类胰蛋白酶活性测定用底物的制作方法

1.本发明涉及类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，包含c末端肽键合了染料标记物的特定三肽，通过切割前述三肽的c末端肽键，前述染料标记物的荧光特性或发色特性变化；涉及使用该底物测定血液样品中的类胰蛋白酶活性的方法；且涉及包含该底物的血液样品中的类胰蛋白酶活性测定用试剂盒。


背景技术：

2.将过敏性疾病和肿瘤、早产儿视网膜病等特别是肥大细胞参与疾病状况的疾病诊断为肥大细胞活化综合征。在肥大细胞释放的各种介质中，作为蛋白分解酶的类胰蛋白酶由于其特异性而用于疾病状况评估中。当前，世界范围内使用利用特异性抗体的免疫反应(elisa)进行其定量。但是，由于类胰蛋白酶作为酶发挥作用并影响生物体，因此对判断疾病状况而言测定其酶活性是重要的，而只能确定类胰蛋白酶相关蛋白作为抗原的存在量的elisa是不充分的。
3.本发明人们报道了自肥大细胞释放的类胰蛋白酶对于早产儿视网膜病的发病是必不可少的(非专利文献1)。在该报告中，本发明人们已经使用elisa确定了类胰蛋白酶的参与，但是如上所述，在考虑如何能够评估新生儿的疾病状况(是否失明、选择治疗方法)的情形，测定酶活性是必须的。
4.类胰蛋白酶是通过肥大细胞脱颗粒释放到血液中的一种酶，血液浓度通常低至约10μg/l左右的低浓度(非专利文献2、3。在非专利文献3中报道了直至1岁时健康幼儿血清中的存在量是4.67μg/l)。由于用现有的类胰蛋白酶底物不能检测到该浓度，因此有必要浓缩样品溶液或延长反应时间，结果是，目前难以进行准确、迅速的测定。另外，为了简单地测定类胰蛋白酶活性，期望提供样品制备容易的血清直接使用，但是血清中存在凝血酶(作为凝血系统中的一种蛋白酶)，在使用公知的蛋白酶底物进行类胰蛋白酶活性测定的情形，凝血酶显示出比类胰蛋白酶的活性极大的活性，会干扰测定。
5.自1980年代以来，在类胰蛋白酶的酶化学研究中，使用了boc-phe-ser-arg-mca和tos-gly-pro-arg-mca等，它们从那时起就作为胰蛋白酶的荧光底物市售。除了这些以外，还研究了几种三肽-mca的底物特异性，但是除了上述两种以外，通常不使用其他底物(非专利文献4～16)。由于类胰蛋白酶是胰蛋白酶样酶，只要是在c末端具有arg的mca底物，则可以灵敏度(可持续性)或高或低地检出酶活性，因此，对三肽的氨基酸序列目前还没有尝试进行最优化。
6.另外，近年来，据报道ac-lys-pro-arg-fmca(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)是类胰蛋白酶的良好底物(非专利文献17)。该序列中lys的存在为类胰蛋白酶对天然底物蛋白的作用位点提供了有价值的启示。此外，在20年前，通过在基板上构建三肽文库的方法，构建了研究蛋白酶的底物特异性的全面的文库，并明确了对β-类胰蛋白酶i和ii灵敏度最高的三肽序列是-lys/arg-asn-lys/arg-(非专利文献18)。p2位asn显示比p2位ala灵敏度高2倍，进一步地，p3位在侧链带正电荷的氨基酸比p3位ala灵敏度高约2倍左右。但是，遗憾的是，
2001年发表的该出色研究成果从未像iboc-arg-asn-arg-mca这样的易于使用的形式实用化。
7.如上所述，到目前为止，已经报道了可以作为类胰蛋白酶底物的三肽，但是据发明人所知，还没有报道将该底物用于直接测定混杂有蛋白酶的血液样品，进一步地，由于该底物也可以被凝血酶等其他蛋白酶切割，因此，在合成能以混杂有蛋白酶的血液样品为直接测定对象的类胰蛋白酶活性测定用底物上，未能消除技术上的困难。
8.现有技术文献
9.非专利文献
10.非专利文献1：j clin invest.,127(11),3987-4000,2017.
11.非专利文献2：thermo fisher scientific，inc.,“用于诊断和预测的肥大细胞类胰蛋白酶(mast cell tryptase for diagnosis and prediction)”(http://www.phadia.com/global/market％20companies/finland/mast％20cell％20tryptase％20for％20diagnosis％20and％20prediction.pdf)
12.非专利文献3：allergy asthma proc.35,404-408,2014.
13.非专利文献4：j.biol.chem.,258,13552-13557,1983.
14.非专利文献5：j.biol.chem.,262,1363-1373,1987.
15.非专利文献6：biol.chem.hoppe-seyler,369,617-625,1988.
16.非专利文献7：j.biol.chem.,263,18104-18107,1988.
17.非专利文献8：biol.chem.hoppe-seyler suppl.,371,65-73,1990.
18.非专利文献9：j.biol.chem.,267,13573-13579,1992.
19.非专利文献10：j.biochem.,120,856-864,1996.
20.非专利文献11：peptides,19,437-443,1998.
21.非专利文献12：febs lett.,408,85-88,1997.
22.非专利文献13：british j.pharm.,138,959-967,2003.
23.非专利文献14：allergology international,57,83-91,2008.
24.非专利文献15：chemical science,6,1792-1800,2015.
25.非专利文献16：ijc metabolic&endocrine,10,16-23,2016.
26.非专利文献17：sigma aldrich，inc.，“n-乙酰基-lys-pro-arg-7-氨基-4-三氟甲基香豆素”(制品号：c6608)制品信息(https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/sigma/datasheet/3/c6608dat.pdf)
27.非专利文献18：j.biol.chem.,276,34941-34947,2001
28.发明概述
29.发明要解决的课题
30.本发明的课题是提供一种以简单的操作来准确迅速地测定血液样品中类胰蛋白酶活性的方法，以便准确地评估肥大细胞参与的疾病所处的疾病状况。
31.用于解决课题的手段
32.如上所述，在类胰蛋白酶的酶化学研究中，使用了boc-phe-ser-arg-mca和tos-gly-pro-arg-mca等，它们从那时起就作为胰蛋白酶的荧光底物市售。这些底物在测定纯化的类胰蛋白酶活性上显示出足够的活性，但是本发明人们从测定血清中的类胰蛋白酶活性
的观点出发，认识到以下问题：这些底物的灵敏度低，且如上所述受到来自凝血酶的干扰，不能用于测定血清中类胰蛋白酶的活性。本发明人们为了解决所述问题点进行了努力研究的结果，发现iboc-ala-ala-arg-mca、iboc-lys-ala-arg-mca、iboc-abu-ala-arg-mca、iboc-lys-pro-arg-mca对类胰蛋白酶具有极高的灵敏度，即使用低浓度的类胰蛋白酶，也能检测到切割。进一步地，本发明人们发现将上述三肽-mca通过琥珀酸键合至聚(l-赖氨酸)而形成的高分子底物即使在与α2巨球蛋白反应后的凝血酶共存下也不受复合体中凝血酶的作用，能够特异性地测定血清中的类胰蛋白酶活性。基于这些发现完成了本发明。
33.即，本发明是根据如下所述事项的特定发明。
34.[1]类胰蛋白酶活性测定用底物，其包含选自下式(1)～(3)的三肽-x，所述三肽-x是在c末端通过肽键键合了染料标记物的三肽：
[0035]
(1)lys-ala-arg-x
[0036]
(2)ala-ala-arg-x
[0037]
(3)abu-ala-arg-x
[0038]
式中，x是通过与arg的肽键被切割而荧光特性或发色特性发生变化的染料标记物，abu是2-氨基丁酸。
[0039]
[2]上述[1]所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，用于血液样品中的类胰蛋白酶活性的直接测定。
[0040]
[3]上述[1]或[2]所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，将三肽-x的n末端键合至分子量5,000以上的类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物。
[0041]
[4]上述[3]所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物是聚氨基酸。
[0042]
[5]上述[4]所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，聚氨基酸选自聚(l-赖氨酸)、支化聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸)、支化聚(d-赖氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(d-鸟氨酸)。
[0043]
[6]上述[1]～[5]中任一项所述的类胰蛋白酶活性测定用底物，其特征在于，染料标记物是选自mca基、ans基、cmca基、fmca基、amp基、罗丹明110基、罗丹明110单酰胺基、罗丹明6g基和罗丹明b基的荧光染料标记物。
[0044]
[7]血液样品中的类胰蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤(a)和(b)：
[0045]
(a)使上述[1]～[6]中任一项所述的类胰蛋白酶活性测定用底物与血液样品接触的步骤；
[0046]
(b)在前述步骤(a)后，通过测定染料标记物的荧光特性或发色特性的变化量，计算前述血液样品中的类胰蛋白酶活性的程度的步骤。
[0047]
[8]上述[7]所述的方法，其特征在于，血液样品是血清。
[0048]
[9]血液样品中的类胰蛋白酶活性测定用试剂盒，其特征在于，包含上述[1]～[6]中任一项所述的类胰蛋白酶活性测定用底物。
[0049]
[10]上述[9]所述的试剂盒，其特征在于，血液样品是血清。
[0050]
发明的效果
[0051]
根据本发明，可以直接测定血液样品中的类胰蛋白酶活性，无需进行对血液样品
的纯化、浓缩等预处理。
具体实施方式
[0052]
本发明涉及类胰蛋白酶活性测定用底物(下文中有时也称为“本发明的底物”)，其包含选自下式(1)～(3)的三肽-x，为c末端肽键合了染料标记物的三肽；和涉及使用本发明的底物测定血液样品中的类胰蛋白酶活性的方法(下文中有时也称为“本发明的测定方法”)；以及包含本发明的底物的血液样品中的类胰蛋白酶活性测定用试剂盒(下文中有时也称为“本发明的试剂盒”)：
[0053]
(1)lys-ala-arg-x
[0054]
(2)ala-ala-arg-x
[0055]
(3)abu-ala-arg-x
[0056]
(式中，x是通过与arg的肽键被切割而荧光特性或发色特性发生变化的染料标记物，abu是2-氨基丁酸)
[0057]
本发明的底物能够合适地用于直接测定血液样品中的类胰蛋白酶活性的用途中。
[0058]
在本说明书中，谈及肽时的术语“切割”与“水解”同义使用。通过本发明的底物，即使类胰蛋白酶在约10μg/l的极低浓度也能够检出活性，因此，即使是血液样品中的类胰蛋白酶，通过在测定开始后等待2分钟酶反应达到稳态，此后记录测定开始后2分钟至3分钟的这1分钟内获得的荧光强度的增大作为酶活性等的方法，可以评估活性。
[0059]
作为上述染料标记物，没有限制，只要是通过肽键的切割而变化染料标记物的荧光特性或发色特性即可；但从易于检测和灵敏度的角度出发，优选荧光标记物，可以例举例如，mca(4-甲基-香豆素-7-酰胺)基、ans(2-氨基萘-6-磺酸)基、cmca(7-氨基-4-氯甲基香豆素)基、fmca(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)基、amp(2-氨基-7-甲基嘌呤-6-硫醇)基、罗丹明110基、罗丹明110单酰胺基、罗丹明6g基、罗丹明b基等。
[0060]
可以使用公知的荧光强度测定仪等检测和定量上述荧光特性变化的有无和变化量，可以使用分光光度计等检测和定量上述发色特性变化的有无和变化量。此时，分析上述染料标记物的吸收波长和荧光波长，优选地选择可以特异性地检测和定量该染料标记物的激发波长和荧光波长。在本发明的底物中作为染料标记物使用mca基的情形，1)特异性地测定amc(7-氨基-4-甲基香豆素)时，优选地照射不激发mca基但激发amc的波长(例如，360nm～400nm)、检测和测定amc发出的荧光波长(例如，400nm～500nm)；2)特异性地测定mca基时，优选地照射不激发amc但激发mca基的波长(例如，260nm～350nm)、检测和测定mca基发出的波长(例如，350nm～385nm)。
[0061]
作为本说明书中的血液样品只要是自受试者采集的血液样品即可，可以例举例如全血、血浆、血清，优选血浆或血清，从测定的简便性和样品制备的容易性出发，进一步优选血清。另外，可以将凝血抑制剂任选地添加到上述血液样品。本发明的类胰蛋白酶活性测定用底物由于包含被血液中存在的凝血酶识别的序列，为了防止凝血酶的干扰，上述血液样品可以包含抗凝血酶iii、水蛭素、肝素辅因子ii、抑肽酶等凝血酶抑制剂，在优选的实施方案中，上述血液样品不包含凝血酶抑制剂。作为上述受试者，优选地为哺乳动物，更优选地为灵长类，甚至更优选地可以例举人。
[0062]
本发明的底物可以是将重量平均分子量是5,000以上、更优选地6,000以上、进一
步优选地7,000以上、进一步更优选地8,000以上的类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物键合至三肽。在该实施方案中，由于本发明的底物不受到血液样品中共存的凝血酶切割，因此，即使不进行向血液样品添加凝血酶抑制剂、除去凝血酶等预处理，也能够准确性好地测定类胰蛋白酶活性。认为其原因是，重量平均分子量5,000以上的类胰蛋白酶活性测定用底物不能到达血液样品中被α2巨球蛋白四聚体捕获的凝血酶的活性中心。另外，作为该实施方案中的三肽，除了选自式(1)～(3)的三肽之外，还可以使用对类胰蛋白酶的灵敏度与选自式(1)～(3)的三肽同等或更高的已知三肽(lys-pro-arg、选自式(1)～(3)的三肽中p2位是asn的三肽、lys/arg-asn-lys/arg等)。
[0063]
上述类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物只要是不干扰类胰蛋白酶切割本发明的底物中arg残基-染料标记物之间的肽键的聚合物即可，作为重量平均分子量的上限，可以例举例如5,000,000以下、1,000,000以下、500,000以下、100,000以下、50,000以下等。另外，类胰蛋白酶难消化性是指在本发明的底物中，与arg残基-染料标记物之间的肽键相比，类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物中的键更难以被类胰蛋白酶切割，例如，类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物对类胰蛋白酶的灵敏度是arg残基-染料标记物之间的肽键对类胰蛋白酶的灵敏度的1/10以下、优选地1/50以下、更优选地1/100以下、进一步优选地1/500以下、进一步更优选地1/1000以下。在这里，如果对类胰蛋白酶的灵敏度高，则在反应中消化水溶性聚合物，不希望小到能够到达被α2巨球蛋白四聚体捕获的凝血酶的活性中心的分子大小那样。尽管不受理论的束缚，但类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物的性状的要点在于：不能将所携带的三肽-mca底物送达至被α2巨球蛋白四聚体捕获的凝血酶等干扰酶的活性中心那样大小的分子量。类胰蛋白酶以分子量为31至33kda的四聚体(135kda)起作用，因此认为它不受到来自α2巨球蛋白的抑制。
[0064]
作为上述类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物，优选聚氨基酸，其中可以合适地例示聚(l-赖氨酸)、支化聚(l-赖氨酸)、聚(d-赖氨酸)、支化聚(d-赖氨酸)、聚(l-鸟氨酸)和聚(d-鸟氨酸)。上述类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物优选地键合至三肽的n末端，也可以经由peg(聚乙二醇)或琥珀酸等接头键合至三肽。
[0065]
本发明的底物可以合适地用于血液样品中的类胰蛋白酶活性的测定方法(本发明的测定方法)，所述方法依次包括：使本发明的底物与血液样品接触的步骤(a)、和通过在前述步骤(a)后测定染料标记物的荧光特性或发色特性的变化量，计算前述血液样品中的类胰蛋白酶活性的程度的步骤(b)。步骤(a)中的接触时间和对血液样品的底物添加量可以根据血液样品中的类胰蛋白酶活性来合适地设定，作为步骤(b)中的计算血液样品中类胰蛋白酶活性的程度的方法，可以例举例如，基于使用纯化的类胰蛋白酶和本发明的底物预先绘制好的校准曲线来计算血液样品中的类胰蛋白酶活性的方法。在本发明的测定方法中，在步骤(a)之前，可以将上述凝血酶抑制剂添加至作为测定对象的血液样品中，以防止凝血酶的干扰；在本发明的底物是键合有分子量5,000以上的类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物的情形，也可以不添加凝血酶抑制剂。作为疾病的判定标准的血液样品中的类胰蛋白酶活性可以根据疾病适当地设定，一般认为血中类胰蛋白酶浓度为10μg/l以上的情形是高值，由此，也可以基于类胰蛋白酶浓度是10μg/l的情形的活性，来设定疾病的判定标准。
[0066]
在一个实施方案中，本发明的底物可以作为血液样品中的类胰蛋白酶活性测定用试剂盒(本发明的试剂盒)保存、流通和使用。本发明的试剂盒用于本发明的测定方法。本发
明的试剂盒除了本发明的底物之外，还可以包含血液样品采取用容器、血液样品的预处理剂、反应用换冲液、防腐剂、使用说明书等。作为血液样品的预处理剂，可以例示上述凝血酶抑制剂和血液凝固抑制剂，并且作为本发明的底物分子量，在使用了键合有5,000以上的类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物的情形，也可以不包含凝血酶抑制剂。
[0067]
通过使用本发明的底物、测定方法或试剂盒，可以对肥大细胞活化综合征的疾病状况进行评估。在这里，作为肥大细胞活化综合征，可以例举例如，过敏、特应性皮炎、肿瘤、早产儿视网膜病等、全身性肥大细胞症、慢性淋巴性白血病(cll)等。根据本发明，不仅可以直接测定类胰蛋白酶蛋白相关抗原的存在量，而且还可以直接测定血液中的类胰蛋白酶活性，因此，与使用现有的elisa的方法相比较，能够正确地进行疾病状况的评估(阶段等的评估)。
[0068]
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，但是本发明的技术范围不限于这些实施例。
[0069]
实施例1
[0070]
1.类胰蛋白酶底物的筛选
[0071]
采用对于类胰蛋白酶使用的已报道的涉及三肽-mca底物氨基酸序列的文献信息和简易文库的方法，化学合成了共17种mca底物，对从人肺分离的市售类胰蛋白酶，发现了灵敏度和物性最佳的iboc-ala-ala-arg-mca。用以下步骤进行iboc-ala-ala-arg-mca_pmcs的合成。
[0072]
(1)在冰冷下，向fmoc-arg(pmc)-oh(渡边化学工业株式会社制，4mmol)的二氯甲烷(dcm)溶液中加入n,n
’‑
二环己基碳二亚胺(dcc)(450mg，2.2mmol)，搅拌1小时。向生成的对称酸酐中加入amc(东京化成工业株式会社制，400mg，2.2mmol)，室温反应过夜，获得了fmoc-arg(pmc)-mca。
[0073]
(2)通过常规方法将iboc-ala-oh(自制，1.89g，10mmol)和h-ala-obzl_hcl(自制，2.12g，10mmol)缩合，制备了iboc-ala-ala-obzl。此外，用5％pd-c在甲醇中接触还原得到iboc-ala-ala-oh[产量2.08g(80％)]。
[0074]
(3)将fmoc-arg(pmc)-mca(1.0mmol)溶解在20％哌啶(5ml)中，室温反应2小时。蒸馏出溶剂，将残渣溶解在n,n
’‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，向其加入iboc-ala-ala-oh(260mg，1.0mmol)，通过hbtu/hobt法缩合。通过硅胶色谱法纯化产物iboc-ala-ala-arg(pmc)-mca，得到420mg(50％)白色晶体。
[0075]
(4)将iboc-ala-ala-arg(pmc)-mca(400mg，0.45mmol)溶解在三氟乙酸(tfa)(5ml)中，室温反应2小时。蒸馏出tfa，向残渣中加入二乙醚，得到作为结晶状粉末的pmcs盐[产量365mg(91％)]。
[0076]
除了上述那样参考现有文献之外，作为肽文库方法，合成了如表1所列出的在p2位和p3位导入有体积大小不同的gly、ala、abu、val、pro、phe或亲水性lys的iboc-y-x-arg-mca，进行了活性测定。另外，abu(2-氨基丁酸)是非蛋白质性氨基酸，将其作为最适肽序列探索工具加入。
[0077]
通过以下方法进行活性测定。
[0078]
(1)将底物溶液的储备液准备为2.0mm底物的dmso溶液。
[0079]
(2)将底物溶液的储备液用50mm tris-hcl(ph8.0)20倍稀释，制备100μm溶液。将
其100μl添加入聚丙烯微管中，然后，添加市售的类胰蛋白酶溶液(cappel社制)2μl，轻轻涡旋混合后，使用酶活性测定装置(peptide support co.，ltd.生产，原型品)，立即测量365nm的激发波长下在470nm的荧光强度的变化。
[0080]
[表1]
[0081]
荧光底物的氨基酸序列和对人肺类胰蛋白酶*1的灵敏度的比较
[0082][0083][0084]
*1购入的类胰蛋白酶的信息。酶反应条件。
[0085]
*2这些化合物是在通过三氟乙酸处理去除作为精氨酸的胍基保护基的pmc-基时，
该磺酸(pmcs，五甲基苯并二氢吡喃磺酸)作为游离的胍基的抗衡离子形式盐。
[0086]
*3以iboc-ala-ala-arg-mca的灵敏度为100的情形的相对值。
[0087]
通过上述筛选，作为比iboc-ala-ala-arg-mca对类胰蛋白酶灵敏度更高的三肽底物，可以获得iboc-abu-ala-arg-mca和iboc-lys-ala-arg-mca。另外，对于自非专利文献15已知其三肽部分的类胰蛋白酶底物iboc-lys-pro-arg-mca，可以确认其具有比iboc-ala-ala-arg-mca不到2倍的类胰蛋白酶高灵敏度。鉴于非专利文献18所述的类胰蛋白酶底物-arg-asn-arg-序列显示p2位asn比p2位ala高出2倍的灵敏度，而且，p3位处侧链是带正电荷的氨基酸比p3位ala也高出2倍左右的灵敏度，认为计算上比-ala-ala-arg-序列具有约5倍高的灵敏度。
[0088]
作为上述探索三肽的合适氨基酸序列的结果，获得以下发现。
[0089]
众所周知，作为蛋白质分解酶(蛋白酶)的特异性，其根据蛋白质中所包含的氨基酸侧链原子团的结构，对肽键的水解反应速度是不同的。类胰蛋白酶主要识别侧链具有正电荷的arg，并水解其羧基侧的肽键。将酶主要识别的氨基酸位置作为p1位，随着从该位置向n-末端侧的远离依次称为p2位、p3位。这些氨基酸中的甚至一个氨基酸都可以对酶反应速率的差异产生较大影响。另一方面，着眼于蛋白质中氨基酸的侧链，它们大致分为四种类型：酸性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸、中性亲水性氨基酸。它们分别可以由glu、arg、phe、ser代表。由此，作为p2位氨基酸，决定排除glu，引入gly、ala、val、phe、ser、pro。p3位也同样地引入典型的氨基酸。p3位也使用lys。由于必须合成大量的化合物，因此简略化了纯化合成中间体的方法，并且在最终的保护基去除步骤中，使用对三氟乙酸稳定的iboc基。另外，用三氟乙酸除去arg侧链的pmc保护基后，由于产物是与arg侧链形成的盐，iboc-三肽-mca化合物几乎以良好的粉末状获得。
[0090]
通过研究表1的实验结果，可以将类胰蛋白酶底物的氨基酸序列的特征概括为以下5点。(i)明确了p2位的gly是不合适的。(ii)p3位最合适的是侧链为小的甲基的ala，而val或phe这样的体积变大的则灵敏度降低。大的侧链可能难以容纳在酶侧的亚位点s2位中。pro是在其他蛋白酶的底物中通常出现在p2位的氨基酸。(iii)非蛋白质性的abu显示出比ala稍低的灵敏度。(iv)p3位也与p2位同样地，允许ala或abu这样的小侧链，并且难以键合体积大的疏水性侧链。(v)另一方面，表明p3位可以容纳具有正电荷的lys。将来，如果鉴定了与病理相关的类胰蛋白酶的天然底物蛋白质，且确定了其作用位点的氨基酸序列，可能会在其p3位看到lys吧。
[0091]
实施例2
[0092]
2.合成向类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物键合suc-ala-ala-arg-mca的高分子底物
[0093]
通过以下方法，合成了键合有作为类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物的聚(l-赖氨酸)的类胰蛋白酶活性测定用底物。
[0094]
(1)将fmoc-arg(pmc)-mca(自制，1.1mmol)溶解在20％哌啶/dmf(10ml)中，反应90分钟。蒸馏除去dmf，得到白色固体状的游离胺。将其溶解在dmf(5ml)中，加入boc-ala-ala-oh(自制，1.2mmol)，用hbtu/hobt法缩合。反应4小时后，分离boc-ala-ala-arg(pmc)-mca，并通过硅胶色谱法纯化[产率505mg(62％)]。
[0095]
(2)将boc-ala-ala-arg(pmc)-mca(440mg)溶解在tfa(5ml)中，反应10分钟。迅速
蒸馏出tfa，用二乙醚结晶化。
[0096]
(3)将tfa_h-ala-ala-arg(pmc)-mca(390mg)溶解在dmf(5ml)中，冰冷下加入net3(2.2eq.)和琥珀酸酐(1.2eq.)，室温反应过夜。提取并分离产生的suc-ala-ala-arg(pmc)-mca，将其进一步溶解在tfa(3ml)中，反应2小时除去pmc基。
[0097]
(4)将分子量8,000以上的聚(l-赖氨酸)盐酸盐(peptide institute,inc.制，批号：670515，165mg，1mmol)溶解于水(5ml)中，加入suc-ala-ala-arg-mca_pmcs(164mg，0.2mmol)，用nahco3(21mg，0.5mmol)中和盐酸盐。进一步地，加入n-羟基琥珀酰亚胺(hosu，23mg，0.2mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺_hcl(edc，mw191.7，96mg，0.5mmol)，维持在ph8～9。因为反应液起泡，5小时后加入乙醇(1ml)作为消泡剂。使其反应2天。
[0098]
(5)向反应液中加入少量乙酸以浓缩，并向剩余的浆液中加入乙醇以固化。第二天，通过倾析除去溶剂，再次溶解在蒸馏水中，将乙醇作为消泡剂，浓缩，将乙醇加入剩余的浆液中，获得白色固体。通过真空干燥得到220mg键合有suc-ala-ala-arg-mca的聚(l-赖氨酸)。
[0099]
(6)将3.81mg键合了suc-ala-ala-arg-mca的聚(l-赖氨酸)溶解在50ml蒸馏水中，测定吸收光谱，在280nm的吸光度是0.55。
[0100]
另外，通过以下方法合成了键合有作为类胰蛋白酶难消化性水溶性聚合物的聚(d-赖氨酸)的类胰蛋白酶活性测定用底物。
[0101]
(7)在上述(4)中，除了使用分子量4,000-15,000的聚(d-赖氨酸)氢溴酸盐(sigma-aldrich公司制，批号：slbz6409，42mg，0.2mmol)和suc-ala-ala-arg-mca_pmcs(33mg，0.04mmol)之外，通过与上述(1)～(6)同样的程序对聚(d-赖氨酸)缩合三肽-mca。获得了38mg目标产物。
[0102]
另外，作为用于抑制mca底物进入捕获在α2巨球蛋白四聚体中的凝血酶等凝血系统蛋白酶的合适高分子，考虑了支化聚(赖氨酸)。因此，通过以下方法制备了支化聚(l-赖氨酸)和支化聚(d-赖氨酸)。
[0103]
(8)将二分子的二-boc-l-赖氨酸缩合至六亚甲基二胺。通过tfa脱boc基之后，将四分子二-boc-l-赖氨酸缩合至游离的四个氨基(第二代k6b8。此处k表示l-赖氨酸的个数、b表示boc基的个数)。重复此步骤以将分支扩展到第三代k14b16、第四代k30b32、进一步地到第五代k62b64(chem.commun.,1999,2057-2058(1999))。通过tfa处理k14b16、k30b32和k62b64，获得k14a16(a表示脱保护后的游离氨基(tfa盐))、k30a32和k62a64的tfa盐，为白色粉末(表2)。
[0104]
(9)在上述(8)中，除了代替二-boc-l-赖氨酸使用二-boc-d-赖氨酸之外，按照同样的程序，获得k14a16(k表示d-赖氨酸的个数)、k30a32、和k62a64的tfa盐，为白色粉末(表2)。
[0105]
[表2]
[0106]
支化聚(l-赖氨酸)和聚(d-赖氨酸)的各代的赖氨酸数、游离氨基数、作为tfa盐的分子量、合成产量和产率。
[0107][0108][0109]
*)k是d-赖氨酸的缩略语。
[0110]
通过以下方法将获得的支化聚(赖氨酸)键合至suc-ala-ala-arg-mca。
[0111]
(10)将支化聚(d-赖氨酸)5gk62a64(316mg)溶于水(10ml)中，加入suc-ala-ala-arg-mca_pmcs(330mg，0.4mmol)，用nahco3(43mg，1mmol)中和三氟乙酸盐。进一步地，加入n-羟基琥珀酰亚胺(hosu，50mg，0.4mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺_hcl(edc，200mg，1mmol)，如上述(4)所示反应。获得343mg5gk62a64-suc-ala-ala-arg-mca乙酸盐。
[0112]
实施例3
[0113]
3.使用本发明的底物测定血清中类胰蛋白酶的活性
[0114]
使用实施例2制备的键合有suc-ala-ala-arg-mca的聚(l-赖氨酸)，测试是否可以特异性地测定血清中的类胰蛋白酶活性。
[0115]
(1)将20.0mg键合有suc-ala-ala-arg-mca的聚(l-赖氨酸)溶解于50ml 50mm tris-hcl(ph8.0)中。
[0116]
(2)市售人血清2μl(biowest公司制)与2μl pbs(-)(ph7.4)(对照)或2μl 10μm萘莫司他(nafamostat)(类胰蛋白酶抑制剂，东京化成工业株式会社制)或2μl 10u/ml水蛭素(凝血酶抑制剂，sigma aldrich公司制造)混合，室温放置10分钟后，将每种混合溶液添加到100μl上述(1)制备的溶液中，并立即测定酶活性。
[0117]
结果显示在下表3中。
[0118]
[表3]
[0119]
比较来自添加各种抑制剂的人血清酶活性
[0120]
[0121][0122]
*1以血清+pbs(-)的酶活性为100时的相对值。
[0123]
由表3可见，用本发明的高分子底物检测的血清中的酶活性被类胰蛋白酶抑制剂萘莫司他完全抑制，相反地，未被凝血酶抑制剂水蛭素抑制。由该结果可知，用本发明的高分子底物检测的血清中的酶活性是由类胰蛋白酶引起的，即使是凝血酶等凝血系统酶以被捕获在α2巨球蛋白四聚体中的状态存在的血清样品，显示也可以特异性地测定类胰蛋白酶活性。
[0124]
产业可利用性
[0125]
根据本发明，可以直接测定血液样品中的类胰蛋白酶活性，无需对血液样品进行纯化、浓缩等预处理。因此，至今为止只能由类胰蛋白酶蛋白相关抗原的血中存在量来判定的肥大细胞活化综合征变得能够通过确定类胰蛋白酶活性来更准确地反映疾病状况，因此，在医学领域中的产业可利用性高。