤中，bag2的过表达促进强效肿瘤基因stk33蛋白的稳定化，从而促进肿瘤的发展。此外，提出bag2蛋白的表达和定位可根据乳腺癌进展或转移过程中癌细胞的组织病理学和分子遗传病理学而变化。发现bag2蛋白在肿瘤发生过程中通过与组织蛋白酶b(其是蛋白质降解酶)相互作用而分泌到细胞外，并且证实bag2蛋白的丧失完全抑制乳腺癌动物模型中的癌症形成以及向肺的转移。因此，bag2抑制剂的开发将有助于癌症患者的治疗和存活。5.然而，尽管有这些发现，但bag2在癌症进展和转移中的作用尚不清楚。此外，尚未对bag2单克隆抗体进行具体研究。因此，需要开发特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。技术实现要素：6.通过对本发明的以下描述、所附参考附图和所附权利要求书，将能更全面地了解本发明的这些和其他目的。7.一个方面提供了特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。8.另一个方面提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。9.另一个方面提供了包含多所述核苷酸的宿主细胞。10.另一个方面提供了产生所述抗体或其抗原结合片段的方法。11.另外的方面将部分地在下文描述中被阐述，部分地将从说明书中显而易见或者可通过实践所呈现的本公开的实施方式学习到。12.一个方面提供了特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。13.bag2多肽可源自哺乳动物。所述哺乳动物可以是人(智人)、小鼠(小家鼠)、猴、牛或马。bag2可包含seqidno:69的氨基酸序列。seqidno:69的氨基酸序列是对应于ncbi参考seqidno:nm_004282.4的序列。bag2蛋白包含与seqidno:69的氨基酸序列具有生物等效活性的变体，尽管它们的氨基酸序列可能与seqidno:69的氨基酸序列不匹配。bag2多肽可包含与seqidno:69的序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。bag2蛋白可以是具有除了至少一个氨基酸残基、至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基、至少六个氨基酸残基或至少七个氨基酸残基之外与seqidno:69相同的序列的多肽。在本说明书中，“多肽”可与“蛋白质”互换使用。14.抗体是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。抗体是指特异性地结合至bag2多肽或其片段的多肽或多肽组合。抗体可包括多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，如scfv片段、双抗体、单链抗体等，并且包括所有免疫球蛋白抗体。抗体可包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式的抗体，并且还可包括其抗体分子的这样的功能片段，所述功能片段由于包含特异性抗原结合位点(即结合结构域)而保留抗原结合功能，尽管不存在具有两条轻链和两条重链的完整形式的完整抗体的结构。15.所述抗原结合片段是免疫球蛋白的整个结构的片段，并且是指所述多肽的包含能够与抗原结合的部分的部分。例如，其抗原结合片段可以是scfv、(scfv)2、fv、fab、fab'、fvf(ab')2或其组合。16.存在五种重链γ、δ、α、μ和ε，并且重链可决定抗体的类型。α和γ各自包括450个氨基酸，并且μ和ε各自包含550个氨基酸。重链具有两个区域，即可变区和恒定区。17.存在两种轻链κ和λ，并且可包括约211个氨基酸至约217个氨基酸。轻链可具有恒定区和可变区。18.所述抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区(所述重链可变区包含由seqidno:33的氨基酸序列组成的互补决定区(vh-cdr)1、由seqidno:39的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:45的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:51的氨基酸序列组成的互补决定区(vl-cdr)1、由seqidno:57的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:63的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；重链可变区(所述重链可变区包含由seqidno:34的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seqidno:40的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:46的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:52的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seqidno:58的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:64的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；重链可变区(所述重链可变区包含由seqidno:35的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seqidno:41的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:47的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:53的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seqidno:59的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:65的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；重链可变区(所述重链可变区包含seqidno:36的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seqidno:42的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:48的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:54的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seqidno:60的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:66的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；重链可变区(所述重链可变区包含由seqidno:37的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seqidno:43的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:49的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:55的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seqidno:61的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:67的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；重链可变区(所述重链可变区包含由seqidno:38的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seqidno:44的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seqidno:50的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seqidno:56的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seqidno:62的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seqidno:68的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；或它们的组合。19.seqidno:39中的第6个和第7个xaa可以是甘氨酸(gly)或丙氨酸(ala)。seqidno:35中的第二个xaa可以是酪氨酸(tyr)或组氨酸(his)。seqidno:41中的第8个xaa可以是丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)。seqidno:47中的第12个xaa可以是酪氨酸(tyr)或组氨酸(his)。seqidno:53中的第三个xaa可以是甲硫氨酸(met)或异亮氨酸(lie)。seqidno:59中的第二个xaa可以是ala或ser。20.所述抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区，所述重链可变区包含选自seqidno:21至26中任一个的氨基酸序列；轻链可变区，所述轻链可变区包含选自seqidno:27至32中任一个的氨基酸序列；或所述重链可变区和所述轻链可变区。21.所述抗体或其抗原结合片段可包含seqidno:21的重链可变区和seqidno:27的轻链可变区；seqidno:22的重链可变区和seqidno:28的轻链可变区；seqidno:23的重链可变区和seqidno:29的轻链可变区；seqidno:24的重链可变区和seqidno:30的轻链可变区；seqidno:25的重链可变区和seqidno:31的轻链可变区；或seqidno:26的重链可变区和seqidno:32的轻链可变区；或它们的组合。22.seqidno:21中的第56个xaa和第57个xaa可各自是gly或ala。在seqidno:23中，第1个xaa可以是谷氨酰胺(gin)或谷氨酸(glu)，第7个xaa可以是ser或脯氨酸(pro)，第12个xaa可以是缬氨酸(val)或丙氨酸(ala)，第27个xaa可以是tyr或his，第58个xaa可以是ser或thr，第61个xaa可以是天冬酰胺(asn)或ser，第74个xaa可以是精氨酸(arg)或赖氨酸(lys)，第83个xaa可以是苯丙氨酸(phe)或亮氨酸(leu)，第92个xaa可以是gly或ala，并且第108个xaa可以是his或tyr。seqidno:27中的第53个xaa可以是lie或phe。在seqidno:29中，第23个xaa可以是met或lie，第45个xaa可以是ala或ser，并且第73个xaa可以是glu或天冬氨酸(asp)，并且第100个xaa可以是met或lie。23.所述抗体或其抗原结合片段包括多种抗体或其抗原结合片段，并且可以是选自第1组中的一者和第2组中的一者；第1组中的一者和第3组中的一者；和第2组中的一者和第3组中的一者的抗体的组合。第1组可以是结合至bag2蛋白的中间区域的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含seqidno:21的vh和seqidno:27的vl，以及seqidno:22的vh和seqidno:28的vl。第2组可以是结合至bag2蛋白的n末端的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含seqidno:23的vh和seqidno:29的vl，以及seqidno:24的vh和seqidno:30的vl。第3组可以是结合至bag2蛋白的c末端的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含seqidno:25的vh和seqidno:31的vl，以及seqidno:26的vh和seqidno:32的vl。24.所述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体。25.所述抗体或其抗原结合片段可用可检测标记或能够发出可检测信号的标记进行了标记。所述标记是指与抗体直接或间接缀合以产生标记的抗体或其抗原结合片段的可检测化合物或组合物。所述标记本身可以是可检测的并且催化可检测底物化合物或组合物的化学修饰。26.所述标记可以是免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、放射性标记、表位标签、亲和素/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒、磁性颗粒、生色团标记、ecl标记、酶等。27.所述抗体或其抗原结合片段可由选自以登录号kctc137378p、kctc137388p、kctc137398p、kctc137408p、kctc137418p、kctc137428p、kctc137438p、kctc137448p、kctc137458p和kctc137468p保藏的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞产生。28.所述杂交瘤细胞是指通过两种细胞的人工融合而产生的具有致瘤性的杂交细胞，并且一般来说，可用于通过使从免疫受试者分离的b细胞和浆细胞瘤细胞融合来连续产生抗体。所述杂交瘤细胞在本文中也可称为杂交细胞或融合细胞。29.本发明人鉴定出了抗bag2抗体，所述抗体包含seqidno:21的vh和seqidno:27的vl(2a11、4c2、8c4)；seqidno:22的vh和seqidno:28的vl(3b5)；seqidno:23的vh和seqidno:29的vl(9b3、9b12、3b10)；seqidno:24的vh和seqidno:30的vl(10h7)；seqidno:25的vh和seqidno:31的vl(3g8)；以及seqidno:26的vh和seqidno:32的vl(3f12)；以及产生所述抗体的杂交瘤细胞。经证实，所鉴定的抗bag2抗体在乳腺癌细胞中显示出抗原-抗体反应。30.另一个方面提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。31.所述多核苷酸可以是选自由编码重链可变区的seqidno:1至10组成的组的任一个核苷酸序列和选自由编码轻链可变区的seqidno:11至20组成的组的任一个核苷酸序列。32.所述多核苷酸可以是载体。可通过使所述多核苷酸在细胞中复制和/或表达来获得载体。所述细胞可以是真核细胞或原核细胞。所述真核细胞可以是哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。所述哺乳动物可以是人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠。所述原核细胞可以是细菌细胞。所述细菌可以是大肠杆菌。所述载体可以是表达载体。在所述表达载体中，所述多核苷酸可操作地连接至适当的调控区，从而使所述多核苷酸在宿主细胞中表达。所述调控区可以是启动子、增强子或终止子。所述载体还可包括选择标记物。所述载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。所述载体可包含编码所述抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸，或者可包含编码重链可变区的多核苷酸和编码轻链可变区的多核苷酸。33.所述多核苷酸可与可检测标记或能够发出可检测信号的标记缀合。所述标记可以是荧光染料、磷光染料、放射性同位素、生色团、量子点、淬灭剂、磁珠纳米颗粒、金纳米颗粒、纳米磷光体、硅纳米颗粒、具有发光性质的半导体微粒等。例如，所述荧光染料可以是花青(花青2)、酰氨基甲基香豆素、fluorosane、吲哚羰花青(花青3)、花青3.5、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、印度羰花青(花青5)、花青5.5、花青7、牡蛎等。例如，所述半导体微粒可以是镉硒(cdse)、镉碲(cdte)、铟镓磷(lngap)、银铟锌硫化物(aglnzns)等。与所述标记的缀合方法可以是将标记物质结合至多核苷酸3'末端的方法、将标记物质结合至5'末端的方法，或使与标记物质结合的核苷酸包含在多核苷酸中的方法。标记与3'末端或5'末端的缀合可通过酶反应进行，并且所述酶可以是t4rna连接酶、末端转移酶、polya聚合酶等。所述标记可通过荧光显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、计算机断层摄影术、磁共振成像等检测。34.另一个方面提供了包含多所述核苷酸的宿主细胞。35.所述多核苷酸与上面描述的相同。36.所述宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞，每种细胞均含有所述多核苷酸。所述细菌细胞可以是大肠杆菌(大肠杆菌)、链霉菌属或鼠伤寒沙门氏菌。所述酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母。所述昆虫细胞可以是果蝇或spodofterrasf9细胞。所述动物细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞(cho)、小鼠骨髓瘤(sp2/0)、人类淋巴母细胞、cos、小鼠骨髓瘤(nso)、293t、bow黑素瘤细胞、ht-1080、幼仓鼠肾细胞(bhk)、人胚胎肾细胞(hek)或perc.6(人视网膜细胞)。37.所述多核苷酸可被引入到宿主细胞中。所述引入是指将含有编码所述抗体的多核苷酸的载体递送至宿主细胞的方法。此类引入可通过本领域已知的各种方法进行，所述方法包括磷酸钙-dna共沉淀、deae-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电休克、显微注射、脂质体融合、脂质转染胺(lipofectamine)和原生质体融合。此外，转导是指通过感染使用病毒颗粒将目标产物递送至细胞中。此外，可通过基因轰击等将载体引入到宿主细胞中。引入也可称为转化。38.另一个方面提供了产生所述抗体或其抗原结合片段的方法。39.所述方法可包括培养宿主细胞；以及从获得的培养物中分离抗体或其抗原结合片段。40.所述宿主细胞与上面描述的相同。41.所述培养可根据本领域已知的合适培养基和培养条件进行。本领域技术人员可根据所选择的微生物容易地控制培养基和培养条件。培养方法可包括例如分批、连续和补料-分批培养。42.培养基可包含各种碳源、氮源和微量元素组分。43.碳源可以是例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉或纤维素；脂肪，如大豆油、向日葵油、蓖麻油或椰子油；脂肪酸甘油，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如乙醇；有机酸，如乙酸；或它们的组合。氮源可包括例如无机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(csl)和大豆小麦；有机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，或它们的组合。作为磷源的介质可包括例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐，或金属盐，如镁抗氧化剂或铁抗氧化剂。此外，培养基中可包含氨基酸、维生素、适当的前体等。培养基或各个组分可分批或连续添加至培养物中。44.此外，在培养宿主细胞的时间段内，可在以合适的方式向微生物培养物中添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物以调节培养物的ph。此外，在宿主细胞的培养过程中，可使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的形成。45.所述细胞可在需氧、微需氧或厌氧条件下培养。微需氧条件是指将氧以低于大气中氧水平的水平溶解到培养基中的培养条件。低氧水平可以是例如约0.1％至约10％、约1至约9％、约2％至约8％、约3％至约7％或约4％至约6％。此外，微需氧条件可包括培养基中溶解氧的浓度在约0.9ppm至约3.6ppm范围内的条件。培养温度可以是例如约20℃至约45℃或约25℃至约40℃。孵育可持续直到所需量的抗体或其抗原结合片段达到目标水平。46.分离可通过本领域中已知用于分离抗体的方法执行。分离可包括执行选自离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解和色谱分离的一个或多个过程。47.所述方法可进一步包括标记所分离的抗体或其抗原结合片段。标记可以是免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、放射性标记、表位标签、亲和素/生物素、胶体金颗粒、有色颗粒、磁性颗粒、生色团标记、ecl标记、酶等。48.在一个方面，本发明涉及用于治疗个体的为原发性癌症或转移性癌症的癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用如上所讨论的抗bag2或其抗原结合片段。所述方法可包括共同施用或依序施用现有治疗剂。现有疗法可以是癌症免疫治疗剂，其可包括针对免疫检查点分子如pd-1、pd-l1或ctla4的抑制剂。免疫治疗剂可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素15(il-15)、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、4-1bb配体、gitrl、ox-40l、抗cd3抗体、抗cd27抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗gitr抗体、抗ox-40抗体、抗4-1bb抗体、抗lag-3抗体和抗tim-3抗体。所述癌症可以是乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、结肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、肾癌、透明细胞肉瘤、黑素瘤、脑脊髓肿瘤、脑癌、胸腺、间皮瘤、食道癌、胆管癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(mos)、骨髓纤维化、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、内分泌癌和肉瘤。附图说明49.本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。50.本发明将从本文以下所给出的具体实施方式和附图得到更充分的理解，附图仅是说明性的，并且因此不限制本发明，在附图中：51.图1示出从10个小鼠杂交瘤细胞产生的抗bag2抗体的蛋白质印迹的结果；52.图2a和2b示出抗bag2抗体的全长bag2多肽或其片段的蛋白质印迹的结果；53.图3示出与相应的抗bag2抗体反应的bag2结构域。54.图4a至4d示出抗bag2抗体与抗pd-l1抗体的组合在乳腺癌模型中的治疗功效。(a)向balb/c小鼠注射2×105个emt6细胞。在肿瘤细胞注射后12天，向一些小鼠每两天一次腹膜内(i.p.)注射抗bag2抗体3b10(每只小鼠200μg)或同种型对照抗体。在第14天，一些小鼠每两天一次接受抗pd-l1(每只小鼠100μg，腹膜内)或同种型对照抗体的单次注射。呈现了实验方案。(b和c)对照(黑线，n＝5)小鼠、仅用抗bag2抗体3b10治疗的小鼠(绿线，n＝5)、仅用抗pd-l1抗体治疗的小鼠(蓝线，n＝5)以及用3b10和抗pd-l1抗体两者治疗的小鼠(红线，n＝5)的肿瘤体积。监测肿瘤生长并在第12、14、16、18、20、22和24天用电子卡尺测量肿瘤体积。在第25天，将小鼠处死。(b)组内单个小鼠的肿瘤体积。(c)四个治疗组的平均肿瘤生长。(d)所有组的emt6肿瘤微环境(tme)中cd3+/cd8+t细胞的概况。流式细胞术数据是来自两个独立实验的平均值。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，***p《0.001(与对照小鼠igg2a施用组相比)55.图5a-5d示出抗bag2抗体与抗pd-l1抗体的组合在肺癌模型中的治疗功效。(a)向c57bl/6小鼠注射5×105个llc细胞。大约8天后，当平均肿瘤大小达到约60-80mm3时，将小鼠分成组(n＝5)，以使得所有组的平均肿瘤大小相似，并开始通过腹膜内注射进行治疗。在肿瘤细胞注射后8天，向一些小鼠每三天一次腹膜内注射抗bag2抗体3b10(每只小鼠200μg)、抗pd-ll抗体(每只小鼠100μg)、抗pd-ll抗体和3b10的组合，或同种型对照抗体，直到研究完成。呈现了实验方案。(b和c)对照(黑线，n＝5)小鼠、仅用抗bag2抗体3b10治疗的小鼠(绿线，n＝5)、仅用抗pd-l1抗体治疗的小鼠(蓝线，n＝5)以及用抗bag2和抗pd-l1抗体两者治疗的小鼠(红线，n＝5)的肿瘤体积。监测肿瘤生长并在第8、11、14、17和20天用电子卡尺测量肿瘤体积。在第20天，将小鼠处死。(b)组内单个小鼠的肿瘤体积。(c)四个治疗组的平均肿瘤生长。(d)所有组的llc肿瘤微环境(tme)中cd3+/cd8+t细胞的概况。流式细胞术数据是来自两个独立实验的平均值。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，**p《0.01(与对照小鼠igg2a施用组相比)。56.图6a-6c示出抗bag2抗体与抗pd-l1抗体的组合在黑素瘤肺转移模型中的治疗功效。(a)向c57bl/6小鼠静脉内注射2×105个b16-f10-luc2细胞。在执行bli时，小鼠接受了d-荧光素的腹膜内(i.p.)注射，并且它们的bli信号充当背景。在第14、20、26、32和38天通过bli信号监测黑素瘤转移至肺肿瘤的生长，并将小鼠分成组(n＝4)，以使得四组的平均bli信号相似。在肿瘤细胞注射后15天，向一些小鼠每四天一次腹膜内(i.p.)注射抗bag2抗体3f12(每只小鼠200μg)或同种型对照抗体。在第23天，一些小鼠每四天一次接受抗pd-l1(每只小鼠100μg，腹膜内)或同种型对照抗体的单次注射直到研究完成。在第39天，将小鼠处死。呈现了实验方案。(b)在第38天，对照小鼠(n＝4)、仅用抗pd-l1抗体治疗的小鼠(n＝4)、仅用抗bag2抗体3f12治疗的小鼠(n＝4)以及用抗bag2抗体3f12和抗pd-l1抗体治疗的小鼠(n＝4)的代表性bli信号。(c)四个治疗组中肿瘤的bli信号的定量。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(与对照组小鼠igg2a施用组相比)。57.图7a-7d示出抗bag2抗体与抗pd-1抗体的组合在结肠直肠癌模型中的治疗功效。(a)向c57bl/6小鼠注射5×105个mc38细胞。大约8天后，当平均肿瘤大小达到约30mm3时，将小鼠分成组(n＝6)，以使得所有组的平均肿瘤大小相似，并开始通过腹膜内注射进行治疗。在肿瘤细胞注射后8天，将一些小鼠每四天一次用抗bag2抗体3b10(每只小鼠200μg)、抗pd-1抗体(每只小鼠50μg)、抗pd-1抗体与3b10的组合或同种型对照抗体治疗直到研究完成。呈现了实验方案。(b和c)对照(黑线，n＝6)小鼠、仅用抗bag2抗体3b10治疗的小鼠(绿线，n＝6)、仅用抗pd-1抗体治疗的小鼠(蓝线，n＝6)以及用抗bag2和抗pd-1抗体两者治疗的小鼠(红线，n＝6)的肿瘤体积。监测肿瘤生长并在第8、10、12、14、16、18和20天用电子卡尺测量肿瘤体积。在第20天，将小鼠处死。(b)组内单个小鼠的肿瘤体积。(c)四个治疗组的平均肿瘤生长。(d)所有组的mc38肿瘤微环境(tme)中cd3+/cd8+t细胞的概况。流式细胞术数据是来自两个独立实验的平均值。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(与对照小鼠igg2a施用组相比)。58.图8a-8d示出抗bag2抗体与抗pd-l1抗体的组合在肺癌模型中的治疗功效。(a)向balb/c小鼠注射3×105个ct26细胞。大约11天后，当平均肿瘤大小达到约70mm3时，将小鼠分成组(n＝7)，以使得所有组的平均肿瘤大小相似，并开始通过腹膜内注射进行治疗。在肿瘤细胞注射后11天，将一些小鼠每两天一次用抗bag2抗体3b10(每只小鼠250μg或750μg)、抗pd-ll抗体(每只小鼠200μg)、抗pd-l1抗体与3b10的组合(每只小鼠250μg或750μg)或同种型对照抗体治疗直至研究完成。呈现了实验方案。(b和c)对照(黑线，n＝7)小鼠、仅用3b10治疗的小鼠(250μg，绿线，n＝7)、仅用3b10治疗的小鼠(750μg，棕线，n＝7)、仅用抗pd-l1抗体治疗的小鼠(蓝线，n＝7)、用3b10(250μg)和抗pd-l1抗体治疗的小鼠(红线，n＝7)以及用3b10(750μg)和抗pd-l1抗体治疗的小鼠(紫线，n＝7)的肿瘤体积。监测肿瘤生长并在第11、13、15、17、19、21和23天用电子卡尺测量肿瘤体积。在第20天，将小鼠处死。(b)组内单个小鼠的肿瘤体积。(c)四个治疗组的平均肿瘤生长。(d)所有组的mc38肿瘤微环境(tme)中cd3+/cd8+t细胞的概况。流式细胞术数据是来自两个独立实验的平均值。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，***p《0.001(与对照小鼠igg2a施用组相比)。59.图9a-9e示出抗bag2抗体与抗pd-1抗体或抗ctla4抗体的组合在胰腺癌模型中的治疗功效。(a)向c57bl/6小鼠原位注射2×106个panc02-luc细胞。大约15天后，在执行bli时，小鼠接受了d-荧光素的腹膜内(i.p.)注射，并且它们的bli信号充当背景。通过bli信号监测原发性胰腺肿瘤的生长,将小鼠分成组(n＝6-7),以使得十五组的平均bli信号相似。将小鼠用200μg(低剂量)/小鼠(从第16天至第32天分八次)和400μg(高剂量)/小鼠(从第35天至第39天分三次)四种抗bag2抗体(3b10、3f12、3b5和3g8)或同种型对照抗体治疗，每周3次直到研究完成。在植入后第28天，将小鼠用抗pd-1抗体(每只小鼠75μg)或抗ctla4抗体(每只小鼠200μg)或同种型对照抗体治疗，每周3次直到研究完成。在第40天，将小鼠处死。呈现了实验方案。(b)在植入后第15、27和39天，通过bli信号的ivis成像监测肿瘤生长。仅用四种抗bag2抗体(3b10、3f12、3b5和3g8)或同种型对照抗体治疗的小鼠(白色条，每组n＝7)、另外还用抗pd-1抗体治疗的小鼠(黑色条，每组n＝6)以及另外还用抗ctla4抗体治疗的小鼠(灰色条，每组n＝4)的bli信号。(c)在第40天，组内单个小鼠的原发肿瘤重量(mg)。(d)十五个治疗组中至肝脏(左)、胸膜(中)和膈膜(右)的平均转移。(e)所有组的panc02-luc肿瘤微环境(tme)中淋巴细胞、nk、骨髓、基质细胞群体的概况。肿瘤特异性cd45+/cd11b+/gr1-/f4/80+巨噬细胞、cd45+/cd11b+/gr1+mdsc和cd45-/cd90.2+基质细胞流式细胞术数据是来自两个独立实验的平均值。t-test：所有数据均呈现为平均值±sem(平均值的标准误差)。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(与对照小鼠igg2a施用组相比)。n.s.(不显著)。肿瘤特异性淋巴细胞(cd3+/cd8+t细胞和cd45+/cd3-/cd19+b细胞)；肿瘤特异性nk细胞(cd45+/cd3-/cd49b+)；肿瘤特异性骨髓细胞(cd45+/cd11b+/gr1-/f4/80+巨噬细胞，cd45+/cd11b+/gr1+mdsc)；肿瘤特异性基质细胞(cd45-/cd90.2+)。具体实施方式60.定义61.在本技术中，“一个/种(a/an)”用于指代单个和多个对象。62.如本文所用，“约”或“基本上”通常提供了不受限于精确数字的余地。例如，如在多肽序列长度的上下文中使用的，“约”或“基本上”指示所述多肽不限于所列举的氨基酸数目。从n-末端或c-末端添加或减去一些氨基酸可被包括在内，只要存在诸如其结合活性的功能活性。63.如本文所用，与一种或多种进一步的治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序的连续施用。64.如本文所用，“热点”在其与互补决定区内的序列有关时意指存在将导致抗原结合区不稳定的氨基酸残基，并且因此应替代此类基序以获得更好的结合效率。虽然没有通常被替代的氨基酸的列表，但考虑替代cdr上的氨基酸残基的一种方式是考虑种系保守性和抗体序列结构，并且选择和替代具有相似结构的氨基酸。例如，可使ng突变为na，因为这两种氨基酸的结构相似。这种修饰允许cdr与bag2具有更大的结合效率。65.如本文所用，“一种氨基酸”和“多种氨基酸”是指所有天然存在的l-α-氨基酸。此定义旨在包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。66.如本文所用，一般而言，术语“氨基酸序列变体”是指与参考(例如天然序列)多肽相比，在氨基酸序列上具有一些差异的分子。氨基酸改变可以是天然氨基酸序列中的取代、插入、缺失或此类变化的任何所需组合。67.取代式变体是天然序列中的至少一个氨基酸残基被去除并且在其同一位置处的地方插入了不同氨基酸的变体。取代可以是单一的，其中分子中的仅一个氨基酸已被取代；或取代可以是多重的，其中同一分子中的两个或更多个氨基酸已被取代。68.用于所述序列内的氨基酸的取代物可选自所述氨基酸所属的类的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。还包括在本发明范围内的是表现出相同或相似生物活性的蛋白质或其片段或衍生物，以及在翻译过程中或翻译后被差异地修饰(例如通过糖基化、蛋白水解裂解、连接至抗体分子或其他细胞配体等被差异地修饰)的衍生物。69.插入式变体是具有紧邻天然氨基酸序列中的特定位置处的氨基酸插入的一个或多个氨基酸的那些变体。紧邻氨基酸意指连接至所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。70.缺失式变体是天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被去除的那些变体。通常，缺失式变体将在分子的特定区域中缺失一个或两个氨基酸。71.如本文所用，“片段”或“功能衍生物”是指本发明多肽的生物活性氨基酸序列变体和片段，以及共价修饰形式，包括通过与有机衍生剂反应获得的衍生物、翻译后修饰形式、具有非蛋白质性聚合物的衍生物和免疫粘附素。72.如本文所用，“运载体(carrier)”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂。药学上可接受的运载体经常是水性ph缓冲溶液。药学上可接受的运载体的实例包括但不限于缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂类，如聚乙二醇(peg)和73.如本文所用，“药学上可接受的运载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的此类介质和剂的使用是本领域熟知的。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则考虑了其在治疗性组合物中的使用。补充性活性成分也可掺入到所述组合物中。74.特别有利的是将肠胃外组合物配制成便于施用和剂量均匀的剂量单位形式。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量供待治疗的哺乳动物受试者用的物理上分离的单位；每个单位均含有被计算为与所需要的药物运载体相结合产生所需的治疗效果的预定量的活性材料。本发明的剂量单位形式的规格由以下各项决定并且直接取决于以下各项：(a)活性材料的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)本领域在混配此种活性材料以治疗具有导致身体健康受损的患病状态的活受试者的疾病方面固有的局限性。75.将主要活性成分以有效量与合适的药学上可接受的运载体一起混配成剂量单位形式以便进行方便且有效的施用。例如，单位剂型可含有0.5μg至约2000mg范围内的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以约0.5μg/ml运载体存在。在含有补充活性成分的组合物的情况下，剂量是通过参考所述成分的常用剂量和施用方式而确定的。76.如本文所用，“载体”、“多核苷酸载体”、“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可呈几种形式中的任一种，包括但不限于rna、dna、包封在逆转录病毒外壳中的rna、包封在腺病毒外壳中的dna、被包装成另一种病毒或病毒样形式(如单纯疱疹和腺结构，如聚酰胺)的dna。77.如本文所用，“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受者的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且该子代可能由于天然、偶然或故意突变和/或改变而不一定与初始亲本细胞完全同一(在形态方面或在总dna补体方面)。78.如本文所用，“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。79.如本文所用，用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、羊、猪等。优选地，哺乳动物是人。80.如本文所用，“预防”病症或疾患的治疗剂是指在统计学样品中使所述病症或疾患在所治疗样品中的的发生率相对于未治疗的对照样品降低，或者相对于未治疗的对照样品延迟所述病症或疾患的一种或多种症状的发作或者降低所述病症或疾患的一种或多种症状的严重程度的化合物。81.术语“减少(decrease)”、“减轻(reduced)”、“减轻(reduction)”或“抑制”在本文中全部用于意指性质、水平或其他参数减少或减低了统计学上显著的量。在一些实施方案中，“减轻(reduce)”、“减轻(reduction)”或“减少(decrease)”或“抑制”通常意指与参考水平(例如，不存在给定治疗的情况下)相比减少了至少10％并且可包括例如减少了至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“减轻”或“抑制”不涵盖与参考水平相比的完全抑制或减轻。“完全抑制”是与参考水平相比100％抑制。减少可优选地降至被认为在对于未患有给定病症的个体而言正常的范围内的水平。82.术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强”或“激活”在本文中全部用于一般意指性质、水平或其他参数增加了统计学上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％，或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达100％并包括100％的增加、或介于10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，至少约20倍的增加，至少约50倍的增加，至少约100倍的增加，至少约1000倍或更多倍的增加。83.如本文所用的“癌症”或“肿瘤”是指干扰身体器官和系统的正常运作的不受控制的细胞生长。患有癌症或肿瘤的受试者是具有存在于受试者体内的可客观测量的癌细胞的受试者。此定义中包括良性癌症和恶性癌症以及休眠态肿瘤或微转移瘤。从其初始位置转移并接种在重要器官中的癌症可最终导致受试者因受影响器官的功能恶化而死亡。癌症的实例包括但不限于b细胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、头颈癌、脑癌(如成胶质细胞瘤)和前列腺癌(包括但不限于雄激素依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌)。84.如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指用于减少所述疾病或病症的至少一种或多种症状的一种或多种抗bag2抗体或其片段的量，或包含如本文所公开的一种或多种抗bag2抗体或其片段的药物组合物的量，并且涉及足够量的药理学组合物以提供所需的效果。如本文所用的短语“治疗有效量”意指以可适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗病症的足够量的所述组合物。85.如本文所用，术语“施用”是指将如本文公开的剂或组合物以使得所述剂或组合物至少部分定位在所需位点处的方法或途径放置于受试者中。“施用途径”可指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于经口、外表(topical)、气溶胶、经鼻、通过吸入、肛门、肛门内、肛周、经粘膜、经皮、胃肠外、肠内或局部(local)。“胃肠外”是指通常与注射相关的施用途径，包括肿瘤内、颅内、心室内、鞘内、硬膜外、硬膜内、眶内、输注、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、血管内、静脉内、动脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，所述剂或组合物可呈用于输注或注射的溶液或悬浮液形式，或者为冻干粉末。通过肠内途径，所述剂或组合物可呈允许受控释放的胶囊、凝胶胶囊、片剂、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒剂、乳剂、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡形式。通过外表途径，所述剂或组合物可呈气溶胶、洗剂(lotion)、霜剂、凝胶、软膏、悬浮液、溶液或乳液的形式。在实施方案中，剂或组合物可以粉末形式提供并且可与液体(如水)混合以形成饮料。根据本发明，“施用”可以是自我施用。例如，受试者服用如本文公开的组合物被认为是“施用”。86.如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如家养猫)，和犬科物种(例如狗、狐狸、狼)。术语“患者”、“个体”和“受试者”可在本文中互换使用。在实施方案中，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。此外，本文所述的方法可用于治疗驯养动物和/或宠物。在一个实施方案中，受试者是人。87.如本文所用的“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，包括而不限于人和非人灵长类125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。94.非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般来说，人源化抗体将包含基本上全部的或至少一个，通常两个的可变结构域，其中全部或基本全部的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些cdr区，而全部或基本全部的fr区是人免疫球蛋白序列的那些fr区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的。参见例如，riechmann等人,1988,nature332:323-7；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和queen等人的美国专利号6,180,370；ep239400；pct公布wo91/09967；美国专利号5,225,539；ep592106；ep519596；padlan,1991,mol.immunol.,28:489-498；studnicka等人,1994,prot.eng.7:805-814；roguska等人,1994,proc.natl.acad.sci.91:969-973；以及美国专利号5,565,332。[0095]“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库分离或者从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物分离并且不表达内源性免疫球蛋白的抗体。人抗体可通过本领域已知的多种方法来制备，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及pct公布wo98/46645；wo98/50433；wo98/24893；wo98/16654；wo96/34096；wo96/33735；和wo91/10741.人抗体还可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生。参见例如，pct公布wo98/24893；wo92/01047；wo96/34096；wo96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。此外，公司如lakepharma,inc.(belmont,calif.)或creativebiolabs(shirley,n.y.)可使用类似于与上文描述的技术类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。识别所选表位的完全人抗体可使用被称为“引导选择”的技术来生产。在这种途径中，所选非人单克隆抗体，例如小鼠抗体被用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见jespers等人,1988,biotechnology12:899-903)。[0096]如本文所用，术语“抗体样”意指可被工程改造成含有抗体的部分但不是自然界中天然存在的抗体的分子。实例包括但不限于car(嵌合抗原受体)t细胞技术和技术。car技术使用与t细胞的一部分融合的抗体表位，以使得身体的免疫系统定向攻击特定的靶蛋白或细胞。技术由“抗体样”文库组成，所述“抗体样”文库是合成人fab的集合体，所述人fab然后被筛选用于与来自靶蛋白的肽表位结合。所选的fab区然后可被工程改造到支架或框架中，以使它们类似于抗体。[0097]如本文所用，“免疫治疗剂”或“免疫调节剂”是被设计用于引发或放大免疫应答或者减少或抑制所述应答的剂。[0098]如本文所用，“高同源性”被认为是在任何两个多肽之间的指定重叠区域中具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同一性。[0099]热点除去[0100]在制造、储存期间以及在体内，治疗性抗体有经由许多途径降解的风险。蛋白质中最常发生的降解反应是asn和asp残基的化学降解。虽然这些反应可通过最终原料药和药物产品的适当储存和配制条件来控制，但是在发酵、下游加工期间以及在体内的降解常常无法得到充分控制。如果asn和asp残基参与抗原识别，则它们的化学改变可导致效力的严重丧失。在若干情况下，据报告这些降解事件阻碍长期mab功能性。在体内，蛋白质降解事件被描述为与蛋白质老化相关、通过触发细胞凋亡与癌症相关，或者与其他生物学功能受到的严重影响(例如人晶状体βa3-晶体状蛋白的稳定性降低、异常mapk信号传导、aβ生成过程中潜在β-分泌酶功效和特异性的改变，或针对细菌细胞的溶菌酶裂解活性增加)有关。理想地是在药物开发过程的早期完成易降解药物候选物的鉴定，以相应地调整制造和配制过程，或重新工程改造有问题的候选物以除去此类热点。[0101]asn和asp残基共享经由环状琥珀酰亚胺中间体的形成发生的降解途径。由于后续氨基酸的主链氮在asn/asp侧链γ-羰基上的亲核攻击，因此asn脱酰胺或asp脱水产生琥珀酰亚胺。亚稳态环状酰亚胺可在其两个羰基中的任一个处水解从而形成不同比例的天冬氨酰基或异天冬氨酰基键联，这取决于水解条件和构象限制。此外，提出了asn的替代降解机制，如主链羰基氧亲核攻击导致形成环状异酰亚胺或者asn直接水解为asp。描述了用于检测任一降解产物(即琥珀酰亚胺、asp或isoasp)的几种分析方法，主要是电荷敏感性方法，如离子交换色谱法或等电聚焦法。最适合用于定量和定位蛋白质中的降解位点的是通过液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)进行的分析。参考文献sydow等人,“structure-basedpredictionofasparagineandaspartatedegradationsitesinantibodyvariableregions”,plosone.2014；9(6):e100736.2014年6月24日在线发表的doi:10.1371/journal.pone.0100736中的关于抗体的抗原结合区上存在热点以及替代此类热点基序以使蛋白质具有更高稳定性的可取性的完善知识的公开内容以引用的方式整体并入本文。[0102]在抗体3b5中可看出检测和替代热点的一个这样的实例。vhcdr2是：yidpynggntynrkfkg，然而，根据“ng”的存在检测到热点，将所述热点除去并用“na”替代，以使得除去热点的序列是yidpynagntynrkfkg。申请人注意到，在cdr2的开头y的存在应被认为是cdr2的一部分。本领域普遍承认，即使n末端或c末端的一些序列缩短或短了几个氨基酸，cdr序列仍保持其结合活性。据信cdr的保留其活性的长度完全在合理的实验范围内确定。[0103]抗体的人源化[0104]使抗体人源化的过程是众所周知的，并且因此可使用常规技术来制备人源化抗体。一种示例性方案可以是如下：[0105]通过cdr移植将小鼠单克隆抗体人源化，鉴定出亲代小鼠抗体框架的关键残基并将其引入到人源化序列中。然后将人源化vh/vl转换为全长higg1形式。通过瞬时转染表达变体并通过亲和色谱纯化该变体。纯化的抗体通过sec-hplc、sds-page、elisa和biacore(亲和性表征)进行表征。选择亲和力和效力损失不超过3倍的最佳候选物。[0106]抗体人源化过程可包括五个阶段。首先，完成抗体的人源化设计(热点除去可行性和抗体人源化设计)。[0107]确定vh/vlcdr残基，并使用kabat编号系统对该残基进行注释。运用序列分析来识别主要的风险热点，包括cdr内的未配对半胱氨酸残基、n-糖基化位点和脱氨基位点。可运用工程改造工作来除去有害的热点基序。如果cdr中存在热点，则检查并执行热点除去可行性。[0108]设计了热点除去，并且将相对小鼠-vh和小鼠-vl组合成几种嵌合抗体。使每种嵌合抗体在100ml293细胞中瞬时表达，捕获上清液捕获并通过mabselectprisma(ge，17549801)纯化上清液，记录亲和纯化产率。将纯化的嵌合抗体用sds-page和hplc-sec以及随后通过elisa或biacore进行的亲和力确认来测试。执行嵌合抗体的亲和力排序以确认热点除去可行性。[0109]对于以下抗体，这样的人源化序列可以如下：[0110]3b5亚克隆1：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0111]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftdytfywvrqapgqrlewigyidpynagntynrkfkgrvtitvdksastaymelsslrsedtavyycargyyryggggdfdywgqgtlvtvss(seqidno:75)[0112]3b5亚克隆1：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0113]dvvmtqsplslpvtlgqpasiscrssqslvhsngntylhwfqqrpgqsprllihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycsqnthipptfgggtkveik(seqidno:76)[0114]3b5亚克隆2：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0115]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftdytfywvrqapgqrlewigyidpynagntynrkfkgkvtitvdksastaymelnslrsedtavyycargyyryggggdfdywgqgtlvtvss(seqidno:77)[0116]3b5亚克隆2：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0117]dvvmtqsplslpvtlgqpasiscrssqslvhsngntylhwfqqrpgqsprllihkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycsqnthipptfgggtkveik(seqidno:78)[0118]3b10亚克隆1：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0119]qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasghaftnymiewvrqapgqglewmgvinpgsggtynsekvkgrvtltadrsistaymelsrlrsddtavyycriygnykgyfdhwgqgtlvtvss(seqidno:79)[0120]3b10亚克隆1：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0121]diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdmnsylswfqqkpgkapksliyrsnrlvdgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqndefpftfgqgtkleik(seqidno:80)[0122]3b10亚克隆2：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0123]qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgysftkygmnwvkqapgqglewmgwintntgeatygeevkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycarlglryldywgqgtlvtvss(seqidno:81)[0124]3b10亚克隆2：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0125]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasksvstsdysymhwyqqkpgkapklliylasnlesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqhnrelpptfgqgtkleik(seqidno:82)[0126]3g8亚克隆1：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0127]qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgysftkygmnwvrqapgqglewmgwintntgeatygeevkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycarlglryldywgqgtlvtvss(seqidno:83)[0128]3g8亚克隆1：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0129]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasksvstsdysymhwyqqkpgkapklliylasnlesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqhnrelpptfgqgtkleik(seqidno:84)[0130]3g8亚克隆2：vh区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0131]qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgysftkygmnwvkqapgqglewmgwintntgeatygeevkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycarlglryldywgqgtlvtvss(seqidno:85)[0132]3g8亚克隆2：vl区；加下划线的是检查热点后的cdr区。[0133]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasksvstsdysymhwyqqkpgkapklliylasnlesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqhnrelpptfgqgtkleik(seqidno:86)[0134]抗bag2抗体用于治疗癌症的用途[0135]抑制癌症生长或转变为更具转移性的状态的那些抗体被选择用作抗癌治疗剂并且可被施用给患者以治疗或预防癌症。例如，可通过工程改造或制造人嵌合抗体或全人抗体来进一步优化所选抗体。为了证明这种途径的有效性，[0136]检测到患者样品中bag2水平升高可诊断癌症的存在或其进展为更具侵袭性或转移性的状态。在患者样品中检测到bag2类物质水平升高将是患者患有癌症或有患癌症风险的指标。bag2类物质的水平可通过pcr、杂交方案、循环探针技术、fish、免疫细胞化学、ihc、蛋白质印迹、免疫沉淀、夹心测定、elisa测定等来测量或评估。患者样品可以是流体样品、血液样品、奶(milk)、尿液、细胞、液体活检物、活检物等。在被诊断患有癌症的患者中，bag2水平升高是转移潜力增加的指标。bag2水平升高是前列腺癌的指标。本发明的抗体用于检测bag2并用作诊断工具。[0137]由于细胞和组织在正常情况下不分泌bag2，因此诊断癌症或诊断更具侵袭性或转移性形式或向更具侵袭性形式的转变的有效方式是测量来自患者、来自细胞或组织的集合体或者来自经培养的细胞的样品中bag2的水平，并与健康样品中的bag2水平相比较或者与已知在健康成人细胞或组织中存在的bag2水平相比较。bag2的水平增加指示癌症的存在、转移性癌症的存在或转移的开始。针对bag2的存在测定的样品可以是细胞的集合体，所述细胞可以是经培养的细胞系或来自患者的细胞、体液、血液样品、组织样本或活检样本。因此，将检测癌症的存在或癌症进展的诊断测定包括以下步骤：1)从患有癌症或有患癌症风险的患者获得样品；2)对所述样品进行能够检测或测量bag2水平的测定；3)将测试样品中测得的bag2蛋白的水平与对照患者或对照细胞中的水平进行比较；4)确定bag2的水平与对照相比升高；以及5)如果与测试进行比较的对照来自先前被诊断患有癌症的供体，则得出测试样品的供体患有癌症或具有癌症进展的结论。[0138]在此测定中，与测试样品进行比较的对照样品可以是非癌细胞、经培养的细胞、来自健康供体的样品、来自供体的非癌样品或来自测试样品的供体的样品，其中对照样品是在先前的时间点从供体取得的。此类样品的来源可以是从针对癌症的存在或进展测试的患者取得的任何样本，包括体液、脑脊液、骨髓样品、血液、组织、细胞、活检组织或细胞、源自患者细胞的经培养的细胞等。与测试样品进行比较的样品的来源可以是体液、脑脊液、骨髓样品、血液、组织、细胞、活检组织或细胞，或者可源自健康供体或测试患者的培养细胞，其中样品是在先前的时间点采集的。与测试样品进行比较的测得水平可来自先前记录的数据并被编辑成列表以与测试样品进行比较。[0139]组合疗法[0140]将第一剂与另一种剂联合施用。“联合”是指施用一种治疗方法外加另一种治疗方法，例如向同一个体施用本文所述的免疫调节剂外加抗bag2抗体或其片段。因此，“联合”是指将一种治疗方式在递送另一种治疗方式之前、期间或之后施用给个体。此类组合被认为是单一治疗方案(regiment)或方案(regime)的一部分。[0141]免疫调节剂[0142]免疫调节剂或免疫治疗剂大致可分为四类：检查点抑制剂、细胞因子、激动剂和佐剂。检查点抑制剂通过阻断免疫检查点(免疫系统的“刹车”)起作用，肿瘤经常操纵所述检查点以便关闭免疫应答并保护它们自己。因此，检查点抑制剂能够释放针对癌症的新免疫应答，以及增强现有应答以促进癌细胞的消除。截至2020年，检查点抑制剂可能是迄今为止开发的最著名且最广泛成功的免疫调节剂。[0143]例如，pd-1/pd-l1免疫检查点途径可关闭靶向癌症的t细胞。然而，当检查点抑制剂阻断pd-1/pd-l1途径时，它们可使t细胞能够消除癌细胞。[0144]细胞因子是调控免疫细胞成熟、生长和应答性的信使分子。目前，有四种fda批准的细胞因子免疫疗法——用于治疗患有肾癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和肉瘤的患者的亚群。[0145]激动剂活化通过帮助活化直接攻击癌细胞的“杀伤”t细胞或刺激先天性免疫细胞(如树突状细胞)的活性来促进适应性免疫应答的途径，所述途径通过展示癌症标记物并增强t细胞活性来协调针对癌症的总体免疫应答。[0146]佐剂活化参与可刺激一般免疫应答并最终促进适应性免疫应答的先天免疫系统的途径。一种fda批准的佐剂免疫疗法目前可用于治疗患有鳞状细胞癌(一种皮肤癌)的患者的亚群。[0147]此类免疫调节剂的实例是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素3(il-3)、白细胞介素12(il-12)、白细胞介素15(il-15)、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、4-1bb配体、gitrl、ox-40l、抗cd3抗体、抗cd27抗体、抗ctla4抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗gitr抗体、抗ox-40抗体、抗4-1bb抗体、抗lag-3抗体和抗tim-3抗体。[0148]辅助疗法[0149]抗bag2抗体可辅助具有抗癌特性的其他剂或治疗剂使用，或者可与具有抗癌特性的其他剂或治疗剂一起使用。当辅助使用时，抗bag2抗体和其他一种或多种剂可一起配制成单一的组合药物制剂，或者可被单独配制并单独以单一协调给药方案或以不同给药方案施用。与抗bag2抗体辅助或一起施用的剂通常将与抗bag2抗体具有互补活性，以使得所述抗体和其他剂不会不利地影响彼此。[0150]可与抗cd40抗体辅助或一起施用的剂包括但不限于烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、死亡受体途径的活化剂、bcr-abl激酶抑制剂、bite(双特异性t细胞衔接器(bi-specifictcellengager))抗体、抗体药物缀合物、生物应答修饰剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、dvd、白血病病毒癌基因同源物(erbb2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(hsp)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(iap)的抑制剂、插入性抗生素(intercalatingantibiotic)、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、jak2抑制剂、雷帕霉素(mtor)抑制剂的哺乳动物靶标、微小rna、丝裂原活化的细胞外信号调控激酶抑制剂、非类固醇抗炎症药物(nsaid)、聚adp(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(parp)抑制剂、铂类化学治疗剂、布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂(例如依鲁替尼、阿卡卢替尼)、polo样激酶(plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/三角植物生物碱(retinoids/deltoidsplantalkaloid)、小抑制性核糖核酸(sirna)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂等，以及这些剂中的一者或多者的组合。[0151]免疫药的实例包括但不限于干扰素、免疫检查点抑制剂和其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、干扰素γ-1b或干扰素γ-n1、它们的组合等。免疫检查点抑制剂包括靶向pd-1(例如派姆单抗和纳武单抗)、pd-l1(例如德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、medi4736、msb0010718c和mpdl3280a)和ctla4(细胞毒性淋巴细胞抗原4；例如伊匹单抗、曲美木单抗)的抗体。免疫增强剂包括活化t细胞的抗ox40激动剂抗体。[0152]也可使用抗bag2抗体来增强放射疗法的功效。放射疗法的实例包括外部光束放射疗法、内部放射疗法(即近距离放射疗法)和全身放射疗法。[0153]治疗诊断学[0154]然后将被诊断为具有升高的分泌bag2蛋白水平的患者用特异性地结合bag2的治疗剂进行治疗。因此，被诊断具有升高的分泌bag2水平的患者将受益于用抑制bag2的治疗剂进行的治疗。因此，评估癌症治疗的适用性和施用有效量的治疗剂用于治疗或预防癌症将由以下步骤组成：1)从疑似患有癌症或有患癌症的风险或有发展转移性癌症的风险的患者获得样品；2)测量分泌bag2的量，其中所测量的水平显著高于在对照样品中测量的那些水平；3)确定所述患者患有癌症或已发展为更具侵袭性或转移性的癌症；4)向所述患者施用有效量的抑制bag2表达的治疗剂。在一个优选的实施方案中，抑制的治疗剂[0155]化学修饰的肽[0156]多肽或抗体治疗剂可存在循环半衰期短和蛋白水解降解以及溶解度低的问题。为了改善本发明生物药物的药代动力学和药效学性质，可采用诸如操纵氨基酸序列的方法来降低或增加免疫原性并减少蛋白水解裂解；可进行肽与免疫球蛋白和血清蛋白(如白蛋白)的融合或缀合；还可将生物药物如本发明的肽和抗体掺入到药物递送媒介物(vehicle)中以用于保护和缓释；并且还考虑了与天然或合成聚合物缀合。特别地，对于合成聚合物缀合，还考虑了聚乙二醇化或酰化，如n-酰化、s-酰化等。[0157]核酸构建体[0158]还提供了包含如本文所述的本发明的核酸分子的表达载体，其中所述核酸分子可操作地连接至表达控制序列。还提供了用于产生多肽的宿主-载体系统，所述系统包含本发明的表达载体，所述表达载体已被引入到适合于表达所述多肽的宿主细胞中。合适的宿主细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母)、昆虫细胞(如草地贪夜蛾)，或哺乳动物细胞(如cos、hek或cho细胞)。[0159]本发明还提供了产生本发明多肽的方法，其通过使本文所述的宿主-载体系统的细胞在允许产生所述多肽条件下生长以及回收如此产生的所述多肽来实现。可用于实施本发明的多肽可通过使其在原核或真核表达系统中表达来制备。[0160]可使用许多方法来使重组基因表达并且可使用许多方法来纯化所述多肽。可将所述基因亚克隆到诸如但不限于pzero的细菌表达载体中。[0161]可通过允许随后形成稳定的生物活性蛋白质的任何技术来纯化所述多肽。例如，但不作为限制，可将所述因子作为可溶性蛋白质或作为包涵体从细胞中回收，可通过8m盐酸胍和透析将它们从包涵体中定量提取。为了进一步纯化所述因子，可使用许多纯化方法，dna杂交，(b)“标记物”基因功能的存在或不存在，以及(c)插入序列的表达。在第一种途径中，插入在表达载体中的外来核酸的存在可使用包含与插入的核酸序列同源的序列的探针通过dna-dna杂交来检测。在第二种途径中，重组载体/宿主系统可基于由外来核酸序列在载体中的插入而引起的某些“标记物”基因功能(例如，胸苷激酶活性，对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中的闭塞体(occlusionbody)形成等)的存在或不存在来鉴定和选择。例如，如果将efl核酸序列插入到载体的标记物基因序列内，则可通过标记物基因功能的不存在来鉴定含有插入物的重组体。在第三种途径中，重组表达载体可通过测定由重组构建体表达的外来核酸产物来鉴定。此类测定可基于，例如，目标核酸产物的物理或功能性质，例如，通过配体与受体或其部分的结合(所述受体或其部分可用例如可检测的抗体或其部分标记)或者与针对目标蛋白质或其部分产生的抗体的结合。[0165]多肽(特别是本发明的修饰的多肽)可在宿主细胞中瞬时、组成型或永久表达。[0166]可使用本领域技术人员已知的方法来确定可用于治疗本技术中指示的疾病或病症的有效剂量(参见例如，fingl,等人,thepharmacologicalbasisoftherapeutics,goodmanandgilman,编辑macmillanpublishingco,newyork,第1-46页(1975)。根据本发明使用的药物组合物包含在药理学上可接受的液体、固体或半固体运载体中的上述多肽，所述多肽连接至运载体或靶向分子(例如，抗体、激素、生长因子等)；以及/或者在体内施用前掺入到脂质体、微胶囊和控释制备物中的上述多肽。例如，所述药物组合物可包含在水溶液，如无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或右旋糖溶液中的多肽。替代地，活性剂可包含在固体(例如蜡)或半固体(例如凝胶状)制剂中，所述制剂可被植入到需要这种治疗的患者内。施用途径可以是本领域已知的任何施用模式，包括但不限于静脉内、鞘内、皮下、子宫内、通过注射到受累组织中、动脉内、鼻内、经口，或经由植入装置施用。[0167]施用可使本发明的活性剂分布于全身或局部区域。例如，在一些涉及神经系统远端区域的疾患中，可能需要静脉内或鞘内施用剂。在一些情况下，可将含有活性剂的植入物放置在病变区域内或附近。合适的植入物包括但不限于明胶海绵、蜡、喷雾器(spray)或基于微粒的植入物。[0168]本发明还提供了这样的药物组合物，其包含在药理学上可接受的媒介物中的本文所述的多肽。所述组合物可全身或局部施用。可使用本领域中已知的任何合适的施用模式，包括但不限于静脉内、鞘内、动脉内、鼻内、经口、皮下、腹膜内或通过局部注射或手术植入。还提供了缓释制剂。[0169]基因疗法[0170]基因疗法是指通过向受试者施用已表达或可表达的核酸来执行的疗法。在本发明的此实施方案中，核酸产生其编码的介导治疗效果的蛋白质。[0171]可根据本发明使用本领域中可用的任何基因疗法方法。下面描述了示例性方法。[0172]对于基因疗法方法的一般综述，参见goldspiel等人,clinicalpharmacy12:488-505(1993)；wu和wu,biotherapy3:87-95(1991)；tolstoshev,ann.rev.pharmacol.toxicol.32:573-596(1993)；mulligan,science260:926-932(1993)；以及morgan和anderson,ann.rev.biochem.62:191-217(1993)；may,tibtech11(5):155-215(1993)。可使用的重组dna
技术领域：
：中公知的方法描述于ausubel等人(编辑),currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny(1993)；和kriegler,genetransferandexpression,alaboratorymanual,stocktonpress,ny(1990)中。[0173]核酸向患者中的递送可以是直接递送，在这种情况下，将所述患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体中；或间接递送，在这种情况下，首先使用核酸在体外对细胞进行转化，然后将细胞移植到患者中。这两种途径分别被称为体内或离体基因疗法。[0174]在具体实施方案中，直接体内施用核酸序列，在体内它们将被表达从而产生编码的产物。这可通过本领域中已知的多种方法中的任一种来完成，例如通过将它们构建为适当核酸表达载体的一部分并且对它们进行施用从而使得其成为细胞内的，例如，通过使用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其他病毒载体感染，或通过裸dna的直接注射，或用脂质体或细胞表面受体或转染剂包被，包封在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过将其连接至已知能进入细胞核的肽而施用，通过将其连接至经受受体介导的内吞作用的配体而施用(参见例如wu和wu,j.biol.chem.262:4429-4432(1987))(其可用于靶向特异性地表达所述受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含促融合(fusogenic)病毒肽以破坏内体，从而使得所述核酸能够避免溶酶体降解。在又一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可在体内靶向核酸以用于细胞特异性摄取和表达。替代地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并且掺入在宿主细胞dna内用于表达(koller和smithies,proc.natl.acad.sci.usa86:8932-8935(1989)；zijlstra等人,nature342:435-438(1989))。[0175]在具体实施方案中，使用了含有编码所述多肽的核酸序列的病毒载体。将待在基因疗法中使用的编码所述多肽的核酸序列克隆至一个或多个使所述基因容易递送至患者中的载体中。慢病毒载体(如逆转录病毒载体)以及其他载体(如腺病毒载体和腺相关病毒)是可使用的病毒载体的实例。逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞dna中所必需的组分。[0176]腺病毒是用于将基因递送至呼吸道上皮细胞中的特别有吸引力的媒介物，因为它们自然感染呼吸道上皮细胞，并在那里引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。此外，腺相关病毒(aav)也已被提议用于基因疗法。[0177]基因疗法的另一途径涉及通过此类诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移到组织培养物中的细胞中。通常，转移方法包括将可选择标记物转移到细胞中。然后对细胞进行选择，以便分离出已摄取且正表达所转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送到患者中。[0178]在此实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前将核酸引入到细胞中。此种引入可通过本领域已知的任何方法进行，所述方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外来基因引入到细胞中的许多技术是本领域已知的，并且可根据本发明使用，条件是接受者细胞的必要发育和生理功能不被破坏。所述技术应该能将核酸稳定地转移到细胞中，从而使得所述核酸可由所述细胞表达，并且优选地可由其细胞子代遗传和表达。[0179]可向其中引入核酸用于基因疗法目的的细胞涵盖任何所需的、可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞诸如t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；例如，如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞。[0180]在优选的实施方案中，用于基因疗法的细胞是患者的自体细胞。[0181]在使用重组细胞执行基因疗法的实施方案中，将编码所述多肽的核酸序列引入到所述细胞中，由此使得它们可由所述细胞或其子代表达，并且然后体内施用所述重组细胞以获得治疗效果。在具体实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。根据本发明的此实施方案，可潜在使用在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞。[0182]在具体实施方案中，待出于基因疗法目的引入的核酸包含可操作地连接到编码区的诱导型启动子，由此使得核酸的表达可通过控制适当的转录诱导物的存在或不存在来控制。[0183]治疗性组合物[0184]治疗性化合物的制剂是本领域公知的，并且可方便地参考remington'spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingco.,easton,pa.,usa。例如，可每天每千克体重施用约0.05ng至约20mg。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每日施用数个分次剂量或可如治疗情况的紧急程度所指示按比例减少所述剂量。活性化合物可以方便的方式，如通过经口、静脉内(在可溶于水的情况下)、肌肉内、皮下、鼻内、眼内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子经由腹膜内途径，或者使用体外致敏并过继转移至接受者中的细胞，例如单核细胞或树突状细胞)施用。根据施用途径，肽可能需要被包覆于用于保护其免遭酶、酸或其它可能使所述成分失活的自然条件的影响的材料中。[0185]例如，肽的低亲脂性将会使得它们能够在胃肠道中被能够裂解肽键的酶破坏，在胃中被酸水解所破坏。为了通过非胃肠外施用方式施用肽，将所述肽用阻止其失活的材料包覆，或者将所述肽与阻止其失活的材料一起施用。例如，可将肽在佐剂中施用，与酶抑制剂共同施用或在脂质体中施用。本文考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(dep)和特斯乐(trasylol)脂质体包括水包油包水cgf乳剂以及常规脂质体。[0186]活性化合物也可胃肠外或腹膜内施用。也可在甘油液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制备物含有用于阻止微生物生长的防腐剂。[0187]适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到可容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须稳定，且必须能抵御诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。运载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物，以及植物油。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体情况下通过维持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的阻止可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。[0188]通过将所需量的活性化合物与以上列举的各种其他成分(根据需要)掺入到适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种无菌活性成分掺入到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该真空干燥和冷冻干燥技术产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。[0189]当肽如上所述的那样被适当地保护时，活性化合物可例如与惰性稀释剂一起或与可同化的可食用运载体一起经口施用，或者其可被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者其可被压制成片剂，或者其可直接与饮食的食物一起掺在一起。对于经口治疗性施用，活性化合物可与赋形剂掺在一起并且可以以可摄入片剂、口含片剂(buccaltablet)、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等的形式使用。此类组合物和制备物应含有至少1重量％的活性化合物。占所述组合物和制备物的百分比当然可以改变，并且可方便地在单位重量的约5％至约80％之间。此类治疗有用的组合物中的活性化合物的量使得将获得适合的剂量。制备优选的根据本发明的组合物或制备物，以使得经口剂量单位形式含有介于约0.1μg与2000mg之间的活性化合物。[0190]所述片剂、丸剂、胶囊等还可含有以下：粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如可添加蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香精。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可含有液体运载体。可存在作为包衣或者用于以其他方式修饰剂量单位的物理形式的各种其他材料。例如，可用虫胶、糖或两者包覆片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂(如樱桃或橙调味剂)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料应当是药用纯的并且在所使用的量下基本上无毒。此外，可将活性化合物掺入到持续释放制备物和制剂中。[0191]递送系统[0192]多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的化合物，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞、核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分的构建等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、眶内、硬膜外和经口途径。所述化合物或组合物可以任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(mucocutaneouslining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过包括脑室内和鞘内注射在内的任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统；脑室内注射可用例如附接至储器(如ommaya储器)的脑室内导管来促进。还可例如通过使用吸入器或喷雾器，以及含有雾化剂的制剂来执行肺部施用。[0193]在具体的实施方案中，可能希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于以下方式来实现：在外科手术期间局部输注；外表施涂，例如在外科手术之后与伤口敷料联合；通过注射；借助于导管；借助于栓剂；或借助于植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用包括本发明的抗体或肽在内的蛋白质时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。在另一个实施方案中，所述化合物或组合物可在囊泡，特别是脂质体中递送。在又一个实施方案中，所述化合物或组合物可在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。在又一个实施方案中，受控释放系统可被放置成接近治疗靶标，因此只需要全身剂量的一部分。[0194]以下实施例是为了说明本发明而提供的，而不是以限制方式提供。[0195]实施例[0196]实施例1：抗bag2抗体的选择、测序和抗原-抗体反应[0197]1.靶向bag2的单克隆抗体的选择及其氨基酸序列分析[0198]发明人选择了靶向bag2的抗体，分析了它们的氨基酸序列，并确定了所述抗体中的每一种的互补决定区(cdr)。[0199]详细地，将由seqidno:70的核苷酸序列组成的编码由seqidno:69的氨基酸序列组成的人bag2蛋白的基因克隆到pcaggs质粒中并进行线性化，然后通过施加电击将线性化的构建体接种到五只6周龄雌性balb/c小鼠的肌肉中。所述构建体以三周的间隔肌肉内接种3次，并由100ug在100ulpbs中的dna组成。此时，对照组的质粒也以同样的方式处理。为了产生治疗性和诊断性抗体，执行了比基于蛋白质的抗原注射更有效的基于dna疫苗的免疫策略。从小鼠的眼底腔静脉或尾静脉采集血液，并且通过显示出血清抗体效价的酶免疫测定检查血液，并在最后一次免疫3天后，从表现出足够抗体效价的小鼠中提取脾脏。从脾脏中分离出b淋巴细胞，然后使其与用分离的b淋巴细胞培养的骨髓瘤细胞，即atcc的sp2/0-ag14细胞系融合，从而获得融合细胞。在将融合细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的hat培养基中进行培养之后，通过选择大约130个克隆来获得仅与骨髓瘤和b淋巴细胞融合的杂交瘤细胞。在通过免疫印迹选择过程获得的杂交瘤细胞中，获得了10个产生特异性地结合至人bag2蛋白的抗体的杂交瘤细胞。[0200]从5x106个杂交瘤细胞产生抗bag2抗体的总rna，并且根据制造商的说明书通过使用smartracecdna扩增试剂盒(clontech)由100ng总rna产生5'-race-cdna。通过pcr扩增重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)编码区，并且将扩增的基因插入到pgem-t载体(promega，usa)中，对该基因进行克隆，并且通过使用自动基因分析仪(abiprism310,appliedbiosystemco.)分析该基因的核苷酸序列。通过与先前报告的核苷酸序列进行比较来鉴定所分析基因的核苷酸序列，并且人工翻译所鉴定的核苷酸序列以用于确定互补决定区vh-cdr1、-cdr2和-cdr3以及vl-cdr1、-cdr2和-cdr3的序列。确定互补决定区的序列是使用kabat的数据库(http://www.bioinf.org.uk/abs/)执行的。[0201]结果，从杂交瘤细胞中获得了10种特异性地结合至bag2的抗bag2抗体。10种抗bag2抗体是2a11、4c2、8c4、3b5、9b3、9b12、3b10、10h7、3gb和3f12抗体。此外，确定了如表1至表3所示的重链可变区、轻链可变区及其互补决定区的氨基酸序列和编码所述抗体的基因的核苷酸序列。[0202]2a11、4c2和8c4抗体包含由seqidno:21的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:27的氨基酸序列组成的轻链可变区。在2a11抗体中，seqidno:21的第56和57个xaa各自是gly，并且seqidno:27的第53个xaa是lie。在4c2抗体中，seqidno:21的第56个xaa和第57个xaa分别是gly和ala，并且seqidno:27的第53个xaa是phe。在8c4抗体中，seqidno:21的第56个xaa和第57个xaa分别是ala和gly，并且seqidno:27的第53个xaa是phe。[0203]2a11、4c2和8c4抗体的vh-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seqidno:33、39和45的氨基酸序列组成，并且vl-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seqidno:51、57和63的氨基酸序列组成。在2a11抗体中，seqidno:21的第56个和第57个xaa各自是gly。关于4c2抗体，在seqidno:21中，第56个xaa是gly，并且第57个xaa是ala。关于8c4抗体，在seqidno:21中，第56个xaa是ala，并且第57个xaa是gly。[0204]9b3、9b12和3b10抗体包含由seqidno:23的氨基酸序列组成的重链可变区和由seqidno:29的氨基酸序列组成的轻链可变区。关于9b3抗体，在seqidno:23中，第1个xaa是glu，第7个xaa是ser，第12个xaa是val，第27个xaa是tyr，第58个xaa是ser，第61个xaa是asn，第74个xaa是lys，第83个xaa是phe，第92个xaa是ala，并且第108个xaa是tyr。关于9b3抗体，在seqidno:29中，第23个xaa是lie，第45个xaa是ala，第73个xaa是glu，并且第100个xaa是lie。关于9b12抗体，在seqidno:23中，第1个xaa是gin，第7个xaa是ser，第12个xaa是val，第27个xaa是tyr，第58个xaa是ser，第61个xaa是asn，第74个xaa是arg，第83个xaa是phe，第92个xaa是gly，并且第108个xaa是his。关于9b12抗体，在seqidno:29中，第23个xaa是met，第45个xaa是ala，第73个xaa是glu，并且第100个xaa是met。关于3b10抗体，在seqidno:23中，第1个xaa是gin，第7个xaa是pro，第12个xaa是ala，第27个xaa是his，第58个xaa是thr，第61个xaa是ser，第74个xaa是arg，第83个xaa是leu，第92个xaa是gly，并且第108个xaa是his。关于3b10抗体，在seqidno:29中，第23个xaa是met，第45个xaa是ser，第73个xaa是asp，并且第100个xaa是lie。[0205]关于9b3、9b12和3b10抗体，vh-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seqidno:35、41和47的氨基酸序列组成，并且vl-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seqidno:53、59和65的氨基酸序列组成。关于9b3抗体，seqidno:35的第2个xaa是tyr，seqidno:41的第8个xaa是ser，seqidno:47的第12个xaa是tyr，seqidno:53的第3个xaa是lie，并且seqidno:59的第2个xaa是ala。关于9b12抗体，seqidno:35的第2个xaa是tyr，seqidno:41的第8个xaa是ser，seqidno:47的第12个xaa是his，seqidno:53的第3个xaa是met，并且seqidno:59的第2个xaa是ala。关于3b10抗体，seqidno:35的第2个xaa是his，seqidno:41的第8个xaa是thr，seqidno:47的第12个xaa是his，seqidno:53的第3个xaa是met，并且seqidno:59的第2个xaa是ser。[0206]表1[0207]抗体名称vh基因的核苷酸序列vl基因的核苷酸序列2a11seqidno:1seqidno:114c2seqidno:2seqidno:128c4seqidno:3seqidno:133b5seqidno:4seqidno:149b3seqidno:5seqidno:159b12seqidno:6seqidno:163b10seqidno:7seqidno:1710h7seqidno:8seqidno:183g8seqidno:9seqidno:193f12seqidno:10seqidno:20[0208]表2[0209]抗体名称vh区的氨基酸序列vl区的氨基酸序列2a11seqidno:21seqidno:274c2seqidno:21seqidno:278c4seqidno:21seqidno:273b5seqidno:22seqidno:289b3seqidno:23seqidno:299b12seqidno:23seqidno:293b10seqidno:23seqidno:2910h7seqidno:24seqidno:303g8seqidno:25seqidno:313f12seqidno:26seqidno:32[0210]表3[0211][0212]2.抗bag2抗体在乳腺癌细胞中的抗原-抗体应答的鉴定[0213]图1示出从10个小鼠杂交瘤细胞产生的抗bag2抗体的免疫印迹的结果。具体而言，将人乳腺癌细胞mda-mb-231细胞在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(welgene)培养基中在37℃的温度下培养。从孔中收获细胞并用pbs洗涤，并且将细胞溶解在含有1％brij97、5mmedta、0.02mhepesph7.3、0.15mnacl、1mmpmsf、0.5mmnaf、10μg/rni抑肽酶和0.2mm原钒酸钠的裂解缓冲液中。在冰上孵育15分钟后，通过离心从细胞中除去细胞核并收集上清液。向适量的上清液中添加由20％甘油、4.6％sos、0.125mtris(ph6.8)、0.1％溴酚蓝组成的2x样品缓冲液。在标准条件下，通过使用mini-proteanii系统(bio-radhercules，ca)在12％凝胶上对10ug蛋白质样品进行sos-page分析。对于免疫印迹，将蛋白质转移至millipore(一种pvdf膜)。使由在tbs中的0.1％tween20和5％牛血清白蛋白(bsa)组成的封闭溶液反应1小时。随后，将从杂交瘤细胞培养物提取的抗bag2抗体的1/2000稀释液用作第一抗体，并且将用作第二抗体的山羊抗小鼠hrp缀合物(dako)稀释至1/5000。使用egl试剂(amershampharmaciabiotech)作为底物在黑暗中进行胶片感光。将光敏条带与标准分子标记物进行比较，以鉴定对应于bag2的大小的条带。[0214]结果，如图1所示，与用作阳性对照的市售多克隆抗bag2抗体ab58682(abeam)相比，抗体2a11、3b5、3b10、3f12、3gb、4c2、8c4、9b3、9b12和10h7表现出靶向bag2的抗原-抗体反应。[0215]接下来，为了对在上文第1节细胞中鉴定出的十种抗体所针对的bag2抗原进行结构域作图，将其中引入有分子量为约26kda的gst-空载体(pcdna3.1+/gst载体，novoprobioscienceinc.china)的细胞用作阴性对照。将gst-bag完整载体、gst-bagf1载体、gst-bagf2载体、gst-bagf3载体和gst-bagf4载体(各自包含编码人bag2蛋白的多核苷酸和编码bag2蛋白的片段的多核苷酸)引入到细胞中，并且培养其中引入有所述载体的细胞以表达基因，然后获得细胞裂解物。针对细胞裂解物，使用10种抗体中的每一种进行免疫印迹。编码人bag2蛋白的多核苷酸具有seqidno:70的核苷酸序列。gst-bagf1、-bagf2、-bagf3和-bagf4载体分别由seqidno:71至74的核苷酸序列组成。[0216]图2a和2b示出抗bag2抗体的全长bag2多肽或其片段的免疫印迹的结果。在图2中，a示出载体和bag2蛋白及其片段的示意图，并且b示出免疫印迹的结果。详细地，如下那样执行免疫印迹：通过脂质转染胺(lipofectamine)转染(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma,usa)方法将所述载体中的每一种引入到hek293t细胞中，并且将所得转化细胞在37℃下在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(welgene)培养基中培养30小时，然后分离细胞。使用与结合图1所述的方法相同的方法使分离的细胞破碎并在12％凝胶上对该细胞进行sos-page分析。对于免疫印迹，在与如结合图1描述的封闭溶液相同的封闭溶液反应1小时后，将浓度为2mg/ml的10种纯化的抗bag2抗体中的每一种以1/10000稀释的稀释液用作第一抗体并使其与细胞结合。用作第二抗体的山羊抗小鼠hrp缀合物以1/5000稀释浓度使用，并且使用egl试剂(amershampharmaciabiotech)作为底物在黑暗中进行胶片感光。表达标准分子标记物大小以确认bag2的大小。[0217]结果，如图2所示，每种抗bag2抗体与全长bag2多肽或其片段差异地结合。特别地，对于10种抗bag2抗体中的每一种，通常在gst-bag完整载体引入的细胞裂解产物中约50kda的位置处检测到信号。这一结果表明所有这些抗体都可与全长bag2多肽结合。最后，鉴定出了每种抗bag2抗体与其反应的bag2结构域区域。[0218]图3示出与相应的抗bag2抗体反应的bag2结构域。如图3所示，9b3、9b12、3b10和10h7抗体结合至bag2蛋白的n末端，2a11、3b5、4c2和8c4抗体结合至bag2蛋白的中间区域，并且3f12和3gb抗体结合至bag2蛋白的c末端。n末端通常包括21-60个氨基酸的卷曲螺旋区域，并且中间区域结合至109-189个氨基酸的bnb区域的一部分。因此，通过使用一组结合至不同位点的抗体，可以高灵敏度和特异性检测样品中存在的bag2蛋白或其片段。[0219]根据一个方面，特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段可引起与各种长度的bag2多肽或其片段的抗原-抗体反应。[0220]根据另一个方面，编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞可用于产生抗体或其抗原结合片段。[0221]根据另一个方面，根据产生抗体或其抗原结合片段的方法，可有效地生产抗体或其抗原结合片段。[0222]实施例2.用于治疗癌症的方法的药物和小鼠模型的制备[0223]根据制造商的说明书(gehealthcarebiosciencesab)，在琼脂糖蛋白a/g柱中通过亲和色谱法从相应的培养上清液中纯化出十种抗bag2的杂交瘤细胞系。对照mu-igg2a(atcc，ccl-167tm)用作同种型对照抗体并从美国典型培养物保藏中心获得。用于体外和体内研究的抗bag2小鼠抗体和同种型对照抗体由nanotools在无内毒素条件(《0.01eu/ug)下产生。[0224]抗pd-l1单克隆抗体(bioxcell，目录号be0101)、抗pd-1单克隆抗体(bioxcell，目录号be0033-2)和抗ctla4单克隆抗体(bioxcell，目录号be0131)根据制造商的说明书来制备。[0225]为了验证体内抗肿瘤作用，从koatech公司(韩国)购买了雄性5周龄spfc57bl/6和balb/c小鼠。将这些小鼠维持在温度控制在约22℃的房间里，同时自由地为它们提供食物和水。1周后，将小鼠emt6乳腺癌细胞系的2×105个细胞(atcc，crl-2755tm)、小鼠lewis肺癌(llc)细胞系的5×105个细胞(atcc，crl1642tm)、小鼠mc38结肠癌细胞系的5×105个细胞(kerafast，enh204-fp)以及小鼠ct26结肠直肠癌细胞系的3×105个细胞(atcc，crl2638tm)通过皮下注射注射到这些6周龄小鼠中。注射emt6、llc、mc38和ct26细胞系后8-12天，将7-8周龄小鼠用于实验中。1周后，将小鼠b16-f10-luc2皮肤黑素瘤细胞系的2×105个细胞(atcc,crl-6475-luc2tm)通过尾静脉内注射注射至这些7周龄小鼠中。注射b16-f10-luc2后15天，将9周龄小鼠用于实验中。1周后，将小鼠panc02-luc胰腺癌细胞系的2×106个细胞(professorkyulim,chungnamnationaluniversity,republicofkorea)原位植入到7周龄小鼠胰腺的尾部中。注射panc02-luc细胞系后16天，将10周龄小鼠用于实验中。[0226]作用机制[0227]肿瘤分泌的bag2蛋白可与淋巴样细胞、髓样细胞和基质细胞的表面结合，以在肿瘤微环境中发挥抗免疫(适应性或先天性免疫)作用。假设bag2中和将靶向淋巴样、髓样或基质介导的免疫抑制，而免疫检查点抑制剂将恢复无变应性抗肿瘤t细胞的功能和髓样细胞的促炎性质。[0228]2.1在小鼠模型中治疗乳腺癌结果[0229]结果显示如下：[0230]单独抗bag2抗体在小鼠乳腺癌模型中具有抗肿瘤活性[0231]抗bag2抗体和抗pd-l1抗体的组合疗法在小鼠乳腺癌模型中具有协同抗肿瘤活性。[0232]如图4a所示，在肿瘤接种后12天，在进行药物施用之前，将荷emt6肿瘤的balb/c小鼠按肿瘤大小随机分组。在肿瘤细胞注射后第12天，将小鼠用抗bag2抗体3b10治疗。随后，在第14天，小鼠接受了单次抗pd-l1抗体注射。[0233]如图4b和4c所示，在第24天，抗pd-l1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-l1抗体与3b10组合施用组的肿瘤体积与同种型对照组的肿瘤体积相比分别减少了约20.2％、约39.8％和约70.1％。用抗pd-1抗体治疗对肿瘤生长的影响很小，但与3b10一起的治疗显著抑制了肿瘤生长。使用抗pd-l1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。[0234]如图4d所示，抗pd-l1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-l1抗体和3b10组合施用组的肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞(杀死癌细胞的效应记忆细胞)与同种型对照组的cd3+/cd8+t细胞的量相比分别增加约2.4倍、2.8倍和8.2倍。使用抗pd-l1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上活化肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞。活化可以是直接的或间接的，即对抑制细胞的抑制。[0235]2.2.在小鼠模型中治疗肺癌的结果[0236]结果显示如下：[0237]抗bag2抗体和免疫检查点抑制剂的组合疗法在小鼠肺癌模型中具有协同抗肿瘤活性。[0238]如图5a所示，在肿瘤细胞注射后第8天，最初用抗bag2抗体3b10治疗荷llc肿瘤的c57bl/6小鼠。随后，在第14天，小鼠接受了单次抗pd-l1抗体注射。[0239]如图5b和5c所示，在第20天，抗pd-l1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-l1抗体与3b10组合施用组的肿瘤体积与同种型对照组的肿瘤体积相比分别减少了约8.7％、约17.8％和约62.2％。使用抗pd-l1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。[0240]如图5d所示，抗pd-l1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-l1抗体和3b10组合施用组的肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞(杀死癌细胞的效应记忆细胞)与同种型对照组的cd3+/cd8+t细胞水平相比分别增加了约1.3倍、2.8倍和6.6倍。使用抗pd-l1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上活化肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞。活化可以是直接的或间接的，即对抑制细胞的抑制。[0241]2.3.在小鼠模型中治疗黑素瘤的结果[0242]结果显示如下：[0243]抗bag2抗体在小鼠黑素瘤肺转移模型中具有抗肿瘤活性。[0244]抗bag2抗体和抗pd-l1抗体的组合疗法在小鼠黑素瘤肺转移模型中具有协同抗肿瘤活性。[0245]如图6a所示，在肿瘤细胞静脉内注射后第15天，最初用抗bag2抗体3f12治疗荷b16-f10-luc2肿瘤的c57bl/6小鼠。随后，在第23天，小鼠接受了单次抗pd-l1抗体注射。[0246]如图6b和6c所示，在第38天，抗pd-l1抗体施用组、抗bag2抗体3f12施用组以及抗pd-l1抗体与3f12组合施用组的肿瘤体积与同种型对照组的bli信号相比，分别减少约19％、约54％和约92％。用抗pd-1抗体进行的单次治疗对肺中黑素瘤的生长有轻微影响，但抗bag2抗体3f12显著抑制肺中黑素瘤的生长。使用抗pd-l1抗体和3f12的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。[0247]2.4.治疗结肠直肠癌[0248]背景[0249]高位结直肠癌(crc)中的微卫星不稳定性(msi)具有错配修复(mmr)缺陷以及升高的pd-l1、lag-3和ido水平，并且对抗程序性死亡(pd)疗法产生积极反应。在临床实践中，构成大多数肿瘤的msi低或微卫星稳定(mss)crc未在pd-1抑制的情况下发现任何益处。与msicrc相比，msscrc具有更高比例的kras致癌突变。在c57bl/6(mc38；kraswt，msi)和balb/c(ct26；krasmut，mss)小鼠的同基因模型(syngeneicmodel)中研究了抗bag2抗体与抗pd-1剂的组合效应。[0250]2.4.1.在小鼠模型中治疗结肠直肠癌msi-高型的结果[0251]结果显示如下：[0252]单独抗bag2抗体在msi-高型小鼠结肠直肠癌模型中具有抗肿瘤活性。[0253]抗bag2抗体和抗pd-1抗体的组合疗法在小鼠crc模型中具有协同抗肿瘤活性。[0254]如图7a所示，在肿瘤细胞注射后第8天，最初用抗bag2抗体3b10治疗荷mc38肿瘤的c57bl/6小鼠。随后，在第10天，小鼠接受了单次抗pd-1抗体注射。[0255]如图7b和7c所示，在第20天，抗pd-1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-1抗体与3b10组合施用组的肿瘤体积与同种型对照组的肿瘤体积相比，分别减少了约43％、约40.8％和约86.8％。用抗pd-1抗体或抗bag2抗体3b10进行的单次治疗显著抑制了肿瘤生长。使用抗pd-1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。[0256]如图7d所示，抗pd-1抗体施用组、抗bag2抗体3b10施用组以及抗pd-1抗体和3b10组合施用组的肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞(杀死癌细胞的效应记忆细胞)与同种型对照组的cd3+/cd8+t细胞水平相比分别增加了约4.4倍、3.9倍和36.2倍。使用抗pd-1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上活化肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞。活化可以是直接的或间接的，即对抑制细胞的抑制。[0257]2.4.2.在小鼠模型中治疗结肠直肠癌mss型的结果[0258]结果显示如下：[0259]-单独抗bag2抗体在小鼠mss型结肠直肠癌模型中具有抗肿瘤活性。[0260]抗bag2抗体和抗pd-l1抗体的组合疗法在小鼠mss型crc模型中具有协同抗肿瘤活性。[0261]如图8a所示，在肿瘤细胞注射后第11天，将荷ct26肿瘤的balb/c小鼠用250μg(低剂量)或750μg(高剂量)/小鼠的抗bag2抗体3b10、抗pd-ll抗体、3b10与抗pd-l1抗体的组合或对照抗体治疗。每两天一次通过腹膜内注射对小鼠给药，直至研究完成。监测肿瘤生长并在指定的时间点用电子卡尺测量肿瘤体积。[0262]如图8b和8c所示，在第23天，低剂量3b10施用组、高剂量3b10施用组、抗pd-l1抗体施用组、抗pd-l1抗体与低剂量3b10组合施用组以及抗pd-l1抗体与高剂量3b10组合施用组的肿瘤体积与同种型对照组的肿瘤体积相比分别降低了约9.1％、约78.8％、约17.4％、约52.2％和约95.1％。用高剂量3b10进行的单次治疗强烈抑制ct26肿瘤的生长。用抗pd-l1抗体作为单一剂进行的治疗在抑制肿瘤生长方面的成功率要低得多。用抗pd-l1抗体和低剂量3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。此外，用抗pd-l1抗体和高剂量3b10的进行的组合治疗显示，在大多数经治疗的小鼠中单个肿瘤消退至检测不到的水平。[0263]如图8d所示，低剂量3b10施用组、高剂量3b10施用组、抗pd-l1抗体施用组、抗pd-l1抗体和低剂量3b10组合施用组以及抗pd-l1抗体和高剂量3b10组合施用组的肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞(杀死癌细胞的效应记忆细胞)与同种型对照组的cd3+/cd8+t细胞水平相比分别增加了约1.4倍、3.8倍、-1.5倍、6.6倍和8.7倍。使用抗pd-l1抗体和3b10的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上活化肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞。活化可以是直接的或间接的，即对抑制细胞的抑制。[0264]2.5.在小鼠模型中治疗胰腺癌的结果[0265]结果显示如下：[0266]单独抗bag2抗体在小鼠胰腺癌模型中具有抗肿瘤活性。[0267]抗bag2抗体和免疫检查点抑制剂(抗pd-1抗体和抗ctla4抗体)的组合疗法在小鼠胰腺癌模型中具有协同抗肿瘤活性。[0268]如图9a所示，在肿瘤细胞注射后，将荷panc02-luc肿瘤的c57bl/6小鼠用200μg(低剂量)/小鼠(从第16天到第32天)和400μg(高剂量)/小鼠(从第35天到第39天分三次)的四种抗bag2抗体(3b10、3f12、3b5和3g8)或对照抗体治疗。一周三次通过腹膜内注射对小鼠给药，直至研究完成。从第30天到第39天，小鼠接受抗pd-1抗体或抗ctla4抗体的注射。在植入后第15、27和39天，通过生物发光(bli)信号的ivis成像监测肿瘤生长。[0269]如图9b所示，在第40天，抗bag2抗体单独施用组、3b10施用组、3f12施用组、3b5施用组和3g8施用组的bli信号强度与同种型对照组相比分别降低了约79.3％、约68.4、约24.8％和约8.3％。抗pd-1抗体施用组、抗pd-1抗体和3b10组合施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组、抗pd-1抗体和3b5组合施用组以及抗pd-1抗体和3g8组合施用组的bli信号强度与同种型对照组相比分别降低了约-14.7％、约95.9％、约92.8％、约62.3％和约-10.9％。仅抗ctla4抗体施用组、抗ctla4抗体和3b10组合施用组、抗ctla4抗体和3f12组合施用组、抗ctla4抗体和3b5组合施用组以及抗ctla4抗体和3g8组合施用组的bli信号强度与同种型对照组相比分别降低了约-14.5％、约91.1％、约85.3％、约66.3％和约10.9％。[0270]如图9c所示，在第40天，仅抗bag2抗体3b10施用组、3f12施用组、3b5施用组和3g8施用组的原发性肿瘤重量与同种型对照组相比分别降低了约63.8％、约56.7％、约27.8％和约18.9％。仅抗pd-1抗体施用组、抗pd-1抗体和3b10组合施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组、抗pd-1抗体和3b5组合施用组以及抗pd-1抗体和3g8组合施用组的bli信号强度与同种型对照组相比分别降低了约17.8％、约85.7％、约87.4％、约58.1％和约-24.8％。仅抗ctla4抗体施用组、抗ctla4抗体和3b10组合施用组、抗ctla4抗体和3f12组合施用组、抗ctla4抗体和3b5组合施用组以及抗ctla4抗体和3g8组合施用组的bli信号强度与同种型对照组相比分别降低了约3.4％、约76.1％、约74.2％、约54.8％和约29.7％。[0271]如图9b和9c所示，用3b10和3f12进行的单次治疗强烈抑制了bli信号强度并降低了荷panc02-luc肿瘤的小鼠的原发性肿瘤重量，但3b5和3g8并未显著抑制bli信号强度并且降低了小鼠原发性肿瘤重量。在四个克隆中的不同现象可能是由对与小鼠和人的交叉反应性的亲和力引起。[0272]用抗pd-1抗体作为单一剂进行的治疗在抑制肿瘤生长方面的成功率要低得多。用抗bag2抗体(3b10、3f12或3b5)与抗pd-1抗体或抗ctla4抗体的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上抑制肿瘤生长。此外，用抗bag2抗体(3b10、3f12或3b5)和抗pd-l1抗体或抗ctla4抗体进行的组合治疗与单独任一种剂相比降低了向肝脏、胸膜和膈膜转移的发生率(图9d)。[0273]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3bf12组合施用组的肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞(杀死癌细胞的效应记忆细胞)与同种型对照组相比分别增加了约1.8倍、3.5倍和14.2倍。[0274]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3bf12组合施用组的肿瘤特异性cd45+/cd3-/cd19+b细胞与同种型对照组相比分别增加了约-1.1倍、-1.05倍和1.04倍。[0275]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组的肿瘤特异性cd45+/cd3-/cd49b+nk(nk细胞)细胞与同种型对照组相比分别增加了约1.3倍、2.1倍和3.6倍。[0276]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组的肿瘤特异性cd45+/cd11b+/gr1-/f4/80+巨噬细胞与同种型对照组相比分别降低了约1.1倍、1.7倍和2.7倍。[0277]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组的肿瘤特异性cd45+/cd11b+/gr1+mdsc(骨髓源性抑制细胞)与同种型对照组相比分别降低了约1.07倍、1.15倍和1.9倍。[0278]如图9e所示，抗pd-1抗体施用组、3f12施用组、抗pd-1抗体和3f12组合施用组的肿瘤特异性cd45-/cd90.2+基质细胞与同种型对照组相比分别降低了约-1.06倍、1.35倍和1.86倍。[0279]用抗pd-l1抗体和3f12的组合进行的治疗比单独任一种剂在更大程度上活化肿瘤特异性cd3+/cd8+t细胞和cd45+/cd3-/cd49b+nk(nk细胞)细胞。但是，cd45+/cd3-/cd19+b细胞群体没有增加。用抗pd-l1抗体和3f12组合进行的治疗比单独任一种剂在更好的程度上减少肿瘤特异性cd45+/cd11b+/gr1-/f4/80+巨噬细胞、cd45+/cd11b+/gr1+mdsc和cd45-/cd90.2+基质细胞。[0280]活化可以是直接的或间接的，即对抑制细胞的抑制。[0281]因此，1)发现抗bag2抗体与同种型对照组相比具有显著的肿瘤生长和转移抑制作用。2)发现作为免疫检查点抑制剂的抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体和抗ctla4抗体与抗bag2抗体的组合与单独的每种抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla4抗体和抗bag2抗体相比在小鼠乳腺癌、肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌和胰腺癌模型中具有显著的肿瘤抑制作用。[0282]应当理解，本文描述的实施方案应仅在描述性意义上考虑，而不是出于限制的目的。每个实施方案中特征或方面的描述通常应被认为可用于其它实施方式中的其它相似特征或方面。虽然已参考附图描述了一个或多个实施方案，但本领域普通技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围的情况下可在其中做出形式和细节上的各种改变。[0283]应当理解，本文描述的实施方案应仅在描述性意义上考虑，而不是出于限制的目的。每个实施方案中特征或方面的描述通常应被认为可用于其它实施方式中的其它相似特征或方面。虽然已参考附图描述了一个或多个实施方案，但本领域普通技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围的情况下可在其中做出形式和细节上的各种改变。[0284][登录号][0285]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0286]登录号：kctc13737bp[0287]保藏日期：2018年11月28日[0288]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0289]登录号：kctc13738bp[0290]保藏日期：2018年11月28日[0291]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0292]登录号：kctc13739bp[0293]保藏日期：2018年11月28日[0294]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0295]登录号：kctc13740bp[0296]保藏日期：2018年11月28日[0297]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0298]登录号：kctc13741bp[0299]保藏日期：2018年11月28日[0300]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0301]登录号：kctc13742bp[0302]保藏日期：2018年11月28日[0303]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0304]登录号：kctc13743bp[0305]保藏日期：2018年11月28日[0306]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0307]登录号：kctc13744bp[0308]保藏日期：2018年11月28日[0309]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0310]登录号：kctc13745bp[0311]保藏日期：2018年11月28日[0312]保藏机构：韩国生物科学与生物技术研究所[0313]登录号：kctc13746bp[0314]保藏日期：2018年11月28日[0315]本文中引用的所有参考文献以引用的方式整体并入。[0316]*****[0317]本领域的技术人员将认识到或者仅仅使用常规实验就能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。当前第1页12当前第1页12