具有增强的T细胞介导的对肿瘤细胞的细胞毒性作用的针对CHI3L1和PD1的双特异性抗体

具有增强的t细胞介导的对肿瘤细胞的细胞毒性作用的针对chi3l1和pd1的双特异性抗体
发明领域
1.本发明的实施方式涉及同时靶向chi3l1和免疫检查点分子pd-1的双特异性抗体。这些双特异性抗体表现出增强的协同细胞毒性效果，强于单独的chi3l1和pd-1抗体(单独或组合)的效果。
2.关于联邦资助研究或开发的声明
3.本发明是在以下资助下开发的：国家卫生研究院(national institutes of health)授予的nih cadet资助uh2 hl123876。政府对本发明享有某些权利。
4.发明背景
5.目前，针对单个免疫检查点抑制剂(icpi)分子的免疫疗法正被有效地应用于多种恶性肿瘤患者，包括肺癌和成胶质细胞瘤。实例包括针对程序性死亡受体1(pd-1)等部分的抗体。然而，只有部分患者对这些治疗有反应。此外，观察到的缓解通常不持久。因此，世界范围内正在加紧努力，开发使用针对包括pd-1在内的免疫检查点分子的抗体来增强icpi免疫疗法的有效性。
6.因此，需要针对单个免疫检查点抑制剂分子(如pd-1)的更有效免疫治疗。
7.发明概述
8.先前的研究证明，几丁质酶3样蛋白1(chi3l1)在各种癌症的发病机制中起着关键作用。此外，我们之前已经证明，抗chi3l1抗体与抗pd-1抗体的组合在癌症治疗中提供协同效应。基于这些发现，我们假设同时靶向chi3l1和pd-1可能具有额外的协同和/或相加的抗肿瘤作用。为了解决这些可能性，开发了同时与chi3l1和pd-1反应的双特异性抗体。
9.本发明的实施方式提供了同时识别并中和chi3l1和免疫检查点抑制剂pd-1的人源化双特异性抗体。双特异性抗体包含抗-人pd-1抗体的抗原结合部分和抗人chi3l1抗体的抗原结合部分。
10.在一些实施方式中，双特异性抗体包含附接至抗-人chi3l1抗体骨架的抗-人pd-1单链可变片段(scfv-pd1)。scfv-pd1可以被附接至chi3l1抗体重链(chi3l1-hc-pd1)或chi3l1抗体轻链(chi3l1-lc-pd1)。
11.在替代性实施方式中，双特异性抗体包含附接至抗-人pd-1抗体骨架的抗-人chi3l1单链可变片段(scfv-chi3l1)。scfv-chi3l1可以被附接至pd-1抗体重链(pd-1-hc-chi3l1)或pd-1抗体轻链(pd-1-lc-chi3l1)。
12.在一个实施方式中，抗-人chi3l1抗体的抗原结合部分包含以下的互补决定区(cdr)：(a)具有seq id no：4的氨基酸序列的轻链cdr1；(b)具有seq id no：5的氨基酸序列的轻链cdr2；(c)具有seq id no：6的氨基酸序列的轻链cdr3；(d)具有seq id no：1的氨基酸序列的重链cdr1；(e)具有seq id no：2的氨基酸序列的重链cdr2；和(f)具有seq id no：3的氨基酸序列的重链cdr3。在一个实施方式中，抗-人chi3l1抗体的抗原结合部分包含具有seq id no：13的氨基酸序列的重链序列。在一个实施方式中，抗-人chi3l1抗体的抗原结合部分包含具有seq id no：14的氨基酸序列的轻链序列。
13.在一个实施方式中，抗-人pd-1抗体的抗原结合部分包含seq id no：35的氨基酸序列。
14.如本文所述，本发明的双特异性抗体具有显著的抗肿瘤作用。与单独的chi3l1和pd-1抗体(单独或组合)的效果相比，这些双特异性抗体表现出增强的协同细胞毒性效果。本发明的双特异性抗体(i)增强jurkat t细胞对u87细胞的附着；(ii)增强jurkat t细胞在u87细胞中诱导细胞毒性/凋亡反应的能力；(iii)增强与u87细胞共培养的jurkat t细胞中颗粒酶和穿孔素的积累；和/或(iv)增强jurkat t细胞在u87细胞中诱导细胞细胞毒性反应和乳酸脱氢酶(ldh)释放的能力。
15.本发明的实施方式还提供了包含本发明的双特异性抗体和药学上可接受的运载体的药物组合物。在一个实施方式中，药物组合物进一步包含化疗剂。
16.本发明的实施方式还提供了通过给予治疗有效量的本发明的双特异性抗体或药物组合物来治疗对象的癌症的方法。在一个实施方式中，癌症是恶性癌症。在一个实施方式中，癌症是原发癌或转移性癌。在一个实施方式中，癌症是以下其中之一：前列腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤或肺癌。在一个实施方式中，对象是被确定具有升高的chi3l1水平的对象。在一个实施方式中，升高的chi3l1水平是循环chi3l1。在一个实施方式中，癌症表达pd-l1。
17.本发明的双特异性抗体靶向chi3l1和pd-1，并且具有超过单独或组合的抗-chi3l1和抗-pd-1抗体的作用的抗肿瘤细胞毒性作用。
18.本文还描述和叙述了其他实施方式。
19.附图简要说明
20.出于说明的目的，本发明的某些实施方式在下面描述的附图中示出。附图中相同的数字始终表示相同的元件。然而，应理解，本发明不局限于所示的精确设置、尺寸和仪器。图中：
21.图1提供了chi3l1xpd1双特异性抗体结构的示意图。用于产生双特异性抗体的平台示于图1a：chi3l1-lcxscfv-hc-pd1-scfv-lc-pd1(chi3l1-lc-pd1)和图1b：chi3l1-hcxscfv-hc-pd1-scfv-lc-pd1(chi3l1-hc-pd1)。
22.图2显示了chi3l1xpd1双特异性抗体的结合亲和力。chi3l1-lc-pd1抗体的亲和力通过竞争性elisa试验评估：图2a显示了针对重组人(rh)chi3l1的评估；图2b显示了针对rhpd1的评估；和图2c显示了针对rhchi3l1和rhpd1混合物的评估。在chi3l1-lc-pd1和chi3l1-hc-pd1抗体之间，对rhchi3l1或rhpd1的结合亲和力没有差异。
23.图3显示了双特异性chi3l1xpd1抗体显著增强了共培养体系中jurkat t细胞对u87成胶质细胞瘤细胞的附着。jurkat t细胞由抗-人cd3/cd28处理激活(每个5μg/ml，在5％co2和空气在37℃下孵育2小时)然后与u87成胶质细胞瘤细胞共培养。用同种型对照抗体和特异性针对pd-1、chi3l1、chi31l1+pd-1和双特异性chi3l1xpd-1的抗体进行培养。在图3a中，cellbrite细胞质膜染料用于u87(红)和jurkat t细胞(绿)的荧光标记。图3b显示了相差图像，其为用igg对照和指示的抗体(5mg/ml，每个)孵育6小时后捕获的。同种型，igg对照抗体；pd1，a-人pd1抗体；chi3l1，a-人chi3l1抗体；chi3l1+pd1，a-chi3l1抗体加上a-pd1抗体一起；chi3l1xpd1，双特异性chi3l1-pd1抗体。图3c显示了通过计数荧光显微镜评估的附着在每个u87细胞上的jurkat t细胞的数量(原始放大倍数20倍；该评估包括10个随
机选择的区域)。值为平均值
±
sem。通过t检验，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。
24.图4显示chi3l1xpd1双特异性抗体处理增强了u87成胶质细胞瘤细胞在u87-jurkat t细胞共培养物中的死亡反应。jurkat t细胞由抗-cd3/cd28处理激活(每个5μg/ml，在5％co2和空气在37℃下孵育2小时)然后与u87成胶质细胞瘤细胞共培养。用同种型对照抗体和特异性针对pd-1、chi3l1、chi3ll1+pd-1和双特异性chi3l1xpd-1的抗体进行培养。在图4a-b中，cellbrite细胞质膜染料用于活细胞(绿)的荧光标记，碘化丙啶染色用于死细胞(红)。孵育6小时后，用仅载剂(图4a)和igg2b同种型对照或指示的抗体(5mg/ml，每个)(图4b)处理细胞，并捕获荧光图像。在图4c中，tunel染色和图像是在明场显微镜下捕获的。图4d显示了tunel阳性凋亡u87细胞定量。在光学显微镜(原始放大倍数20倍)下对tunel阳性凋亡细胞计数，并以评估的总细胞的％表示(随机选择10个显微镜视野用于该评估)。值为平均值
±
sem。通过t检验，*p＜0.05，**p＜0.01。
25.图5显示了双特异性chi3l1xpd1抗体处理增强了与u87成胶质细胞瘤细胞共培养中jurkat t细胞中颗粒酶的积累。jurkat t细胞由抗-人cd3/cd28处理激活(每个5μg/ml，在5％co2和空气在37℃下孵育2小时)然后与u87成胶质细胞瘤细胞共培养。用同种型对照抗体和特异性针对pd-1、chi3l1、chi31l1+pd-1和双特异性chi3l1xpd-1的抗体进行培养。与igg2b同种型对照和指示的抗体(各5mg/ml)孵育6小时后，捕获荧光图像(图5a)。细胞的双重免疫组织化学染色是用a-颗粒酶和a-鬼笔环肽抗体完成的。图5b显示了颗粒酶+细胞的定量。在荧光显微镜下计数颗粒酶+细胞的数量(原始放大倍数20倍；该评估中包括10个随机选择的区域)。值为平均值
±
sem。通过t检验，*p＜0.05。
26.图6显示了chi3l1xpd1双特异性抗体处理增强了与u87成胶质细胞瘤细胞共培养中jurkat t细胞中穿孔素的积累。jurkat t细胞用抗-人a-cd3/a-cd28处理(各5μg/ml，在5％co2(5％)和空气在37℃下孵育2小时)激活。用同种型对照抗体和特异性针对pd-1、chi3l1、chi31l1+pd-1和双特异性chi3l1xpd-1的抗体进行培养。与igg2b同种型对照和指示的抗体(各5mg/ml)孵育6小时后，捕获图像(图6a)。细胞的双重免疫组织化学染色是用抗-穿孔素和抗-鬼笔环肽抗体完成的。图6b显示了穿孔素阳性(+)细胞的定量。计算每个显微视野中穿孔素+细胞的平均数量(原始放大倍数20倍)。同种型，igg2b对照抗体；pd1，抗-人pd1抗体；chi3l1，抗-人chi3l1抗体；chi3l1+pd1，抗-chi3l1抗体加上抗-pd1抗体一起；chi3l1xpd1，双特异性chi3l1-pd1抗体。原始放大倍数20倍。值为平均值
±
sem。通过t检验，*p＜0.05，**p＜0.01。
27.图7显示双特异性chi3l1xpd1抗体处理增强了u87细胞在jurkat-u87共培养物中的ldh释放。jurkat t细胞用抗-人cd3/cd28处理(各5μg/ml，在5％co2和空气在37℃下孵育2小时)激活。用同种型对照抗体和特异性针对pd-1、chi3l1、chi3ll1+pd-1和双特异性chi3l1xpd-1的抗体进行培养。与igg对照和指示的抗体(各5mg/ml)孵育6小时后，通过测定试剂盒(皮尔斯(pierce)ldh细胞毒性测定试剂盒)测量ldh活性。ns，不显著，通过t检验，*p＜0.05，**p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。将共培养中u87细胞释放的ldh与单独的u87细胞(-ve对照)、用裂解缓冲液(+ve对照)处理的u87中的总ldh和用裂解缓冲液(jurkat)处理的jurkat细胞释放的ldh的水平进行比较。
28.图8显示双特异性chi3l1xpd1抗体处理诱导协同的ctl-介导的肿瘤细胞死亡反应和肿瘤细胞pten表达。(a列)使用原位细胞检测试剂盒-荧光素dutp对细胞凋亡的肿瘤细胞
死亡的代表性证明和定量。tunel(+)细胞染色为绿色。(b-d列)cd8(b列)、穿孔素(c列)和颗粒酶(d列)的jurkat t细胞表达的代表性证明和量化。肿瘤细胞为绿色，阳性染色的jurkat细胞为黄橙色。(e列)肿瘤细胞pten的代表性证明和量化。肿瘤细胞为绿色，pten为黄橙色。(f行)a-e列中评估的量化。图示了tunel+肿瘤细胞的百分比(a列)、表达cd8(b列)、穿孔素(c列)和颗粒酶(d列)的jurkat细胞的百分比以及表达pten的肿瘤细胞的百分比(e列)。这些评估是使用荧光显微镜(原始放大倍数20倍)完成的。在这些量化中，评估了10个随机选择的视野。图f中的值是上述4次评估的平均值+sem。＊＊p＜0.01.＊＊＊p＜0.001.比例尺＝10μm，适用于a-e的所有子图。
具体实施方式
29.应理解，为了提供本发明的实质性的理解，下文将对本发明的某些方面、模式、实施方式、变化和特征进行不同程度的详述。
30.定义
31.方便起见，下文提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明，或从上下文中暗示，以下术语和短语包含下文所提供的含义。提供定义是为了协助描述具体的实施方式，不意在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求书的限制。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。如果术语在本领域与本文中提供的定义有明显的差异，则应以说明书中提供的定义为准。
32.在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式
″
一个
″
、
″
一种
″
和
″
该
″
包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。例如，提及
″
一种细胞
″
包括两种或更多种细胞的组合等。
33.如本文所用，术语“或”意为“和/或”。在例如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括a和b；a或b；a(单独)；和b(单独)。类似地，在例如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一种：a、b、和c；a、b、或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
34.缩写
″
例如(e.g.)
″
衍生自拉丁文例如(exempligratia)，在本文中用于表示非限制性的例子。因此，缩写
″
例如(e.g.)
″
与
″
以此为例(for example)
″
同义。
35.如本文所用，关于数值或参数的术语“约”或“大约”通常被认为包括落在某数字在任一方向(大于或小于)上的5％、10％、15％或20％以内的数字，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非该数字是小于可能值的0％或超过可能值的100％)。如本文所用，提及值或参数时的“约”或“大约”包括(并公开)涉及该值或参数的实施方式。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
36.如本文所用，术语
″
包括
″
意为除了所提出的定义的元件外，还可以存在其他元件也。
″
包括
″
的使用表示包含而不是限制。
37.术语“由......组成”指本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素。
38.如本文所用，术语“基本上由......组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明的该实施方式的基本和新颖的或功能的特征的附加要
素。
39.术语
″
统计学显著的
″
或
″
显著
″
是指统计学显著性，通常指两个标准差(2sd)或更大的差异。
40.如本文所用，短语
″
治疗有效量
″
、
″
有效量
″
或
″
有效剂量
″
是指在治疗、预防或管理肿瘤或恶性肿瘤方面提供治疗或美学益处的量，例如，在统计学上显著减少肿瘤或恶性肿瘤的至少一个症状、迹象或标志物的量。应理解，将有许多本领域内已知的方法来确定特定应用的有效量。例如，用于确定剂量的药理学方法可应用于治疗内容中。在治疗或预防应用的内容中，给予对象的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，例如总体健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还取决于疾病的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。组合物也可以与一种或多种其它治疗化合物组合给予。
41.如本文所用，术语“治疗”、“疗法”、“处理”或“改善”当用于指疾病、病症或医学病症时，是指病症的治疗性处理，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症的至少一种不良反应或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果病症的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期的症状进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、缺陷程度的减轻、肿瘤或恶性肿瘤的稳定(即，不恶化)状态、肿瘤生长和/或转移的延迟或减慢，以及与没有治疗时预期的寿命相比增加的寿命。
42.如本文所用，术语“给药”是指通过方法或途径将如本文所公开的双特异性抗体放置到对象体内，导致在所需位点处至少部分地递送药剂。包含本文公开的化合物的药物组合物可以通过在对象中产生有效治疗的任何适当途径给予。
43.如本文所用，术语“长期”给药是指治疗剂或药物被给予至少12周的时间段。这包括治疗剂或药物被给予以使其在至少12周的时间段内有效，不一定意味着给药本身持续12周，例如，如果使用持续释放组合物或长效治疗剂或药物。因此，对象接受至少12周的治疗。在许多情况下，长效给药持续至少4、5、6、7、8、9个月或更长，或持续至少1、2、3、5、7或10年或更长时间。
44.本文考虑的组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。在一个优选的实施方式中，组合物肠胃外给予。本文所用术语“胃肠外给药”和“经胃肠外给予”表示除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，包括但不限于血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、瘤内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注给药。在一个实施方式中，本文所考虑的组合物通过直接注射进肿瘤、淋巴结或感染部位中给予对象。
45.如本文所用，术语“癌症”通常涉及异常细胞不受控制地分裂并可侵袭附近组织的一类疾病或病症。癌细胞还可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部分。癌症有几种主要类型。癌(恶性上皮肿瘤)(carcinoma)是起源于里衬(line)或覆盖内脏器官的皮肤或组织的癌症。肉瘤是起源于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。白血病是始于造血组织(如骨髓)的癌症，并导致大量异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤
和多发性骨髓瘤是起源于免疫系统细胞。中枢神经系统癌是起源于大脑和脊髓组织的癌症。
46.在任何方面的一些实施方式中，癌是原发癌。在任何方面的一些实施方式中，癌是恶性癌症。如本文所用，术语“恶性”是指其中一组肿瘤细胞表现出一种或多种不受控制的生长(即超出正常范围的分裂)、侵袭(即侵入和破坏邻近组织)和转移(即通过淋巴或血液扩散到身体的其他位置)的癌症。如本文所用，术语“转移”是指癌症从身体的一部分扩散到另一部分。由已经扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”或“转移”。转移性肿瘤包含与原始(原发)肿瘤中的细胞相似的细胞。
47.如本文所用，术语“良性”或“非恶性”是指可能生长得更大但不会扩散到身体其他部分的肿瘤。良性肿瘤是自限性的，通常不会侵袭或转移。
[0048]“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长物或组织的单个细胞。肿瘤通常是指由细胞异常生长形成的肿块或病灶，其可以是良性的、癌前的或恶性的。大多数癌细胞形成肿瘤，但是一些(例如白血病)不一定形成肿瘤。对于那些形成肿瘤的细胞，术语癌(细胞)和肿瘤(细胞)可以互换使用。
[0049]
患有癌症或肿瘤的对象是有客观可测量的癌细胞存在于对象的体内的对象。该定义包括恶性的、活跃增殖的癌症，以及潜在的休眠肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并植入其他重要器官的癌症最终会通过受影响的器官的功能劣化导致对象死亡。造血癌症(例如白血病)能够竞争过对象的正常造血隔室，从而导致造血衰竭(以贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。
[0050]
癌症的实例包括但不限于：恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤(gbm)；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其他癌和肉瘤；以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞性(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母细胞nhl；高级淋巴母细胞nhl；高级小非分裂细胞nhl；巨大肿块ehl(bulky disease nhl)；套细胞淋巴瘤；aids相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症(waldenstrom’s macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性淋巴细胞白血病(all)；毛细胞白血病；慢性髓性白血病；和移植后淋巴组织增生性疾病(ptld)，以及与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合征。
[0051]“癌细胞”是体内、离体或组织培养中的癌细胞、癌前细胞或转化的细胞，其具有自发的或诱导的表型变化，不一定涉及摄取新的遗传物质。尽管转化可以由转化病毒的感染和新基因组核酸的纳入，或外源核酸的摄取引起，但它也可以自发地或在暴露于致癌物后发生，从而使内源基因发生突变。转化/癌症涉及例如形态变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、非贴壁依赖性、恶性、接触抑制丧失和生长密度限制、生长因子或血清非依赖
性、肿瘤特异性标志物、侵袭性或转移，和在合适的动物宿主(如裸鼠)中的肿瘤生长。
[0052]
对象可以是先前已被诊断患有或鉴定为患有需要治疗的病症(例如，癌症)或与此类病症相关的一种或多种并发症的对象，并且(可选地但不必要)已经经历过对某种病症或与该病症相关的一种或多种并发症的治疗。或者，对象也可以是先前未被诊断为患有需要治疗的病症或与这种病症相关的一种或多种并发症的对象。例如，对象可以是表现出一种或多种病症风险因素或与病症相关的一种或多种并发症的对象，或不表现出风险因素的对象。特定病症的“需要治疗的对象”可以是患有该病症、被诊断为患有该病症或处在发展该病症的风险中的对象。如本文进一步解释的，在一些实施方式中，对象是确定具有升高的chi3l1水平的对象。在一些实施方式中，chi3l1是循环chi3l1。在一些实施方式中，对象患有表达pd-l1的癌症。
[0053]
术语“减少”、“减小”、“降低”或“抑制”在本文中均用于表示统计学显著量的减少。在一些实施方式中，“减小”、“降低”或“减少”或“抑制”通常是指与参考水平(例如，不存在给定的治疗或药剂)相比减少至少10％，并且可以包括，例如，减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不涵盖与参考水平相比完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比100％抑制。对于没有给定病症的个体，降低可以优选下降到在正常范围内可接受的水平。
[0054]
术语“增加了”、“增加”、“增强”或“激活”在本文中均用于表示统计学显著量的增加。在一些实施方式中，术语“增加了”、“增加”、“增强”或“激活”可意为与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达，且包括与参考水平相比增加100％或10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或2倍和10倍之间的任何增加或更多。在标志物或症状的上下文中，“增加”是该水平统计学显著的增加。
[0055]
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，以表示一系列氨基酸残基，通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，无论其大小或功能。虽然“蛋白质”和“多肽”通常用于指代相对较大的多肽，而“肽”通常用于指小多肽，但是本领域中这些术语的使用重叠。当指代基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述的其他等同物、变体、片段和类似物。
[0056]
本文所述的各种实施方式中，进一步考虑了所述的任何特定多肽的变体(天然存在的或其他方式)、等位基因、同源物、保守修饰的变体、和/或保守取代的变体都涵盖在内。至于氨基酸序列，本领域技术人员应认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的一些个体取代、缺失或添加(其改变了编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代，并保留了多肽的所需活性。此类保守修饰的变体是与本公开一致的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。
[0057]
在一些实施方式中，本文所述的多肽(或编码此类多肽的核酸)可以是本文所述的
氨基酸序列之一的功能性片段。如本文所用，“功能性片段”是根据本文下文描述的测定保留了至少50％的野生型参考多肽的活性的肽的片段或区段。功能性片段可包含本文公开的序列的保守取代。
[0058]
在一些实施方式中，本文所述的多肽可以是本文所述序列的变体。在一些实施方式中，变体是保守修饰的变体。例如，保守取代变体可以通过天然核苷酸序列的突变获得。如本文所指，“变体”是与天然或参考多肽基本同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与天然或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。编码变体多肽的dna序列包括与天然或参考dna序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代的序列，但其编码保留活性的变体蛋白质或其片段。各种基于pcr的位点特异性诱变方法是本领域已知的并且可由普通技术人员应用。
[0059]
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指任何分子，优选聚合分子，包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元。核酸可以是单链的或双链的。单链核酸可以是变性的双链dna的一条核酸链。或者，它可以是不源自任何双链dna的单链核酸。一方面，核酸可以是dna。另一方面，核酸可以是rna。合适的dna可包括，例如，基因组dna或cdna。合适rna可包括，例如mrna。
[0060]
在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的多肽、核酸或细胞可以是工程化改造的。如本文所用，“工程化的/工程化改造的”指经人工操作过的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如，其序列经人工操作与其天然存在的方面不同时，多肽被认为是“工程化的/工程化改造的”。正如本领域技术人员所做和所知的，工程化细胞的后代通常仍被称为是“工程化的/工程化改造的”，即使实际操作是在先前的实体上进行的。
[0061]
在一些实施方式中，载体包括编码如本文所述的多肽(例如抗体或抗体试剂)的核酸。在本文所述的一些方面中，编码如本文所述的给定多肽或其任何模块的核酸序列可操作地连接至载体。载体可以包括但不限于：克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。
[0062]
如本文所用，术语“表达载体”是指指导rna或多肽从与载体上连接至转录调控序列的序列中表达的载体。所表达的序列往往(但不一定)是与细胞异源性的。表达载体可以包含其他元件，例如，表达载体可以具有个复制系统，从而使其可以在两个生物体中维持，例如在人细胞中用于表达的和在原核宿主中用于克隆和扩增的。术语“表达”是指涉及生产rna和蛋白质和视情况而定分泌蛋白质的细胞过程，包括(如适用)但不限于，例如，转录、转录本加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过翻译从基因转录的mrna得到的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接至适当的调节序列时，在体外或体内被转录(dna)为rna的核酸序列。基因可以包括也可以不包括编码区之前和之后的区域，如5’非翻译(5’utr)或“前导”序列和3’utr或“尾区”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0063]
本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”，就核酸或多肽而言，是指从至少一种与核酸或多肽一起存在于天然来源中，和/或当核酸或多肽被细胞表达时将与之一起存在，或在分泌型多肽的情况下被分泌的其他成分(例如核酸或多肽)中分离出来的核酸或多肽。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被视为“分离的”。术语“纯化的”或“基本纯化的”是指分离的核酸或多肽按重量计算至少是主体核酸或多肽的95％，
例如包括至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多。在一些实施方式中，如本文所述的抗体、其抗原结合部分或嵌合抗原受体(car)是分离的。在一些实施方式中，如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car是纯化的。
[0064]
如本文所用，“工程化的/工程化改造的”指经人工操作过的方面。例如，当抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、car或双特异性抗体的序列经人工操作而与其天然存在的序列不同时，抗体、抗体试剂、其抗原结合部分、car或双特异性抗体可被认为是“工程化的/工程化改造的”。正如本领域技术人员所做和所知的，工程化多核苷酸和/或多肽的后代和拷贝通常仍被称为是“工程化的/工程化改造的”，即使实际操作是在先前的实体上进行的。
[0065]
如本文所用，“表位”可以由连续氨基酸或由蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸在多肽上形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含呈现独特空间构象的至少3个、更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。“表位”包括传统上由免疫球蛋白vh/vl对结合的结构单元。表位定义了抗体的最小结合位点，因此代表了抗体的特异性靶标。在单域抗体的情况下，表位代表了可变结构域独立结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可以互换使用。在某些实施方式中，表位决定簇包括有化学活性的成组表面分子(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团)，而在某些实施方式中，表位决定簇可具有特定的三维结构特点和/或特定的荷电特点。
[0066]
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链构成的抗体，以及包括全长抗体和其抗原结合部分的各种形式，包括例如，免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr-移植抗体、人源化抗体、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、二硫化物接头fv、scfv、单域抗体(dab)、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗-独特型抗体、双特异性抗体、其功能性活化表位-结合部分和/或双功能杂交抗体。
[0067]
各重链包含所述重链可变区(本文中缩写为hcvr或vh)和所述重链恒定区。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。各轻链包含所述轻链的可变区(本文中缩写为lcvr或vl)和所述轻链恒定区。轻链恒定区由cl结构域组成。vh和vl结构域可以进一步分为称为互补决定区(cdr)的高变区和称为框架区(fr)的间插保守区。因此，每个vh和vl区域由三个cdr和四个fr组成，从n末端到c末端按照如下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。这种结构是本领域普通技术人员所熟知的。
[0068]
如本文所用，术语“cdr”指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的可变区各自有三个cdr，其被称为可变区的cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的确切边界根据不同的系统有不同的定义。由kabat等(1987)和(1991)描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，还提供了定义三个cdr的精确残基边界。这些cdr可以被称为kabat cdr。与kabat cdr重叠的定义cdr的其他边界已经描述于padlan等(1995)、maccallum等(1996)和chothia等(1987)和(1989)。还有其他cdr边界定义可能不严格遵循上述系统之一，但是仍然会与kabat cdr重叠，虽然根据预测或实验结果，其特定残基或残基组甚至整个cdr不显著影响抗原结合，它们可能会被缩短或延长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一个定义的cdr，尽管优选的实施方式使用kabat定义的cdr。
[0069]
术语抗体的“抗原结合部分”指的是如本文所用抗体的一个或多个部分，所述部
分)还具有本文上述所定义的结合亲和力。完整抗体的部分已被证明能够进行抗体的抗原结合功能。根据术语抗体的“抗原结合部分”，结合部分的实例包括(i)fab部分，即单价部分，包括vl、vh、cl和ch1结构域；(ii)f(ab
′
)2部分，即二价部分，包括铰链区通过二硫桥彼此连接的两个fab部分；(iii)fd部分，包括vh和ch1结构域；(iv)fv部分，包括抗体单臂的fl和vh结构域；和(v)dab部分，由vh结构域组成或由vh、ch1、ch2、dh3或vh、ch2、ch3(dab，或单域抗体，仅包含也已经显示出特异性结合至靶表位的vl结构域)组成。尽管fv部分的两个结构域(即vl和vh)分别由不同基因编码，但可利用合成接头(例如，多聚-g4s氨基酸序列(
‘
g4s’如美国专利号10,253,111中seq id no：29所公开)和重组方法使其彼此连接，使得有可能将它们制备成一条蛋白链，其中vl和vh结构域组合以形成单价分子(称为单链fv(scfv))。术语抗体的“抗原结合部分”也意为包含这种单链抗体。单链抗体的其他形式例如“双抗体”同样包括在此处。双抗体是二价、双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达于单个多肽链上，但是使用的接头太短而不能将两个结构域组合在同一条链上，从而迫使所述结构域与不同链的互补结构域配对，以形成两个抗原结合位点。免疫球蛋白恒定区指的是重链或轻链恒定区。人igg重链和轻链恒定区氨基酸序列在本领域是已知的。
[0070]
如本文所用，术语“抗体试剂”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的多肽，其特异性结合给定抗原。抗体试剂可包含含有抗体的抗原结合域的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体试剂可包含含有单克隆抗体的抗原结合域的单克隆抗体或多肽。例如，抗体可以包含重(h)链可变区(本文中缩写为vh)，和轻(l)链可变区(本文中缩写为vl)。
[0071]
在另一个实例中，抗体包含两条重(h)链可变区和两条轻(l)链可变区。术语“抗体试剂”包括抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、fab和sfab片段、f(ab
′
)2、fd片段、fv片段、scfv和单域抗体(dab)片段以及完整抗体。
[0072]
抗体可以具有iga、igg、ige、igd、igm(以及它们的亚型和组合)的结构特征。抗体可以来自任何来源，包括小鼠、兔、猪、大鼠和灵长类(人和非人灵长类)以及灵长类化抗体。抗体还可以包括中抗体(midibody)、人源化抗体、嵌合抗体等等。
[0073]
此外，如本文所述的抗体、其抗原结合部分或car可以是所述抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价缔合(association)形成的更大的免疫粘附分子的部分。与这种免疫粘附分子相关的是使用链霉亲和素核心区以制备四聚体scfv分子，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和c-末端多组氨酸残基(polyhistidinyl)，例如六聚组氨酸残基(hexahistidinyl)标签(
‘
六聚组氨酸残基标签’如美国专利号10,253,111中seq id no：30所公开)以生产二价和生物素化的scfv分子。
[0074]
在一些实施方式中，本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car可以是免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr-移植抗体、人源化抗体、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体(dual specific antibody)、抗-独特型抗体、双特异性抗体(bispecific antibody)和其功能性活化表位-结合部分。
[0075]
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是完全人抗体。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是人源化抗体或抗体试剂。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是完全人源化抗体或抗体试剂。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体
或抗体试剂。在一些实施方式中，抗体、其抗原结合部分是重组多肽。在一些实施方式中，car包含结合chi3l1的胞外结构域，其中胞外结构域包含人源化或嵌合抗体或其抗原结合部分。
[0076]
术语“人抗体”指的是其可变区和恒定区对应于或衍生自人种系(human germ line)的免疫球蛋白序列的抗体，例如kabat等(1991)所述。然而，人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由随机或体外位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中，具体在cdr3中。如本文所述的重组人抗体具有可变区，而且也可以含有衍生自人种系的免疫球蛋白序列的恒定区。参见，kabat，等(1991)。然而，根据具体的实施方式，这种重组人抗体经历体外诱变(或者，如果使用由人ig序列的转基因动物，体内体细胞诱变)，从而重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是虽然相关于或衍生自人种系vh和vl序列，但可能并不天然存在于体内人抗体种系库(repertoire)内的序列。根据具体实施方式，这种重组抗体是选择性诱变或回复突变或两者都有的结果。优选地，诱变导致对靶标的亲和力更强，和/或对非靶标结构的亲和力更弱于亲本抗体。本领域普通技术人员从本文提供的序列和信息可以实施人源化抗体的产生而无需过多的实验。在一种方法中，有四个用于人源化单克隆抗体的通用步骤，参见例如，美国专利第5,585,089号；第6,835,823号；第6,824,989号。它们是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区；(3)实际的人源化方法/技术；和(4)人源化抗体的转染和表达。
[0077]
在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分和/或car可以是本文所述的序列的变体，例如，抗体多肽的保守取代变体。在一些实施方式中，变体是保守修饰的变体。例如，保守取代变体可以通过天然核苷酸序列的突变获得。如本文所指，“变体”是与天然或参考多肽基本同源的多肽，但由于一个或多个缺失、插入或取代而具有与天然或参考多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。编码变体多肽的dna序列包括与天然或参考dna序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代的序列，但其编码保留活性的变体蛋白质或其部分，例如，对于相关靶多肽(例如chi3l1或pd-1)的抗原特异性结合活性。各种基于pcr的位点特异性诱变方法也是本领域已知的并且可由普通技术人员应用。
[0078]
通常人源化抗体和人抗体变体的cdr区是基本相同的，更通常地，与小鼠或其衍生来源的人抗体相对应的cdr区相同。在一些实施方式中，有可能对cdr残基进行一个或多个保守氨基酸取代，而不明显影响所得的人源化免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力。在一些实施方式中，cdr区的取代可以增强结合亲和力。
[0079]
术语“嵌合抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有鼠重链和轻链可变区连接至人恒定区的抗体。人源化抗体具有基本来自人抗体的(称为受者抗体)可变区框架残基和基本来自非人抗体(例如，小鼠抗体)的互补决定区(称为供者免疫球蛋白)。如果存在一种或多种恒定区，也基本或完全来自人免疫球蛋白。人可变结构域通常选自人抗体，其框架序列与cdr衍生来源的(鼠)可变区结构域存在高度序列相同性。重链和轻链可变区框架残基可以与相同或不同人抗体序列的区域基本相似。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列或可以是几种人抗体的共有序列。
[0080]
此外，还可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术，即把来自小鼠或其他物种的具有适当抗原特异性的抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。嵌合抗体的可变区段通常连接至至少部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。人恒定区dna序列可以根据已知方法从多种人细胞中分离，例如永生化b细胞。抗体可以包含轻链和重链可变区。重链恒定区可以包含ch1、铰链、ch2、ch3和(有时)ch4区。用于治疗目的，ch2结构域可以缺失或省略。
[0081]
此外，如本文所述，重组人源化抗体可以进一步被优化为减少潜在的免疫原性而保持功能活性，用于人的治疗。在这方面，功能活性意为能够展示一个或多个已知与本文所述的重组抗体、其抗原结合部分或car相关的功能活性的多肽。这种功能活性包括结合至癌细胞和/或抗癌活性。此外，具有功能活性的多肽意为该多肽展示出与本文所述的参考抗体、其抗原结合部分或car的活性相似(但不一定相同)的活性，包括成熟形式，如在特定测定(例如生物学测定)中测量的，具有或不具有剂量依赖性。在剂量依赖性确实存在的情况下，它不需要与参考抗体、其抗原结合部分或car相同，而是与本文所述的参考抗体、其抗原结合部分或car相比，与给定的活性中的剂量依赖性基本相似(即候选多肽将表现出更强的活性，或相对于本文所述抗体、抗原结合部分和/或car低不超过约25倍、约10倍或约3倍的活性)。
[0082]
在一些实施方式中，本文所述的抗体试剂(例如抗体或car)是非天然存在的生物分子。例如，如果没有人的干预和操作，例如由人进行的制造步骤，针对人来源的抗原生成的鼠抗体就不会在自然界存在。嵌合抗体也不是自然发生的生物分子，例如，它们包括从多个物种获得的序列，并组装成一个重组分子。在某些特定的实施方式中，本文所述的人抗体试剂不是天然存在的生物分子，例如，针对人抗原的完全人抗体将在自然界中受到负选择，并且在人体中非天然存在。
[0083]
在一些实施方式中，抗体、抗体试剂、其抗原结合部分和/或car是分离的多肽。在一些实施方式中，抗体、抗体试剂、其抗原结合部分和/或car是纯化的多肽。在一些实施方式中，抗体、抗体试剂、其抗原结合部分和/或car是工程化改造的多肽。
[0084]“亲合力”是衡量抗原结合分子(如本文所述的抗体或其抗原结合部分)和相关抗原之间的结合强度。亲合力与抗原决定簇和其在抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数量有关。通常，抗原结合蛋白(例如本文所述的抗体或抗体的部分)将会结合至它们的同源或特定抗原，其解离常数(kd为10-5
至10-12
摩尔/升或更少，例如10-7
至10-12
摩尔/升或更少，或10-8
至10-12
摩尔/升(即，缔合常数(ka)为105至10
12
升/摩尔或更高，例如107至10
12
升/摩尔或108至10
12
升/摩尔)。任何kd值大于10-4
摩尔/升(或任何ka值低于104m-1
)通常被认为表示非特异性结合。被认为有意义(例如特异性)的生物相互作用的kd通常在10-10
m(0.1nm)至10-5
m(10000nm)范围内。相互作用越强，其kd越低。例如，本文所述的抗体或其部分的结合位点将结合至所需抗原，其亲和力低于500nm，例如低于200nm，或低于10nm，例如低于500pm。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以用任何本身已知的适当方式确定，包括例如scatchard分析和/或竞争性结合试验，如放射免疫测定(ria)、酶免疫测定法(eia)和夹心竞争测定，以及本领域本身已知的其不同变体；以及本文提及的其他技术。
[0085]
因此，如本文所用，“选择性结合”或“特异性结合”指的是本文所述的肽(例如抗
体、car、双特异性抗体或其部分)结合至靶标，例如存在于癌细胞的细胞表面的抗原，其kd为10-5
m(10000nm)或更低，例如，10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、10-12
m或更低。特异性结合可以受到例如多肽剂的亲和力和亲合力以及多肽剂的浓度的影响。本领域的普通技术人员可以使用任何合适的方法，例如在合适的细胞结合试验中滴定多肽剂，来确定本文所述的多肽剂选择性地结合靶标的适当条件。特异性结合至靶标的多肽不会被非类似的竞争者替代。在一些实施方式中，抗体、其抗原结合部分、car或双特异性抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称为与抗原特异性结合。
[0086]
在某些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为10-5
m(10000nm)或更低，例如10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、10-12
m或更低。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-5
m至10-6
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-6
m至10-7
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-7
m至10-8
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-8
m至10-9
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-9
m至10-10
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-10
m至10-11
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为约10-11
m至10-12
m。在一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car结合至chi3l1和pd-1，其解离常数(kd)为低于10-12
m。
[0087]
本文公开的发明的可替代性元素或实施方式的分组不应理解为限制。每组成员可以单独与该组的其他成员或在本文中的其他元素的任何组合中被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，组中一个或多个成员可被包括于组中(或从中删除)。当发生任何这种包含或删除时，说明书在本文中被视为包含经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有markush组的书面描述。
[0088]
除非另作说明，本技术所用的科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以改变。这里使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书定义。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下中找到：《默克诊断和治疗手册》(t
he m
erckmanual of d
iagnosis and t
herapy
)，第19(2011)；《分子细胞生物学和分子医学百科全书》(t
he e
ncyclopedia of m
olecular c
ell b
iology andmolecular m
edicine
)，(1999-2012)；《分子生物学和生物技术：全面案头参考》(m
olecular b
iology and b
iotechnology
：a c
omprehensive d
esk r
eference
)，(1995)；《免疫学》(i
mmunology
)(2006)；j
aneway
的《免疫生物学》(i
mmunobiology
)(2014)；lewin的《基因xi》(g
enes xi)(2014)；《分子克隆：实验室手册》(m
olecular c
loning
：a l
aboratory m
anual
)，第4版(2012)；《分子生物学基础方法》(b
asic m
ethods in m
olecular b
iology
)(2012)；《酶学实验室方法：dna》(l
aboratory m
ethods in e
nzymology
：dna)(2013)；《分子生物学现行方案》(c
urrent p
rotocols in m
olecular b
iology
)(cpmb)(2014)；《蛋白质科学现行方案》c
urrent p
rotocols in p
rotein s
cience
(cpps)(2005)；和《免疫学现行方案》c
urrent p
rotocols in i
mmunology
(cpi)(2003)，其内容
通过引用整体全部纳入本文。
[0089]
本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化疗剂。参见，例如，《医师的癌症化疗药物手册》(p
hysicians
′ c
ancer c
hemotherapy d
rug m
anual
)(2014)；《哈里森内科学原理》(harri
son
′
s p
rinciples of i
nternal m
edicine
)，第18版，第85章(2011)；《a
beloffs
临床肿瘤学》(a
beloffs c
linical o
ncology
)，第5版，第28-29章(2013)；和《癌症化疗手册》(t
he c
ancer c
hemotherapy h
andbook
)，第4版(2003)。
[0090]
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的公开内容不涉及克隆人类的过程、修改人类种系遗传相同性的过程、人类胚胎用于工业或商目的的用途或修改动物的遗传相同性的过程，其可能导致它们遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医疗益处，而且也没有动物从这种过程中产生。
[0091]
其他术语在本发明的各个方面的描述之内在本文中定义。
[0092]
本发明的双特异性抗体
[0093]
由于令人印象深刻且持久的临床反应，使用抗-程序性死亡-1(pd-1)或抗-pd-1配体1(pd-l1)抗体的免疫疗法已经被批准用于治疗几种癌症；然而，总体而言，目前只有一小部分患者从单独的pd-1阻断疗法中获益(topalian等，2012；herbst等，2014；powles等，2014；ansell等2015；garon等，2015；postow等，2015；robert等，2015a，b；weber等，2015；nghiem等，2016；ribas等，2016)。抗-pd-1/l1抗体与其他免疫调节剂的组合似乎更有活性，但它增加了显著的毒性(wolchok等，2013；larkin等，2015；postow等，2015)。
[0094]
在我们之前的工作中，我们证明了抑制(a)chi3l1和/或chi3l1信号转导和(b)至少一种免疫检查点蛋白，例如pd-1，在癌症(例如肺癌)治疗中提供协同作用。参见例如，美国专利公开号2019/0062457。当抗-chi3l1抗体(frg)与抗-pd-1抗体组合给药时，观察到协同作用，该组合在减少b16f10转移中表现出改进的功效，从而表明chi3l1抑制和检查点蛋白抑制的组合在癌症治疗中提供协同功效。参见美国专利公开号2019/0062457的实施例2。推测特异性结合chi3l1多肽和pd-1多肽并同时检测并中和chi3l1和免疫检查点抑制剂pd-1的双特异性抗体能够在癌症治疗中展示改进的协同功效。
[0095]
本文所述的是结合chi3l1多肽和pd-1多肽且同时检测并中和chi3l1和免疫检查点抑制剂pd-1的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合片段或嵌合抗原受体(car)。此类双特异性抗体、其抗原结合部分等，可允许例如癌症的诊断、预后和/或治疗。在一些实施方式中，本文所述技术涉及用于癌症的嵌合抗原受体(car)和car-t疗法。在一些实施方式中，本文所述技术涉及用于癌症的单克隆抗体疗法。在一些实施方式中，本文所述技术涉及用于癌症治疗的抗体药物偶联物。
[0096]
本文所述的是涉及双特异性抗-chi3l1和抗-pd-1抗体、抗体试剂、其抗原结合片段的方法和组合物，它们展示出优良的特性，例如离体和体外的高灵敏度、高特异性、高结合亲和力、中和活性。还提供了通过给予本文所述的化合物治疗的方法，例如治疗癌症。
[0097]
本发明的双特异性抗体包含抗-人pd-1抗体的抗原结合部分和抗-人chi3l1抗体的抗原结合部分。在一些实施方式中，双特异性抗体包含附接至抗-人chi3l1抗体骨架的抗-人pd-1单链可变片段(scfv-pd1)。在替代性实施方式中，双特异性抗体包含附接至抗-人pd-1抗体骨架的抗-人chi3l1单链可变片段(scfv-chi3l1)。
[0098]
本领域技术人员应认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的一些个体取代、缺失或
添加(其改变了编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代，并保留了特异性结合靶抗原(例如，chi3l1和pd-1)的能力。此类保守修饰的变体是与本公开一致的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。
[0099]
取代变体的实例包括氨基酸的保守取代，例如在不改变cdr的序列的vh或v
l
结构域中。不包含于cdr的序列中的保守取代可以是相对于野生型或天然存在的序列的取代，例如人或鼠框架和/或抗体序列的恒定区。
[0100]
给定的氨基酸可以被具有相似生理化学特性的残基替换，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(例如彼此为ile、val、leu或ala)，或用一个极性残基取代另一个(例如lys和arg之间；glu和asp之间；或gln和asn之间)。其他此类保守取代是众所周知的，例如具有相似疏水特性的整个区域的取代。可以在本文所述的任何一种测定中测试包含保守氨基酸取代的多肽以确认所需活性，例如天然或参考多肽的抗原结合活性和特异性被保留。
[0101]
氨基酸可以根据其侧链性质中的相似性分组(《生物化学》(b
iochemistry
)，第2版(1975)第73-75页)：(1)非极性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)；(2)不带电荷的极性：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)；(3)酸性：asp(d)、glu(e)；(4)碱性：lys(k)、arg(r)、his(h)。或者，天然产生的残基可以基于共同的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳族：trp、tyr、phe。非保守性取代将需要一组的成员换为另一组的成员。具体的保守取代包括，例如；ala变成gly或变成ser；arg变成lys；asn变成gln或变成h is；asp变成glu；cys变成ser；gln变成asn；glu变成asp；gly变成ala或变成pro；his变成asn或变成gln；ile变成leu或变成val；leu变成i1e或变成val；lys变成arg，变成gln或变成glu；met变成leu，变成tyr或变成ile；phe变成met，变成leu或变成tyr；ser变成thr；thr变成ser；trp变成tyr；tyr变成trp；和/或phe变成val，变成ile或变成leu。
[0102]
变体氨基酸或dna序列优选为与天然或参考序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更多相同。天然和突变序列之间的同源性程度(相同性百分比)可以例如通过使用万维网上常用于此目的的免费可得计算机程序(例如，默认设置的blastp或blastn)比较这两个序列来确定。
[0103]
天然氨基酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种来完成。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定基因座引入突变，该序列侧接限制性位点，能够与天然序列的片段连接。连接后，所得重构序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。或者，寡核苷酸-定向的定点诱变程序可被用于提供具有根据取代、缺失或插入所需特定密码子改变的核苷酸序列。
[0104]
任何不参与维持多肽正确构象的半胱氨酸残基也可以被取代，通常用丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到多肽中以提高其稳定性或促进寡聚化。
[0105]
在特定实施方式中，其中如本文所述的抗体、其抗原结合部分或car包含与本文提供的chi3l1和pd-1cdr的序列不相同的至少一个cdr，该至少一个cdr的氨基酸序列可以通过本领域技术人员熟知的方法选择。例如，fujii，2004，“通过随机诱变的抗体亲和力成熟
(antibody affinity maturation by random mutagenesis)”于《分子生物学方法：抗体工程》(methods in molecular biology：antibody engineering)248：345-349(通过引用全文纳入本文)，特别是在图2和3.3部分中，描述了产生任何感兴趣的cdr的文库的方法。这允许本领域普通技术人员鉴定替代性cdr，包括本文所述的特定cdr序列的保守取代变体，当其存在于本文所述的抗体或其抗原结合部分时，将产生将结合癌细胞表面抗原的抗原或其抗原-结合部分。fujii等人描述的方法还允许本领域普通技术人员筛选轻链序列，当与已知的重链片段组合时，该序列将做出所需的结合行为，反之亦然。
[0106]
在一些实施方式中，car包含含有结合chi3l1多肽的一个或多个表位的抗-chi3l1抗体或其抗原结合部分的胞外结构域；跨膜结构域，一个或多个胞内共刺激信号转导结构域，和主要信号转导结构域。示例性抗-chi3l1和抗pd-1抗体及其抗原结合部分，以及示例性表位在本文别处描述。
[0107]
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合多肽(hvbrid polypeptide)，其包含抗原结合域(例如，抗体(例如，scfv)的抗原结合部分)、跨膜结构域和t细胞信号传导和/或t细胞激活结构域。利用单克隆抗体的抗原结合特性，car能够以非mhc限制的方式将t细胞的特异性和反应性重定向到选定的靶标。非mhc限制性抗原识别使表达car的t细胞能够不依赖于抗原加工识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在t细胞中表达时，car有利地不与内源性t细胞受体(tcr)α和β链二聚化。最常见的是，car的胞外结合域包含单链可变片段(scfv)，该片段衍生自融合鼠或人源化单克隆抗体的可变重链和轻链区域。或者，可以使用衍生自fab(而不是来自抗体，例如从fab文库获得)的scfv，在各种实施方式中，该scfv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号转导结构域。“第一代”car包含在抗原结合时仅提供cd3ζ(cd3zeta)信号的car，“第二代”car包括提供共刺激(例如cd28或cd 137)和激活(cd3ζ)的car。“第三代”car包括提供多个共刺激(例如cd28和cd 137)结构域和激活结构域(例如cd3ζ)的car。在多种实施方式中，选择对抗原具有高亲和力或亲合力的car。car的进一步讨论可参见，例如在maus等(2014)；reardon等(2014)；hoyos等(2012)；byrd等(2014)；maher和wilkie(2009)；和tamada等(2012)，其各自通过引用全文纳入本文。
[0108]
在任何方面的一些实施方式中，car包含胞外结合域，其包含人源化的chi3l1-特异性或人源化的pd-1特异性结合域；跨膜结构域；一个或多个胞内共刺激信号转导结构域；和主要信号转导结构域。如本文所用，术语“结合域”、“胞外域”、“胞外结合域”、“抗原特异性结合域”和“胞外抗原特异性结合域”可互换使用并提供能够特异性结合至感兴趣的靶抗原(例如chi3l1和pd-1)的car。结合域可以源白天然、合成、半合成或重组来源。
[0109]
在一些实施方式中，本文考虑的car可包含不同结构域之间的接头残基，例如，添加用于分子的适当间距和构象。在特定实施方式中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是连接vh和vl结构域并提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔子功能的氨基酸序列，从而使所得多肽保留对同一靶分子的特异性结合亲和力，作为包含相同轻链和重链可变区的抗体。本文考虑的car可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸，或任何其间的氨基酸长度。在一些实施方式中，接头为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸长。
[0110]
在特定实施方式中，car的结合域后接一个或多个“间隔子结构域”，其指将抗原结合域移离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方式中，间隔子结构域是免疫球蛋白的部分，其包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔子结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0111]
car的结合域通常后接一个或多个“铰链结构域”，其作用于将抗原结合域定位于远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活。car通常在结合域和跨膜域(tm)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文所述的car的示例性铰链结构域包括源自1型膜蛋白如cd8α、cd4、cd28和cd7的细胞外区域的铰链区，它们可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一个实施方式中，铰链结构域包含cd8α铰链区。
[0112]“跨膜结构域”是car的一部分，它融合了胞外结合部分和胞内信号转导结构域，并将car锚定在免疫效应细胞的质膜上。tm结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。tm结构域可衍生自(即，包含至少其中一个或多个的跨膜区)t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd1。
[0113]
在一些实施方式中，本文考虑的car包含胞内信号转导结构域。“胞内信号转导结构域”是指car的部分，其参与将有效car结合至靶抗原的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包括将细胞毒性因子释放到car结合的靶细胞，或由抗原结合至胞外car结构域引起的其他细胞反应。在一些实施方式中，本文考虑的car包含胞内信号转导结构域，其包含一个或多个“共刺激信号转导结构域”和“主要信号转导结构域”。
[0114]
主要信号转导结构域以刺激方式或抑制方式调控tcr复合物的主要活化。以刺激方式作用的主要信号转导结构域可能包含信号转导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。包含在本发明中具体使用的主要信号转导结构域的itam的示例性实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3g、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。
[0115]
如本文所用，术语“共刺激信号转导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的胞内信号转导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体之外的细胞表面分子，它们在结合至抗原后提供t淋巴细胞高效激活和发挥功能所需的第二个信号。这种共刺激分子的示例性实例包括card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、dap10、lat、nkd2c slp76、trim和zap70。在一个实施方式中，car包含一个或多个选自cd28、cd137和cd134和cd3ζ主要信号转导结构域的共刺激信号转导结构域。
[0116]
在一些实施方式中，提供了抗体-药物偶联物。在特定实施方式中，抗体-药物偶联物包含本文所述的抗体、抗体试剂或其抗原结合部分。药物可以是，例如，如本文别处所述的化疗分子。在一些实施方式中，抗体-药物偶联物包含直接偶联和/或结合至抗体或其抗原结合部分的化疗剂。在一些实施方式中，结合可以是非共价的，例如通过氢键、静电或范
德华相互作用；然而，结合也可以是共价的。“偶联”是指至少两个分子的共价连接。在一些实施方式中，组合物可以是抗体-药物偶联物。
[0117]
在一些实施方式中，抗体、抗体试剂、或其抗原结合部分可以结合至和/或偶联至多个化疗分子。在一些实施方式中，抗体-药物偶联物可以被结合至和/或偶联至多个化疗分子。在一些实施方式中，给定的化疗分子比抗体或其抗原结合部分的比率可以是约1∶1至约1,000∶1，例如单个抗体试剂分子可以被连接至、偶联至等，约1至约1,000个单独的化疗分子。
[0118]
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分和化疗剂可以存在于支架材料中。适用于治疗组合物的支架材料是本领域已知的并且可以包括但不限于：纳米颗粒；基质；水凝胶；和生物材料、生物相容性和/或可生物降解的支架材料。如本文所用，术语“纳米颗粒”是指近似于约10-9
米或十亿分之一到几十亿分之一米的颗粒。术语“纳米颗粒”包括纳米球；纳米棒；纳米壳；和纳米棱镜；这些纳米颗粒可以是纳米网络的一部分。
[0119]
术语“纳米颗粒”还涵盖了具有纳米颗粒大小的脂质体和脂质颗粒。如本文所用，术语“基质”是指包含本文所述组合物的组分(例如，抗体或其抗原结合部分)的3维结构。基质结构的非限制性实例包括泡沫；水凝胶；电纺纤维；凝胶；纤维垫；海绵；3维支架；非织造垫；织造材料；编织材料；纤维束；以及纤维和其他材料形式。参见，例如，rockwood等(2011)和美国专利公开号2011/0167602；2011/0009960；2012/0296352；和美国专利号8,172,901；其各自通过引用全文纳入本文。本领域技术人员可以根据组合物的预期应用来选择基质的结构，例如，电纺基质可以具有比泡沫更大的表面积。
[0120]
在一些实施方式中，支架是水凝胶。如本文所用，术语“水凝胶”是指不溶于水但能够吸收和保留大量水以形成稳定的、通常柔软且柔韧的结构的三维聚合物结构。在一些实施方式中，水可渗入聚合物网络的聚合物链之间，随后引起溶胀和水凝胶的形成。通常，水凝胶是高吸水性的。水凝胶具有许多生物医学应用所需的特性。例如，它们可以被制成无毒且与组织相容的，并且它们对水、离子和小分子具有高度渗透性。水凝胶是高吸水性的(它们可以含有超过99％的水)并且可以由天然(例如丝)或合成聚合物(例如peg)构成。
[0121]
如本文所用，“生物材料”是指生物相容性的和可生物降解的材料。本文所用术语“生物相容性的”指对细胞无毒性的物质。在一些实施方式中，如果物质在体外添加到细胞中导致小于或等于约20％的细胞死亡，则该物质被认为是“生物相容性的”。在一些实施方式中，如果物质在体内添加到细胞中不会在体内诱发炎症和/或其他不良反应，则该物质被认为是“生物相容性的”。如本文所用，术语“可生物降解的”指在生理条件下降解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质是由细胞机制分解的物质。在一些实施方式中，可生物降解的物质是由化学过程分解的物质。
[0122]
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”是指聚合分子，包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元。核酸可以是单链的或双链的。单链核酸可以是变性的双链dna的一条核酸链。在一些实施方式中，核酸可以是cdna，例如缺乏内含子的核酸。
[0123]
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于：通过寡核苷酸-介导的(或定点的)诱变、pcr诱变和盒式诱变制备抗体的早期制备变体或非变体版本。编码本文所述的至少一个抗体、部分或多肽的核酸序列可以根据常规技术与载体dna重组，所述技术包括钝端或交错端末端用于连接，限制性酶消化以
提供适当的末端，酌情填入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的接合，以及用适当的连接酶连接。这种操作的技术可用于构建编码单克隆抗体分子、抗体试剂、其抗原结合区或car的核酸序列。
[0124]
如果核酸分子(如dna)包含含有转录和翻译调控信息的核苷酸序列，并且这种序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则核酸分子被称之为“能够表达”多肽。可操作的连接是指调节性dna序列和寻求表达的dna序列被以这样的方式连接，该连接允许基因以可回收的量表达为肽或抗体部分。基因表达所需的调控区域的确切性质可能因生物体而异，这在类似的领域中是众所周知的。
[0125]
在一些实施方式中，编码如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸被包括于载体中。在本文所述的一些方面中，编码如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸序列可操作地连接至载体。本文所用术语“载体”指的是设计为向宿主细胞递送或在不同宿主细胞间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒性的或非病毒性的。术语“载体”涵盖了当与恰当的控制元件缔合时能够复制并能将基因序列转移到细胞的任何遗传元件。载体可以包括但不限于：克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。
[0126]
如本文所用，术语“表达载体”是指指导rna或多肽从与载体上连接至转录调控序列的序列中表达的载体。所表达的序列往往(但不一定)是与细胞异源性的。表达载体可以包含其他元件，例如，表达载体可以具有个复制系统，从而使其可以在两个生物体中维持，例如在人细胞中用于表达的和在原核宿主中用于克隆和扩增的。术语“表达”是指涉及生产rna和蛋白质和视情况而定分泌蛋白质的细胞过程，包括(如适用)但不限于，例如，转录、转录本加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过翻译从基因转录的mrna得到的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接至适当的调节序列时，在体外或体内被转录(dna)为rna的核酸序列。基因可以包括也可以不包括编码区之前和之后的区域，如5’非翻译(5’utr)或“前导”序列和3’utr或“尾区”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0127]
如本文所用，术语“病毒载体”指的是包括至少一个病毒来源的元件并有能力被包装成病毒载体颗粒的核酸载体构建体。病毒载体可以包含编码本文所述的抗体、其抗原结合部分或car的核酸，以替代非必要的病毒基因。该载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移到细胞中。许多形式的病毒载体在本领域是已知的。
[0128]
所谓“重组载体”是指包含能够在体内表达的异源性核酸序列(或称“转基因”)的载体。应理解，本文所述载体，在一些实施方式中，与其他合适的组合物和治疗方法组合。在一些实施方式中，所述载体是游离型的(episomal)。使用合适的游离型载体提供了将对象体内的感兴趣的核苷酸维持在高拷贝数的染色体外dna中的方式，从而消除了染色体整合的潜在影响。
[0129]
在任何实施方式的一个方面，本文所述的是包含如本文所述抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的细胞，或编码这种抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸。
[0130]
如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的表达可以发生在原核或真核细胞中。合适的宿主包括细菌或真核宿主，包括酵母、昆虫、真菌、鸟类和哺乳动物体内或原位细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟类或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人、
灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但可以使用任何其他哺乳动物细胞。此外，例如，通过使用例如酵母泛素水解酶系统，可以完成泛素跨膜多肽融合蛋白的体内合成。如此产生的融合蛋白可在体内加工或在体外纯化和加工，从而允许合成如本文所述的具有特定氨基末端序列的抗体或其部分。此外，可以避免与直接在酵母(或细菌)表达中保留的起始密码子衍生的甲硫氨酸残基相关的问题。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以利用一系列酵母基因表达系统中的任何一种，结合来自编码用于糖酵解酶的大量产生的活跃表达基因的启动子和终止元件，以获得重组抗体或其抗原结合部分，如本文所述。已知的糖酵解基因也可以提供非常高效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止子信号。
[0131]
可以实现在昆虫中产生本文所述的抗体或其抗原结合部分。例如，通过本领域普通技术人员已知的方法，用工程化为表达跨膜多肽的杆状病毒感染昆虫宿主。
[0132]
在一些实施方式中，将引入的核苷酸序列纳入能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体。多种载体中的任一种均可用于此目的，并且是本领域技术人员或普通技术人员已知和可获得的。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：含有载体的受体细胞可以被识别并从那些不含载体的受体细胞中选出的容易程度；特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否需要能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
[0133]
本领域已知的示例性原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的质粒。可用于表达编码抗体、其抗原结合部分或car的cdna的其他基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如sv40早期启动子、劳斯肉瘤病毒ltr和莫洛尼鼠白血病病毒；(b)剪接区和聚腺苷酸化位点，例如源自sv40晚期区的那些，以及(c)聚腺苷酸化位点，例如sv40。免疫球蛋白cdna基因可以表达，例如，使用表达元件，sv40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白h链启动子增强子、sv40晚期区mrna剪接、兔s-珠蛋白间插序列、免疫球蛋白和兔s-珠蛋白聚腺苷酸化位点和sv40聚腺苷酸化元件。
[0134]
对于包含部分cdna、部分基因组dna的免疫球蛋白基因，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白，mrna剪接和聚腺苷酸化区可以是天然染色体免疫球蛋白序列。
[0135]
在一些实施方式中，为了在啮齿动物细胞中表达cdna基因，转录启动子是病毒ltr序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒ltr增强子之一或两者，剪接区包含大于31bp的内含子，且聚腺苷酸化和转录终止区是来自与正在合成的免疫球蛋白链相对应的天然染色体序列。在其他实施方式中，编码其他蛋白质的cdna序列与上述表达元件组合以实现蛋白质在哺乳动物细胞中的表达。
[0136]
基因被组装进或插入到表达载体中。然后能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞用抗体、其抗原结合部分或car、或嵌合h或嵌合l链的编码基因单独转染，或用嵌合h和嵌合l链基因共转染。转染的受体细胞在允许掺入基因表达的条件下培养，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整抗体或片段。
[0137]
在一些实施方式中，将编码抗体、其抗原结合部分、car或嵌合h链和l链或其部分的基因组装在单独的表达载体中，然后用于共转染受体细胞。每个载体可包含两个可选择基因，第一可选择基因设计用于在细菌系统中选择，而第二可选择基因设计用于在真核系统中选择，其中每个载体具有不同的基因对。该策略产生的载体首先指导细菌系统中基因
的产生并允许扩增。在细菌宿主中如此产生和扩增的基因随后用于共转染真核细胞，并允许选择携带所需转染基因的共转染细胞。用于细菌系统的可选择基因的非限制性实例是赋予氨苄青霉素抗性的基因和赋予氯霉素抗性的基因。用于真核转染子的可选择基因包括黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(名为gpt)和来自tn5的磷酸转移酶基因(名为neo)。替代性地，基因可以被组装在相同的表达载体上。
[0138]
用于转染表达载体和生产本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的受体细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并具有免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施方式中，受体细胞是重组的产生ig的骨髓瘤细胞sp2/0(atcc#crl 8287)。sp2/0细胞仅产生由转染的基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹腔中生长，分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。其他合适的受体细胞包括淋巴细胞，例如人或非人来源的b淋巴细胞、人或非人来源的杂交瘤细胞或种间异源杂交瘤细胞。
[0139]
携带如本文所述的嵌合、人源化或复合人抗体构建体、抗体、其抗原结合部分和/或car的表达载体可通过多种合适方式中的任一种引入合适的宿主细胞，所述方式包括转化、转染、偶联、原生质体融合、磷酸钙沉淀和聚阳离子应用(例如二乙氨乙基(deae)葡聚糖)等生化手段，以及本领域技术人员熟知的电穿孔、直接显微注射和微粒轰击等机械手段。
[0140]
传统上，单克隆抗体在鼠杂交瘤细胞系中已作为天然分子产生。除了该技术以外，本文所述的方法和组合物提供了单克隆抗体的重组dna表达。这允许在选择的宿主物种中生产人源化抗体以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。在细菌、酵母、转基因动物和鸡蛋中生产抗体也是基于杂交瘤的生产系统的替代方案。转基因动物的主要优势是来自可再生资源的潜在高产量。
[0141]
一方面，提供了包含本文所述的分离的抗体、其抗原结合部分或car的细胞。在一些实施方式中，如本文所述的分离的抗体、其抗原结合部分或car在细胞表面上表达。在一些实施方式中，细胞包含编码如本文所述的分离的抗体、其抗原结合部分或car的核酸。
[0142]
在一些实施方式中，细胞是免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫反应中发挥作用的细胞。免疫细胞是造血来源的，包括淋巴细胞，如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方式中，细胞是t细胞；nk细胞；nkt细胞；淋巴细胞，如b细胞和t细胞；和骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0143]
在具体的实施方式中，细胞(例如免疫细胞)被编码car的逆转录载体(例如慢病毒载体)转导。例如，免疫效应细胞被编码car的载体转导，其包含抗-chi3l1/抗-pd-1抗体或其结合至chi3l1和pd-1多肽的抗原结合部分，具有cd3ζ、cd28、4-1bb、ox40的胞内信号转导结构域或其任何组合。因此，这些被转导的细胞可以引发car-介导的细胞毒性反应。
[0144]
逆转录病毒是基因递送的常用工具。在具体的实施方式中，逆转录病毒被用于将编码嵌合抗原受体(car)的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”指的是将其基因组rna转录成线性双链dna拷贝并随后将其基因组dna共价整合进宿主基因组中的rna病毒。一旦病毒被整合进宿主基因组中，它被称作“原病毒(provirus)”。原病毒作为rna聚合酶ii的模板，并引导编码生产新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的rna分子的表达。
[0145]
适用于特定实施方式的示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、friend型鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv))和慢病毒。
[0146]
如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂的逆转录病毒。示例性慢病毒包括但不限于：hiv(人类免疫缺陷病毒；包括hiv 1型和hiv 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus)(vmv)病毒；山羊关节炎脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一个实施方式中，优选基于hiv的载体骨架(即，hiv顺式作用序列元件)。在特定的实施方式中，慢病毒被用于将包含car的多核苷酸递送至细胞。
[0147]
逆转录病毒载体，更具体是慢病毒载体可用于实践本发明的具体实施方式。因此，本文所用术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”意为分别包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。
[0148]
chi3l1抗原结合部分
[0149]
如本文所用，“chi3l1”、“几丁质酶-3样蛋白1”或“ykl-40”指的是至少由巨噬细胞、软骨细胞、中性粒细胞、滑膜细胞和一些癌细胞分泌的约40kda的糖蛋白。chi3l1不具有几丁质酶活性，是促进th2的细胞因子，与akt抗凋亡信号转导通路相关并诱导星形胶质细胞的迁移。chi3l1表达产物的序列对于许多物种是已知的，例如，人chi3l1(ncbi基因编号：1116)mrna(ncbi参考序列：nm_001276.1和ncbi参考序列：nm_001276.2)和多肽(ncbi参考序列：np_001267.1和ncbi参考序列np_001267.2)。
[0150]
在一些实施方式中，本发明的双特异性抗体的chi3l1抗原结合部分包含一个或多个具有seq id no：1-3的氨基酸序列的重链cdr和/或一个或多个具有seq id no：4-6的氨基酸序列的轻链cdr，其公开于美国专利号10,253,111并在下表1中再现。
[0151]
表1 frg抗体的可变互补决定区(cdr)的序列
[0152]
重链cdr
[0153][0154]
轻链cdr
[0155][0156]
在任一方面的一些实施方式中，特异性结合chi3l1多肽的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car特异性结合至选自美国专利号10,253,111中公开的seq id no：
13-24的表位。在任一方面的一些实施方式中，特异性结合chi3l1多肽的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car特异性结合至美国专利号10,253,111中公开的seq id no：13的表位。
[0157]
在一些实施方式中，抗-人chi3l1抗体的骨架包含相对于具有seq id no：36的氨基酸序列的重链序列或具有sed id no：38的氨基酸序列的轻链序列的保守取代，其公开于美国专利号10,253,111，其中序列中的保守取代不被包含在cdr中。在替代性实施方式中，抗-人chi3l1抗体的骨架包含具有seq id no：36的氨基序列的frg抗体的重链序列或具有sed id no：38的氨基酸序列的frg抗体的轻链序列，其公开于美国专利号10,253,111，这两者分别在以下提供为sed id no：13和sed id no：14。
[0158]
表2
[0159]
frg重链序列
[0160][0161]
frg轻链序列
[0162][0163]
在其他替代性实施方式中，本发明的双特异性抗体的chi3l1抗原结合部分包含一个或多个具有seq id no：1-12的氨基酸序列的重链cdr和/或一个或多个具有seq id no：13-20的氨基酸序列的轻链cdr，其公开于表3。参见，例如，国际公开号wo 2019060675。
[0164]
表3
[0165]
重链cdr
[0166]
[0167]
[0168][0169]
轻链cdr
[0170]
[0171][0172]
pd-1抗原结合部分
[0173]
抗-pd-1抗体的实例公开于美国专利号10,344,090(yuan等)；10,323,091(van dijk等)；10,316,089(baruah等)；10,280,224(wang等)；10,239,942(amirina等)；10,221,244(wong等)；10,155,037(abdiche等)；以及于美国公开号2011/0123550(shibayama等)；2016/0376367(yuan等)；2017/0210806(liu)。
[0174]
任何抗-pd-1抗体的抗原结合部分可以被用于本发明的双特异性抗体。在一些实施方式中，表4提供了检测并中和chi3l1和pd1的双特异性抗体，包含pd-1单链可变片段(scfv-pd1)和接头(以粗体、下划线显示)。
[0175]
表4
[0176][0177]
药物组合物
[0178]
在任何实施方式的一个方面，本文所述的是包含如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car，或编码如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸或如本文所述的细胞的组合物。在一些实施方式中，组合物是药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”指的是与被接受用于制药工业的药学上可接受的运载体组合的活性剂。本文使用短语“药学上可接受的”指据合理医学判断为适合与人和动物组织接触使用而不会产生过度毒性、刺激性、变态反应或其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型，符合合理的风险/效益比。
[0179]
包含溶解或分散在其中的活性成分的药理学组合物的制备在本领域中是众所周知的并且不需要基于配方进行限制。通常，此类组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可以制备适用于在使用前置于液体中的溶液或悬浮液的固体形式。该制剂也可以被乳化或以脂质体组合物的形式存在。活性成分可以与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合，并且以适合用于本文所述的治疗方法的量。合适的赋形剂包括，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，该组合物可含有少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、ph缓冲剂等，其增强或保持活性成分的有效性。如本文所述的治疗组合物可包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，其由无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。生理上可耐受的运载体是本领域公知的。示例性的液体运载体是除活性成分和水外不包含任何物质的无菌水溶液，或者包含缓冲剂例如生理ph值的磷酸钠、生理盐水或两者都有，例如磷酸盐缓冲盐水。更进一步地，水性运载体可以包含多于一种缓冲盐，以及盐例如氯化钠和氯化钾、葡萄糖、聚乙二醇和其他溶质。除了水之外，液体组合物还可以包含液相。这种其他液相的实例是甘油、植物油(例如棉籽油)和水-油乳液。本发明中使用的有效治疗特定疾病或病症的活性剂的量将取决于疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。
[0180]
在一些实施方式中，包含如本文所述抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car，或编码本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸的组合物可以是冻干物。
[0181]
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及注射器或导管(包括器官特异性导管(例如肾导管、胆导管、心脏导管等))，其包含治疗有效量的本文所述组合物。
[0182]
一方面，本文描述的是抑制或杀死chi3l1+/pd-1+细胞的方法，该方法包括使细胞与本文所述的分离的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car、编码此类多肽的核酸、包含此类多肽或核酸的细胞或包含此类多肽或核酸的组合物接触。抑制chi3l1+/pd-1+细胞可包括抑制细胞的代谢活性、转移和/或增殖。用于测量代谢活性、转移(例如，迁移试验)和增殖的试验是本领域公知的。类似地，用于测量chi3l1+/pd-1+细胞杀伤的试验，例如细胞活力试验是本领域公知的。
[0183]
如本文所用，“chi3l1+/pd-1+”细胞是表达增加的chi3l1+和pd-1+水平的细胞，例如，与相同类型的健康细胞或在相同类型的健康细胞中发现的chi3l1+/pd-1+平均水平相比。
[0184]
在本文描述的任何方面的一些实施方式中，被给予本文所述的组合物的对象可以是被确定具有升高的chi3l1水平或与该对象的水平的先前评估相比增加的chi3l1水平的对象。在任何方面的一些实施方式中，chi3l1的升高水平是循环chi3l1的水平。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，被给予本文所述的组合物的对象可以是被确定具有chi3l1+癌细胞的对象。
[0185]
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，包括给予本文所述的组合物的方法可以进一步包括第一步骤，鉴定具有chi3l1升高水平的对象。在任何方面的一些实施方式中，chi3l1的升高水平是循环chi3l1的水平。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，包括给予本文所述的组合物的方法可以进一步包括第一步骤，鉴定具有chi3l1+的癌细胞的对象。
[0186]
如本文所用，“chi3l1+”细胞是表达增加的chi3l1+水平的细胞，例如，与相同类型的健康细胞相比或在相同类型的健康细胞中发现的chi3l1+平均水平相比。在任何方面的一些实施方式中，增加的chi3l1水平可以是参考水平的至少1.5倍的水平，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍于参考水平。
[0187]
一方面，本文所述的技术涉及包括向对象给予如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car，或编码如本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸的方法。在一些实施方式中，对象需要治疗癌症和/或恶性肿瘤。在一些实施方式中，对象需要治疗：前列腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤和肺癌。在一些实施方式中，该方法是治疗对象的方法。在一些实施方式中，该方法是治疗对象的癌症的方法。
[0188]
一方面，本文所述的技术涉及包含向对象给予如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car，或编码如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的核酸的方法。
[0189]
一方面，本文描述了一种治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法包括给予如本文所述的细胞，例如包含如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞。
[0190]
一方面，本文描述的是一种治疗有需要的对象的癌症的方法，所述方法包括给予对象本文所述的核酸或包含所述核酸的免疫细胞，其中使得所述对象的免疫细胞表达由核酸编码的多肽。在一些实施方式中，免疫细胞是t细胞。核酸可以被靶向特定的细胞类型，通过，例如使用细胞类型特异性启动子和/或选择性结合至所需细胞类型的组合物。例如，核酸偶联至适配体可以允许靶向递送。参见，例如，mcnamara，等(2006)。在替代性实施方式中，可以使用药物递送系统例如纳米颗粒、树枝状大分子、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送核酸。带正电的阳离子递送系统促进核酸分子(带负电)的结合，且还增强带负电的细胞膜处的相互作用以允许细胞高效摄取核酸。阳离子脂质、树枝状大分子或聚合物可以被结合至核酸，或被诱导以形成包裹核酸的囊泡或胶束(参见，例如，kim，等(2008))。当全身给药时，囊泡或胶束的形成进一步防止了核酸的降解。制备和给予阳离子-抑制性核酸复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内。可用于全身递送核酸的药物递送系统的一些非限制性实例包括dotap阳离子脂质体(oligofectamine)、“固体核酸脂质颗粒”、心磷脂、聚乙烯亚胺、arg-gly-asp(rgd)肽和聚酰胺-胺。在一些实施方式中，核酸与环糊精形成复合物用于全身给药。核酸和环糊精的给药方法和药物组合物可以在美国专利号7,427,605中找到，其通过引用整体纳入本文。核酸的靶向递送描述于，例如，ikeda和taira(2006)；soutschek等(2004)；和lorenze等(2004)；其各自通过引用全文纳入本文。举例来说，可以通过将抑制剂封装在脂质体中将核酸靶向到免疫细胞，所述脂质体含有在免疫细胞上表达的受体的配体，例如tcr。在一些实施方式中，脂质体可包含对免疫细胞特异的适配体。
[0191]
在一些实施方式中，本文所述的方法涉及car-t细胞治疗。car-t细胞和相关疗法涉及表达car的免疫细胞(例如t细胞)的过继细胞转移，该car特异性结合至靶向的细胞类型(例如，癌细胞)以治疗对象。在一些实施方式中，作为治疗的一部分给予的细胞可以是对象自体的。在一些实施方式中，作为治疗的一部分给予的细胞可以不是对象自体的。在一些实施方式中，细胞被工程化改造和/或遗传修饰以表达car。car-t疗法的进一步讨论可以在例如maus等(2014)；reardon等neuro-oncology 2014 16：1441-1458；hoyos等(2012)；byrd等(2014)；maher和wilkie(2009)；以及tamada等clin cancer res 2012 18：6436-6445中找到；其各自通过引用全文纳入本文。
[0192]
通常可以说，包含本文所述的细胞(例如t细胞或免疫细胞)的药物组合物可以102至10
10
个细胞/千克体重，优选105至106个细胞/千克体重的剂量给予，包括这些范围内的所有整数值。细胞的数量将取决于该组合物预期的最终用途，其中包含的细胞类型也是如此。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更少，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml并且通常大于107个细胞/ml，通常为108个细胞/ml或更大。可以将免疫细胞的临床相关数量分配成累积等于或超过105、106、107、108、109、10
10
、10
11
或10
12
个细胞的多次输注。在本发明的一些方面，特别是因为所有输注的细胞将被重新定向到特定的靶抗原，可以给予范围为106/千克(每名患者10
6-10
11
)的较低数量的细胞。表达car的细胞组合物可以以这些范围之内的剂量被多次给予。对于经受治疗的患者，该细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如果需要，治疗还可包括给予有丝分裂原(mitogen)(例如，pha)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α、il-18和tnf-β、gm-csf、il-4、il-13、flt3-l、rantes、mip1α
等)如本文所述以增强免疫反应的诱导。在一些实施方式中，剂量可以是每千克体重约1x105个细胞至约1x108个细胞。在一些实施方式中，剂量可以是每千克体重约1x106个细胞至约1x107个细胞。在一些实施方式中，剂量可以是每千克体重约1x106个细胞。在一些实施方式中，可以给予一剂细胞。在一些实施方式中，细胞剂量可以重复，例如一次、两次或多次。在一些实施方式中，该剂量的细胞可以，例如每天、每周或每月给予。
[0193]
药剂的剂量范围取决于效力，包括足以产生所需效果的量，例如减缓肿瘤生长或减小肿瘤大小。剂量不应大到引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随着患者的年龄、状况和性别而变化并且可由本领域技术人员确定。在任何并发症发生的情况下，剂量也可以由个别医师调整。在一些实施方式中，剂量范围为0.001mg/千克体重至0.5mg/千克体重。在一些实施方式中，剂量范围为5μg/k千克体重至100μg/千克体重。或者，可以滴定剂量范围以将血清水平维持在1μg/ml和1000μg/ml之间。对于全身给药，可以向对象给予治疗量，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。
[0194]
可以重复上述列举的剂量的给药。在一些实施方式中，该剂量一天给予一次或一天多次，例如但不限于一天三次。在一些实施方式中，上述列举的剂量每天给药持续数周或数月。治疗的持续时间取决于对象的临床进展和对治疗的反应。
[0195]
在一些实施方式中，剂量可为约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约2mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约4mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约5mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约6mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约8mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约10mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约100mg/m2至约700mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约250mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约375mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约400mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约500mg/m2。
[0196]
在一些实施方式中，该剂量可以静脉内给予。在一些实施方式中，静脉内给予可以是在约10分钟至约3小时的时间段内发生的输注。在一些实施方式中，静脉内给予可以是在约30分钟至约90分钟的时间段内发生的输注。
[0197]
在一些实施方式中，剂量可以大约每周给予。在一些实施方式中，剂量可以每周给予。在一些实施方式中，剂量可以每周给予，持续约12周至约18周。在一些实施方式中，剂量可以约每两周给予。在一些实施方式中，剂量可以约每三周给予。在一些实施方式中，剂量可为约每两周给予约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约每三周给予约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约每两周静脉内给予约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约每三周静脉内给予约2mg/kg至约15mg/kg。在一些实施方式中，剂量可为约每周静脉内给予约200mg/m2至约400mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约每两周静脉内给予约200mg/m2至约400mg/m2。在一些实施方式中，剂量可为约每三周静脉内给予约200mg/m2至约400mg/m2。在一些实施方式中，给予总计约2至10个剂量。在一些实施方式中，给予总计四个剂量。在一些实施方式中，给予总计五个剂量。在一些实施方式中，给予总计六个剂量。在一些实施方式中，给予总计七个剂量。在一些实施方式中，给予总计八个剂量。在一些实施方式中，给予总计进行约四周至约12周。在一些实施方式中，给予总计进行约六周。在一些实施方式中，给予总计进行约八周。在一些实施方式中，给予总
计进行约12周。在一些实施方式中，初始剂量可以比后续剂量高约1.5至约2.5倍。
[0198]
在一些实施方式中，剂量可为约1mg至约2,000mg。在一些实施方式中，剂量可为约3mg。在一些实施方式中，剂量可为约10mg。在一些实施方式中，剂量可为约30mg。在一些实施方式中，剂量可为约1,000mg。在一些实施方式中，剂量可为约2,000mg。在一些实施方式中，剂量可为每天通过静脉输注给予约3mg。在一些实施方式中，剂量可为每天通过静脉输注给予约10mg。在一些实施方式中，剂量可为每周三次通过静脉输注给予约30mg。
[0199]
治疗有效量是足以在肿瘤大小、肿瘤生长等方面产生统计学显著的、可测量的变化的药剂的量(功效测量在下文中描述)。这种有效量可以在临床试验和动物研究中测量。
[0200]
药剂可以通过注射静脉内给予或随时间逐渐输注静脉内给予。给定的用于给定途径的适当制剂，例如，可用于本文所述的方法和组合物中的药剂可以静脉内、鼻内、通过吸入、腹膜内、肌内、皮下、腔内给予，并且如果需要，可以通过蠕动(泵)(peristaltic)的方式递送，或通过本领域技术人员已知的其他方式。优选将本文使用的化合物口服、静脉内或肌内给予癌症患者。还特别考虑了直接对肿瘤块局部给药。
[0201]
例如，包含至少一种药剂的治疗组合物可以传统地以单位剂量给药。当用于治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于对象的单位剂型的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性物质，与所需的生理学上可接受的稀释剂(即运载体或载剂)联合，经计算可产生所需治疗效果。
[0202]
组合物以与剂量制剂相容的方式以治疗有效量给予。给药量和时间取决于将要治疗的对象、对象的身体利用活性成分的能力和所需的治疗效果的程度。
[0203]
需要给予的活性成分的精确量取决于从业者的判断，且因个体而异。但是，本文公开了用于全身施用的合适的剂量范围，并且取决于给药途径。合适的给药方案也是可变的，但以初始给药为代表，然后通过随后的注射或其他给药，以一个或多个小时的间隔重复给药。或者，考虑持续静脉内输注足以将血液中的浓度维持在指定用于体内治疗的范围内。
[0204]
在一些实施方式中，所述方法进一步包括将本文所述的药物组合物与一种或多种另外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗一起给药，作为组合疗法的一部分。在一些此类实施方式中，化疗剂生物制品、药物或治疗选自：放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子。
[0205]
在本文所述方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括向正在给予本文所述药物组合物的对象给予一种或多种化疗剂。化疗剂的非限制性实例可包括：烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(memredopa)、乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三吖啶基氧化磷(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenins)(尤其是泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利抑制素(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；杜卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；一种匐枝珊瑚醇(sarcodictyin)；
海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(ca1icheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωi1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；双磷酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团(chromoprotein enediyne antibiotic chromophore)，阿克拉霉素(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(mitomycin)例如丝裂霉素c、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物例如氨甲喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil(5-fu))；叶酸类似物例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯酮(testolactone)；抗肾上腺例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物例如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷
[0206]
(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布什(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明
(lonidainine)；美坦辛类似物(maytansinoid)例如美坦辛(maytansine)和柄型菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllini cacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(jhs天然产物(jhs natural products)，俄勒冈，尤金)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2
”‑
三氯三乙胺(2，2’，2
”‑
trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是t-2毒素、疣疱菌素a(verrucarina)、杆孢菌素a(roridina)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethane)；长春地辛(vindesine)；达喀尔巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(百时美施贵宝肿瘤公司(bristol-myers squibb oncology)，新泽西州普林斯顿)、不含氢化蓖麻油(cremophor)的白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(美国制药伙伴公司(american pharmaceutical partners)，伊利诺伊州康堡)和多西紫杉醇(罗纳普朗克制药公司(rhone-poulenc rorer)，法国安东尼)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(开普拓(camptosar)，cpt-11)(包括伊立替康和5-fu以及甲酰四氢叶酸(1eucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄酸例如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；卡培他滨；甲酰四氢叶酸(lv)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(folfox)；拉帕替尼减少细胞增殖的pkc-α、raf、h ras、egfr(例如，厄洛替尼)和vegf-a的抑制剂，以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0207]
本文所用术语“细胞毒性剂”指的是抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
、p
32
和lu的放射性同位素)、化疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或小分子毒素，包括其片段和/或变体。
[0208]
如本文所用，术语“化学疗法”或“化疗剂”是指在以异常细胞生长为特征的疾病的治疗中具有治疗用途的任何化学试剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物和癌症以及以增生性生长为特征的疾病。本文所用的化疗剂包括化学剂和生物剂。这些药剂的功能是抑制癌细胞持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化剂/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素
类似物以及各种抗肿瘤药物。大多数(如果不是全部)这些药物都对癌细胞有直接毒性，并且不需要免疫刺激。在一个实施方式中，化疗剂是用于治疗肿瘤例如实体瘤的药剂。在一个实施方式中，化疗剂是放射性分子。本领域技术人员可以容易地确定使用的化疗剂(例如，《哈里森内科学原理》(h
arrison’s p
rinciples of i
nternal m
edicine
)，第14版(2001)中的第86章；《a
beloff
临床肿瘤学》(a
beloff’s c
linical o
ncology
)，第2版(2000)的第17章。本文所述的双特异性和多特异性多肽试剂可以与其他化疗剂偶联使用。
[0209]
所谓“放射疗法”是指使用定向伽马射线或β射线对细胞造成足够的损伤，从而限制其正常发挥功能或完全破坏细胞的能力。应理解，本领域将有许多已知的方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗是一次性给药，典型的剂量范围为每天10到200单位(戈瑞)。
[0210]
在一些实施方式中，本文所述的方法可进一步包括向对象给予额外的免疫疗法。如本文所用，“免疫疗法”是指设计用于诱导患者自身免疫系统对抗肿瘤的多种治疗策略，并且包括但不限于：针对浅表性膀胱癌的膀胱内bcg免疫疗法、产生特异性免疫反应的疫苗(例如对于恶性黑色素瘤和肾细胞癌)，使用西普鲁塞-t(sipuleucel-t)治疗前列腺癌，其中来自患者的树突状细胞装载有前列腺酸性磷酸酶肽以诱导针对前列腺衍生细胞的特异性免疫反应，给予细胞因子、刺激一种或多种免疫细胞类型的生长因子和/或信号转导分子(例如，白介素)，在重新引入患者之前对肿瘤抗原特异性的淋巴细胞和/或树突细胞的离体扩增和/或刺激，咪喹莫特，过继细胞转移和/或描述于例如国际公开wo 2003/063792和美国专利号8,329,660中的方法。在一些实施方式中，免疫疗法刺激nk反应。在其他实施方式中，免疫疗法是过继细胞转移方法，即过继免疫疗法。
[0211]
在一些实施方式中，本文所述的方法可进一步包括向对象给予额外的抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或包含car的t细胞。在一些实施方式中，本文所述的方法可进一步包括向对象给予细胞因子。基于抗体和细胞因子的疗法是本领域已知的并且可以包括以下作为非限制性实例：阿仑单抗；贝伐单抗；本妥昔单抗(brentuximab vedotin)；西妥昔单抗；吉妥珠单抗；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)；伊匹单抗；奥法木单抗；帕尼单抗；利妥昔单抗；托西莫单抗；曲妥珠单抗；白细胞介素-2和干扰素-α。
[0212]
给定治疗用于(例如癌症)的功效可由具有技术水平的临床医生确定。但是，如果例如肿瘤的任何一种或所有迹象或症状以有益的方式改变，或其他临床上可接受的症状得到改善或甚至减轻，例如，在用本文所述的药剂治疗后至少减轻了10％，则治疗被认为是“有效治疗”，如本文所使用的术语。功效也可以通过个体未能恶化来测量，通过住院或医疗干预的需要评估(即疾病的进展停止)。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述的。
[0213]
用于治疗疾病的有效量是指当给予有需要的哺乳动物时足以导致如本文所定义的术语对该疾病有效治疗的量。可以通过评估例如癌症(例如肿瘤大小、肿瘤质量、肿瘤密度、血管生成、肿瘤生长速率等)的物理指标来确定药剂的功效。
[0214]
对象的chi3l1和pd-1水平
[0215]
一方面，本文描述了一种检测、预后和/或诊断癌症的方法，该方法包括在从对象获取的样品中检测或测量chi3l1和/或pd-1或pd-l1的水平，通过将样品与本文所述的双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合部分接触，其中chi3l1和pd-1或pd-l1水平相对于参考水
平的增加表明对象患有癌症、患癌症的风险增加。
[0216]
最近的报告表明，pd-l1表达作为在癌症患者中用于免疫检查点抑制剂(ici)(如pd-1)的生物标志物的敏感性中等，并且在pd-l1表达水平低或无表达水平的患者中观察到了成功的治疗结果(paz-ares，等，2018；hellmann，等，2019；schoenfeld，等，2020)。因此，在另一方面，一种检测、预后和/或诊断癌症的方法，该方法包括在从对象获取的样品中检测或测量chi3l1的水平，通过将样品与本文所述的双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合部分接触，其中chi3l1水平相对于参考水平的增加表明对象患有癌症、患癌症的风险增加。
[0217]
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，被给予本文所述的组合物的对象可以是被确定具有chi3l1和/或pd-1或pd-l1升高水平的对象。在一些实施方式中，升高的chi3l1和pd-1或pd-l1的水平可以是循环chi3l1和pd-1或pd-l1的水平。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，被给予本文所述的组合物的对象可以是被确定具有chi3l1+/pd-1+癌细胞的对象。
[0218]
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，包括给予本文所述的组合物的方法可以进一步包括第一步骤，鉴定具有chi3l1和/或pd-1或pd-l1升高水平的对象。在一些实施方式中，升高的chi3l1和/或pd-1或pd-l1的水平可以是循环chi3l1和/或pd-1或pd-l1的水平。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，包括给予本文所述的组合物的方法可以进一步包括第一步骤，鉴定具有chi3l1+/pd-1+或chi3l1+/pd-l1+的癌细胞的对象。
[0219]
一方面，本文描述了一种试验，包括将从对象获得的测试样品与本文所述的抗体、抗体试剂或其抗原结合部分接触，并检测指示样品中chi3l1和pd-1存在或水平的信号的存在或强度；其中chi3l1和pd-1水平相对于参考水平的增加表明对象患有癌症或发展为癌症的风险更高。
[0220]
一方面，本文所述的是鉴定需要治疗癌症的对象的方法，该方法包括：将从对象中获得的样品与本文所述的双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合部分接触，检测样品中指示chi3l1和/或pd-1或pd-l1的存在或水平的信号的存在或强度；当chi3l1和/或pd-1或pd-l1的表达水平相对于参考水平增加时，鉴定对象正需要治疗癌症。
[0221]
一方面，本文描述了一种确定对象是否可能对用抗-chi3l1/抗-pd-1的疗法反应的方法，例如抗-chi3l1/抗-pd-1双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合片段，或包含结合chi3l1和pd-1或pd-l1的双特异性car的t细胞，该方法包括：将从对象中获取的测试样品与本文所述的抗体、抗体试剂、其抗原结合片段接触，检测指示样品中chi3l1和pd-1或pd-l1的存在或水平的信号的存在或强度；当chi3l1和pd-1或pd-l1相对于参考水平增加时，确定对象可能对用抗-chi3l1/抗-pd-1治疗的疗法反应；并且当chi3l1和pd-1或pd-l1相对于参考水平不增加时，确定对象不太可能对用抗-chi3l1/抗-pd-1治疗的疗法反应。
[0222]
一方面，本文描述了一种治疗癌症的方法，包括：将从对象获得的测试样品与本文所述的抗体、抗体试剂或其抗原结合部分接触；检测指示样品中chi3l1和pd-1存在或水平的信号的存在或强度；当chi3l1和pd-1水平相对于参考水平的增加时，用抗-chi3l1/抗-pd-1双特异性抗体治疗对象。一方面，本文描述了一种治疗癌症的方法，包括：向确定需要治疗癌症并且进一步确定具有相对于参考水平升高的chi3l1和pd-1水平的对象给予治疗有效量的抗-chi3l1/抗-pd-1双特异性抗体疗法，其中抗-chi3l1/抗pd-1疗法包含抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或包含识别chi3l1和pd-1的双特异性car的t细胞；核酸；细胞；或
如本文所述的组合物。
[0223]
在一些实施方式中，chi3l1的表达水平可以通过确定chi3l1基因的表达产物(例如chi3l1 rna转录本或chi3l1多肽)的水平来测量，并且pd-1的表达水平可以通过确定pd-1基因的表达产物(例如pd-1rna转录本或pd-1多肽)的水平来测量。此类分子可以从生物样品(例如生物流体)中分离、衍生或扩增。在一些实施方式中，当存在chi3l1分子或pd-1分子时，抗体或其抗原结合部分产生可检测信号。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分被可检测地标记或能够产生可检测信号。在一些实施方式中，chi3l1或pd-1的水平使用选自下组的方法测定：蛋白质印迹；免疫沉淀；酶联免疫吸附试验(elisa)；放射免疫试验(ria)；夹心试验；荧光原位杂交(fish)；免疫组织学染色；放射免疫计量试验(radioimmunometric assay)；免疫荧光试验；质谱；facs；和免疫电泳试验。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分被可检测地标记或产生可检测信号。在一些实施方式中，chi3l1或pd-1的表达水平相对于一种或多种参考基因或参考蛋白质的表达水平被标准化。在一些实施方式中，chi3l1或pd-1的参考水平是从对象获得的在先样品中chi3l1或pd-1的表达水平。
[0224]
在一些实施方式中，chi3l1或pd-1的水平可以是chi3l1或pd-1多肽的水平。chi3l1或pd-1多肽的检测可以根据本领域已知的任何方法。根据本技术检测chi3l1或pd-1多肽的免疫学方法包括但不限于抗体技术，例如免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、荧光活化细胞分选(facs)、免疫印迹、放射免疫试验、蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(elisa)和使用本文所述抗体试剂的衍生技术。
[0225]
免疫化学方法需要使用对靶分子(例如，抗原，或在本文所述的实施方式中，chi3l1或pd-1多肽)特异的抗体试剂。在一些实施方式中，本文所述的试验、方法和/或系统可包括：抗-chi3l1或抗-pd-1抗体试剂。在一些实施方式中，抗体试剂可以是被可检测地标记。在一些实施方式中，抗体试剂可以被附接至固体支持物(例如，结合至固体支持物)。在一些实施方式中，固体支持物可包含颗粒(包括但不限于琼脂糖或乳胶珠或颗粒或磁性颗粒)、珠、纳米颗粒、聚合物、基材、载玻片、盖玻片、平板、培养皿、孔、膜和/或光栅。固体支持物可以包括许多不同的材料，包括但不限于聚合物、塑料、树脂、多糖、基于硅或二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃和膜。
[0226]
在一个实施方式中，如本文所述的试验、方法和/或系统可包括elisa。在示例性实施方式中，第一抗体试剂可以被固定在固体支持物(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。固体支持物可以与从对象获得的样品接触，并且抗体试剂将结合(“捕获”)其特异性的抗原(例如，chi3l1或pd-1)。然后可以使固体支持物与第二标记的抗体试剂(例如，检测抗体试剂)接触。检测抗体试剂可以，例如，包含可检测的信号、共价连接至酶、或自身可以通过生物偶联被连接至酶的二抗检测。信号的存在表明固定在支持物上的第一抗体试剂和第二“检测”抗体试剂都结合至抗原，即信号的存在表明chi3l1或pd-1分子的存在。在每个步骤之间，通常用温和的清洁剂溶液清洗板，以去除任何未特异性结合的蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤之后，通过添加酶底物使板显色以产生可见信号，该信号指示样品中chi3l1或pd-1多肽的量。较旧的elisa使用显色底物，但较新的试验使用具有更高灵敏度的荧光底物。还有其他不同形式的elisa，这是本领域技术人员众所周知的。
[0227]
在一个实施方式中，本文所述的试验、系统和方法可以包括横向流动免疫测定测试(lfia)，也称为免疫层析试验，或条样测试，以测量或确定样品中chi3l1或pd-1多肽的水
平。lfia是一种简单的设备，旨在检测样品中chi3l1或pd-1的存在(或不存在)。目前有许多lfia测试用于医疗诊断或用于家庭测试、护理点测试或实验室使用。lfia测试是免疫测定的一种形式，其中测试样品通过毛细管作用沿着固体基质流动。样品被施加到测试条上之后，它遇到与样品混合的有色抗体试剂，并且如果结合到样品的一部分，就会在基材上经过已经用第二抗体试剂预处理的线或区域。根据样品中存在的chi3l1或pd-1的水平，有色抗体试剂可能会结合至测试线或区域。lfia本质上是免疫测定，适用于沿单轴操作以适应测试条格式或试纸格式。条样测试用途广泛，本领域技术人员可以轻松修改，以检测来自流体样品(例如尿液、血液、水样等)的大量抗原。条样测试也称为浸条测试(dip stick test)，名称来自将测试条“浸入”待测流体样品的字面动作。lfia条样测试易于使用，需要最少的培训，并且可以很容易地作为护理点测试(poct)诊断的组成部分在现场使用。lfia测试可以作为竞争性或夹心试验进行操作。夹心lfia类似于夹心elisa。样品首先遇到用对靶标具有特异性的抗体试剂(例如，chi3l1-或pd-1-特异性抗体试剂)标记的有色颗粒。测试线还将包含抗体试剂(例如，chi3l1-或pd-1-特异性抗体试剂)。测试线将在阳性样品中显示为有色条带。在一些实施方式中，横向流动免疫测定可以是双抗体夹心试验、竞争试验、定量试验或其变体。横向流动技术有许多变体。还可以应用多个捕获区域来创建多重测试。
[0228]
典型的测试条由以下部分组成：(1)样品施加区域，包括吸收垫(即基质或材料)，测试样品施加在该吸收垫上；(2)偶联物或试剂垫-它包含一种或多种对靶标特异性的抗体试剂，其可偶联至有色颗粒(通常是胶体金颗粒或乳胶微球)；(3)包含反应膜的测试结果区-通常是抗体试剂固定于其上的疏水性硝化纤维素或醋酸纤维素膜，作为捕获区或测试线(也可能存在对照区，其包含对于偶联至颗粒或微球的抗体试剂特异性的抗体)；和(4)可选的芯吸或废液储器-另一个吸收垫，设计为通过毛细作用将样品吸过反应膜并收集它。条的组件通常固定至惰性背衬材料上，可以以简单的浸条形式或在塑料外壳内提供，带有样品端口和反应窗口，显示捕获区和对照区。虽然不是绝对必要的，但大多数测试都会包含第二行，其包含可以吸收游离的乳胶/金的抗体，以确认测试正确地进行。
[0229]
在许多抗原生物标志物的免疫测定的背景下，“浸条”或lfia测试条和其他固体支持物的使用在本领域中已有描述。美国专利号4,943,522；6,485,982；6,187,598；5,770,460；5,622,871；6,565,808，美国专利申请序列号10/278,676；09/579,673和10/717,082，其通过引用全文纳入本文，是这种横向流动测试装置的非限制性实例。三项美国专利(美国专利号4,444,880，授予h.tom；4,305,924，授予r.n.piasio；和4,135,884，授予j.t.shen)描述了使用“浸条”技术通过免疫化学试验检测可溶性抗原。这三项专利的设备和方法广泛地描述了固定至“浸条”上的固体表面的第一组分，在检测条上的组分-抗原复合物之前，该组分暴露于含有结合至固定在“浸条”上的组分的可溶性抗原的溶液中。根据检测chi3l1或pd-1多肽的需要，修改这些“浸条”技术的教导在本领域技术人员的技能范围内。在一些实施方式中，浸条(或lfia)可适用于尿液样品。在一些实施方式中，浸条可适用于血液样品。
[0230]
免疫化学是一系列基于特定抗体的使用的技术，其中抗体用于特异性靶向细胞内部或表面上的分子。在一些实施方式中，免疫组织化学(“ihc”)和免疫细胞化学(“icc”)技术可用于检测或测量chi3l1或pd-1多肽的水平。ihc是将免疫化学应用于组织切片，而icc是在细胞或组织印记(imprint)经过特定的细胞学制备(例如液基制备)后对其应用免疫化学。在一些情况下，信号放大可以被整合到特定方案中，其中，在应用对血小板或白细胞特
异的抗体试剂之后，用含有标记的二抗。通常，对于免疫组织化学，从对象获得并通过合适的固定剂(例如酒精、丙酮和多聚甲醛)固定的组织被切片并与抗体反应。免疫组织化学的常规方法描述于buchwalow和bocker(编)《免疫组织化学：基本要点和方法》(immunohistochemistry：basics and methods)施普林格出版社(springer)(2010)：lin和prichard《实用免疫组织化学手册》(handbook of practical immunohistochemistry)施普林格出版社(2011)；其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，可以利用免疫细胞化学，其中，通常，从对象获得的组织或细胞由合适的固定剂(例如酒精、丙酮和多聚甲醛)固定，抗体与其反应。人类样品的免疫细胞学染色方法是本领域技术人员已知的并且描述于，例如，《免疫细胞化学：生物医学研究实用指南》(i
mmunocytochemistry
：a p
ractical g
uide for b
iomedical r
esearch
)(2009)；其通过引用全文纳入本文。
[0231]
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种抗体试剂可包含可检测标记和/或包含产生可检测信号的能力(例如，通过催化将化合物转化为可检测产物的反应)。可检测标记可包括例如吸光染料、荧光染料或放射性标记。可检测标记、检测它们的方法和将它们纳入抗体试剂的方法是本领域众所周知的。
[0232]
在一些实施方式中，可检测标记可包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段(例如荧光、化学荧光或化学发光，或任何其他适当手段)检测的标记。本文所述方法中使用的可检测标记可以是一级标记(其中标记包含可直接检测的部分或产生可直接检测部分的部分)或二级标记(其中可检测标记结合另一部分以产生可检测信号，例如，如在使用二抗和三抗的免疫标记中很常见的)。可检测标记可以通过共价或非共价方式连接至抗体试剂。或者，可检测标记可以被连接，例如，通过直接标记经由配体-受体结合对排列实现结合至抗体试剂的分子或其他此类特异性识别分子。可检测标记可包括但不限于放射性同位素、生物发光化合物、生色团、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
[0233]
在其他实施方式中，检测抗体用荧光化合物标记。当荧光标记的抗体暴露在适当波长的光下时，那么可以根据荧光检测到它的存在。在一些实施方式中，可检测标记可以是荧光染料分子或荧光团，包括但不限于荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、cy3
tm
、cy5
tm
、别藻蓝素、德克萨斯红、香槟叶绿素(peridenin chlorophyll)、花菁、串联偶联物，例如藻红蛋白-cy5
tm
、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(fitc)和oregon green
tm
、罗丹明及其衍生物(如德克萨斯红和四罗丹明异硫氰酸酯(tritc))、生物素、藻红蛋白、amca、cydyes
tm
、6-羧甲基荧光素(已知通常缩写为fam和f)、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(hex)、6-羧基-4’，5
’‑
二氯-2’，7
’‑
二甲氧基荧光素(joe或j)、n，n，n’，n
’‑
四甲基-6羧基罗丹明(tamra或t)、6-所及-x-罗丹明(rox或r)、5-羧基罗丹明-6g(r6g5或g5)、6-羧基罗丹明-6g(r6g6或g6)，和罗丹明110；花菁染料，例如cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如，hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，如cy3、cy5等花菁染料；bodipy染料和喹啉染料。
[0234]
在一些实施方式中，可检测标记可以是放射性标记，包括但不限于3h、
125
i、
35
s、
14
c、
32
p和
33
p。
[0235]
在一些实施方式中，可检测标记可以是酶，包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性
磷酸酶。酶标记可以产生例如化学发光信号、颜色信号或荧光信号。预期用于可检测地标记抗体试剂的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
[0236]
在一些实施方式中，可检测标记是化学发光标记，包括但不限于光泽精、鲁米诺、荧光素、异鲁米诺、热静(theromatic)吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0237]
在一些实施方式中，可检测标记可以是光谱比色标记，包括但不限于胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠。
[0238]
在一些实施方式中，抗体也可以用可检测标签标记，例如c-myc、ha、vsv-g、hsv、flag、v5、his或生物素。也可以使用其他检测系统，例如生物素-链霉亲和素系统。在该系统中，与感兴趣的生物标志物具有免疫反应性(即特异性)的抗体被生物素化。使用链霉亲和素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)偶联物和显色底物确定结合至生物标志物的生物素化抗体的量。这种链霉亲和素-过氧化物酶检测试剂盒是可商购的，例如从dako；加利福尼亚州卡平特里亚。
[0239]
抗体试剂也可以使用荧光发射金属如
152
eu或镧系元素的其他金属进行可检测标记。这些金属可以被附接到抗体试剂上，使用例如二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)之类的金属螯合基团。
[0240]
如本文所述的试验和方法可涉及确定对象是否具有相对于参考水平增加的chi3l1和pd-1水平。在一些实施方式中，chi3l1和pd-1的参考水平可以是未患有或未诊断为患有(例如癌症)的健康对象中的chi3l1和pd-1水平。在一些实施方式中，参考水平可以是相似细胞类型、样品类型、样品处理的样品中的水平，和/或从与chi3l1和pd-1的数量有待确定的对象相似年龄、性别和其他人口统计学参数的对象中获得的水平。在一些实施方式中，测试样品和对照参考样品是相同类型的，即，从相同生物来源获得，并且包含相同的组合物，例如相同数量和类型的细胞和/或相同样品材料的类型。因此，在一些实施方式中，增加的chi3l1和pd-1的水平可以随着人口统计因素例如年龄、性别、基因型、环境因素和个体病史的变化而变化。在一些实施方式中，参考水平可包括取自未表现出(例如癌症)的任何迹象或症状的对象的相同类型样品中chi3l1和pd-1(例如，chi3l1和pd-1多肽)的水平。在一些实施方式中，chi3l1和pd-1的参考水平可以是从对象获得的在先样品中chi3l1和pd-1的表达水平。这允许直接分析该个体的任何水平变化。
[0241]
在一些实施方式中，如果chi3l1和pd-1的水平是参考水平的至少1.25倍(例如至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍，至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍或更高，则chi3l1和pd-1的水平可以是相对于参考水平增加的。在一些实施方式中，chi3l1和pd-1的表达水平可以相对于一种或多种参考基因或参考蛋白质的表达水平被标准化。在一些实施方式中，chi3l1和pd-1的表达水平可以相对于参考值被标准化。
[0242]
在一些实施方式中，确定不超过20个其他基因的表达水平。在一些实施方式中，确定不超过10个其他基因的表达水平。
[0243]
如本文所用，术语“样品”或“测试样品”表示从生物体采集或分离的样品，例如来自对象的尿样。示例性的生物样品包括但不限于：生物流体样品；血清；血浆；尿；唾液；和/
或肿瘤样品等。该术语还包括上述样品的混合物。术语“测试样品”还包括未处理或预处理(或预加工)的生物样品。在一些实施方式中，测试样品可包含来自对象的细胞。如本文所用，术语“生物流体”是指从生物来源获得的任何流体，包括但不限于血液、尿液和身体分泌物。
[0244]
测试样品可以通过从对象取出样品获得，但也可以通过使用先前分离的样品(例如，在先前时间点分离并由同一人或另一人分离)来完成。此外，测试样品可以是新鲜采集的或先前采集的样品。
[0245]
在一些实施方式中，测试样品可以是未处理的测试样品。如本文所用，短语“未处理的测试样品”是指除了稀释和/或悬浮在溶液中之外没有进行任何先前样品预处理的测试样品。用于处理测试样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声处理、均质化、加热、冷冻和解冻及其组合。在一些实施方式中，测试样品可以是冷冻的测试样品，例如冷冻组织。在采用本文所述的方法、试验和系统之前，可以将冷冻样品解冻。解冻后，冷冻样品可在经手本文所述的方法、试验和系统之前被离心。在一些实施方式中，测试样品是澄清的测试样品，例如，通过离心和收集包含澄清的测试样品的上清制备。在一些实施方式中，测试样品可以是预加工的测试样品，例如，由选自由离心、过滤、解冻、纯化及其任何组合的处理产生的上清或滤液。在一些实施方式中，测试样品可以用化学和/或生物试剂处理。在加工过程中，可以使用化学和/或生物试剂来保护和/或维持样品的稳定性，包括其中的生物分子(例如，核酸和蛋白质)。一种示例性试剂是蛋白酶抑制剂，其通常用于在加工过程中保护或维持蛋白质的稳定性。技术人员非常了解适用于如本文所述的测定chi3l1水平所需的生物样品的预加工的方法和过程。
[0246]
在一些实施方式中，本文所述的方法、试验和系统还可包括从对象获得测试样品的步骤。在一些实施方式中，对象可以是人对象。
[0247]
在一些实施方式中，本文所述的方法、试验和系统可包括基于chi3l1和pd-1的水平创建报告。在一些实施方式中，该报告表示测试样品中chi3l1和pd-1的原始值(加上，可选地，参考样品中chi3l1和pd-1的水平)或者，它表明与参考水平相比chi3l1和pd-1水平的百分比或倍数增加，和/或提供对象有或没有患有癌症风险的信号。
[0248]
如本文所用，“有患病风险”是指与不具有升高和/或增加的chi3l1和pd-1水平的对象相比，患有特定病症的可能性至少高2倍，例如，2倍、或2.5倍、或3倍、或4倍，或更大的风险。
[0249]
在一些实施方式中，试验或方法可进一步包括：给予抗-chi3l1或抗-pd-1治疗的步骤。在一些实施方式中，抗-chi3l1/抗-pd-1疗法包含如本文所述的分离的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car或car t细胞；核酸；细胞；或组合物。
[0250]
在任一实施方式的一个方面，本文描述的是偶联至可检测标记的如本文所述的抗体、抗体试剂或其抗原结合部分。
[0251]
在任一实施方式的一个方面，本文描述的是包含如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合片段的固体支持物。在任何方面的一些实施方式中，双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合片段被可检测地标记。在任何方面的一些实施方式中，固体支持物包括颗粒、珠子、聚合物或基材。
[0252]
任何实施方式的一个方面，本文描述的是分子复合物，其包含结合至chi3l1多肽
和pd1多肽的至少一种如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合片段或car。
[0253]
一方面，本文描述的是包含如本文所述的组合物的试剂盒，例如包含如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂、其抗原结合部分或car的组合物。试剂盒是包含至少一种试剂(例如双特异性抗体)的任何制品(例如，包装或容器)，该制品作为用于执行本文所述方法的单元被推广、分发或销售。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的双特异性抗体、抗体试剂或其抗原结合片段被固定在固体支持物上。在任何方面的一些实施方式中，固体支持物包括颗粒、珠子、聚合物或基材。在任何方面的一些实施方式中，抗体、抗体试剂或其抗原结合片段被可检测地标记。
[0254]
本文所述的试剂盒可以可选地包含用于执行本文所述方法的附加组分。举例来说，该试剂盒可包含适合于含有本文所述的双特异性抗体、其抗原结合部分或car的组合物的流体(例如，缓冲液)，描述如本文所述的方法的实施的说明材料等等。试剂盒还可包含用于递送如本文所述的组合物的装置和/或试剂。此外，该试剂盒可以包括说明书和/或可以提供关于所获得结果的相关性的信息。
[0255]
本文公开的实施方式的描述无意于穷举或将本公开的范围限制为所公开的的确切形式。虽然本文出于说明的目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内各种等效修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但替代性实施方式可以以不同的顺序执行功能，或者可以基本同时地执行功能。在此提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。可以组合本文所述各种实施方式以提供进一步的实施方式。如果需要，可以修改本公开的方面以采用以上参考文献和应用的组成、功能和概念来提供本公开的更进一步的实施方式。此外，出于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。根据上述详细说明可对本公开进行这些和其它改变。所有这些修改均旨在包括在所附权利要求的范围之内。
[0256]
任何前述实施方式的特定元件可以被组合或取代为其他实施方式中的元件。此外，虽然已经在这些实施方式的上下文中描述了与本公开的某些实施方式相关联的优点，但是其他实施方式也可以展现出这样的优点，并且并非所有实施方式都必须展现出这样的优点以落入本公开的范围内。
[0257]
本文所述的技术通过以下实施例进一步说明，这些实施例决不应被解释为进一步限制。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。
[0258]
实施例
[0259]
以上是对本发明的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方式，无意于限制本发明。
[0260]
实施例1 chi3l1xpd1双特异性抗体(frgxpd1-scfv)的产生和表征
[0261]
为了产生识别并中和chi3l1和pd1的双特异性抗体，我们使用了我们实验室最近开发的、描述于美国专利号10,253,111的抗-人chi3l1抗体(称为“frg”)的骨架。pd1单链可变片段(scfv-pd1)是基于从公共领域获得的序列信息稍加修改后产生的。如表1所示，scfv-pd1通过接头被附接至chi3l1抗体的轻链或重链。表2提供了scfv-pd1和接头的氨基酸序列。二价chi3l1xpd1抗体的构建体通过dna序列分析确认。
[0262]
chi3l1xpd1构建体被单独转染进hek-293t贴壁细胞。通过竞争性elisa评估双特异性抗体对chi3l1和pd-1的结合亲和力，并与单独抗体部分的结合比较。
[0263]
如图2所示，上清中分泌的双特异性抗体能够检测重组人(rh)chi3l1和rhpd1。这些研究表明，双特异性抗体和单独抗体部分对于rhchi3l1和rhpd1具有相似的亲和力水平(其)和相似的检出限(lod；2ng/ml)。蛋白-a柱被用于进一步纯化抗体。
[0264]
综上所述，我们已经成功地产生并表征了对rhchi3l1和rhpd1高亲和力反应的双特异性抗体(参见图1和图2)。如图1所示，两种不同的方法被用于产生这些双特异性抗体。使用这些平台，我们产生了chi3l1-lc-pd1和chi3l1-hc-pd双特异性(二价)抗体，每个抗体都检测人chi3l1和人pd1。chi3l1-lc-pd1抗体对于rhchi311和rhpd1的亲和力(通过竞争性elisa试验评估)估计为kd≈1x10-9
m，检出限(lod)为2ng/ml。在chi3l1-lc-pd1和chi3l1-hc-pd1抗体之间，对rhchi3l1或rhpd1的结合亲和力没有显著差异(图2和数据未显示)。
[0265]
实施例2双特异性chi3l1xpd1抗体的t细胞-u87结合和抗肿瘤细胞毒性活性的表征
[0266]
jurkat细胞结合至u87细胞的能力和双特异性chi3l1xpd1抗体的抗肿瘤细胞毒性活性使用体外共培养系统评估，其包含u87成胶质细胞瘤(atcc#htb-14)和jurkat t细胞(atcc#tib152)。人成胶质细胞瘤(u87)细胞在完全emem培养基中生长。在5％co2和空气中，jurkat(t细胞)通过用rpmi完全培养基中的α-cd3/α-cd28抗体(5μg/ml)刺激2小时激活。然后jurkat细胞被离心、洗涤并用新鲜的完全rpmi培养基重悬。u87和jurkat细胞在完全rpmi培养基中以1∶6的比率培养。
[0267]
在存在igg同种型对照、单独抗-pd1、单独抗-chi3l1、抗-chi311和抗-pd-1组合(各5μg/ml)或上述双特异性抗体的情况下评估这些共培养物的反应。总的来说，有五个处理组：(i)同种型igg对照，(ii)α-pd1，(iii)α-chi3l1，(iv)α-chi3l1+α-pd1，和(v)双特异性α-chi3l1xpd1。将共培养的细胞在5％co2和空气中培养6-12小时。用显微镜评估t细胞-u87细胞的结合，用tunel染色和ldh释放细胞毒性试验评估细胞死亡，如下所述。
[0268]
a.j
urkat
细胞附着到u87细胞的定量分析
[0269]
jurkat t细胞由抗-(α)-人cd3和α-cd28抗体激活(每个5μg/ml，在5％co2和空气在37℃下孵育2小时)并与u87成胶质细胞瘤细胞共培养，使用同种型对照或上述的其他抗体。cellbrite细胞质膜染料用于u87(红)和jurkat t细胞(绿)的荧光标记。使用荧光显微镜(原始放大倍数20倍)对每个u87细胞的jurkat t细胞数量进行计数，并在随机选择的10个显微镜视野中取平均值。
[0270]
如图3所示，用双特异性chi3l1xpd1抗体处理突出地增强了jurkat t细胞对u87细胞的附着。重要的是，双特异性抗体的效果比单独用α-chi3l1或α-pd1处理或用α-chi3l1和α-pd1组合处理的效果显著地更突出。
[0271]
b.凋亡的u87细胞死亡的tunel试验定量分析
[0272]
末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp缺口末端标记用于原位评估细胞死亡，有两种不同的方法来进行：
[0273]
(i)将不同小室的共培养处理的细胞固定并透化，用荧光素碘化丙啶(红色染料)和cyto(绿色染料)染色。荧光红色的细胞是死细胞，绿色的是活细胞。使用荧光显微镜(原始放大倍数20倍)计算u87细胞的活细胞和死细胞的数量，并在随机选择的10个显微镜视野
中取平均值。
[0274]
(ii)末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp缺口末端标记用于原位评估细胞死亡。在选定的研究中，tunel阳性染色是用明场显微镜评估的。死亡或凋亡的细胞被染成蓝色，活细胞用核快红(nuclear fast red)染色。使用荧光和普通显微镜(原始放大倍数20倍)计算u87细胞的活细胞和死细胞的数量，并在随机选择的10个显微镜视野中取平均值。
[0275]
如图4所示，用双特异性chi3l1xpd1抗体处理突出地增强了jurkat t细胞诱导u87细胞的细胞毒性/凋亡反应的能力。重要的是，双特异性抗体的效果比单独用α-chi3l1或α-pd1处理或用α-chi3l1和α-pd1组合处理的效果显著地更突出。
[0276]
c.颗粒酶和穿孔素积累的定量
[0277]
颗粒酶和穿孔素是由包括jurkat细胞在内的各种活化的细胞毒性t细胞分泌的主要细胞毒性酶。使用针对颗粒酶(图5)或穿孔素(图6)(红色)的抗体和鬼笔环肽肌动蛋白丝(绿色)的双标记免疫组化法测量这些细胞毒性酶在共培养细胞中的表达水平。使用荧光显微镜(原始放大倍数20倍)计数颗粒酶+或穿孔素+的细胞的数量，并在随机选择的10个显微镜视野中取平均值。
[0278]
如图5和图6所示，用双特异性chi3l1xpd1抗体处理突出地增强了与u87细胞共培养的jurkat t细胞中颗粒酶和穿孔素的积累。重要的是，双特异性抗体的效果比单独用α-chi3l1或α-pd1处理或用α-chi3l1和α-pd1组合处理的效果显著地更突出。
[0279]
这些结果表明，双特异性chi3l1xpd1抗体以协同的方式增强了t细胞的细胞毒性作用。
[0280]
d.ldh释放细胞毒性试验
[0281]
乳酸脱氢酶(ldh)在细胞毒性损伤导致的膜完整性丧失后被释放到培养基中。因此，ldh的释放被用作细胞死亡的指示。这是用偶联的两步反应来评估的。在第一步反应中，通过乳酸氧化为丙酮酸，ldh催化nad+还原为nadh和h
+
。在第二步中，心肌黄酶(diaphorase)利用新形成的nadh和h
+
催化四唑盐(int)还原成高色的甲臜，甲臜在490-520nm处有强烈的吸收。
[0282]
细胞毒性水平％是用商业试验试剂盒(皮尔斯ldh细胞毒性试验试剂盒)按照制造商提供的方案测定的。在这些实验中，在存在或不存在上述抗体的情况下共同培养细胞。过夜孵育后评估培养基中的ldh。这些值与下列对照比较：(a)不含细胞的完全培养基对照，以确定用于培养基补充的血清中存在的ldh背景活性；(b)无血清培养基；(c)ldh活性对照(水)；以及(d)用裂解缓冲液处理的细胞释放的最大ldh活性。在这些试验中，细胞毒性％如下所述计算。
[0283][0284]
如图7所示，用双特异性chi3l1xpd1抗体处理突出地增强了jurkat t细胞在u87细胞中诱导ldh释放和细胞毒性反应的能力。重要的是，双特异性抗体的效果比单独用α-chi3l1或α-pd1处理或用α-chi3l1和α-pd1组合处理的效果显著地更突出。
[0285]
图8进一步说明了双特异性chi3l1xpd1抗体的协同作用。frgxpd-1双特异性抗体的抗肿瘤作用是在含有jurkat细胞和a375人类黑色素瘤细胞的共培养系统中评估的。jurkat t细胞用抗-cd3和抗-cd28(各1μg/ml，在37℃的5％co2和空气中孵育2小时)预处
理，使其激活。然后jurkat细胞与a357人黑色素瘤细胞共培养24小时。这些共同培养是在以下抗体存在的情况下进行的：同种型对照抗体(5μg/ml)、单独抗-pd-1或单独抗-chi3l1(frg)(5μg/ml)，或组合(各2.5μg/ml)，以及双特异性frgxpd-1抗体(5μg/ml)。a列提供了使用原位细胞检测试剂盒-荧光素dutp对细胞凋亡的肿瘤细胞死亡的代表性证明和定量。tunel(+)细胞染色为绿色。b-d列提供了cd8(b列)、穿孔素(c列)和颗粒酶(d列)的jurkat t细胞表达的代表性证明和量化。肿瘤细胞为绿色，染色阳性的jurkat细胞为黄橙色。e列提供了肿瘤细胞pten的代表性证明和量化。肿瘤细胞为绿色，pten为黄橙色。f行提供了a-e列中评估的量化。图示了tunel+肿瘤细胞的百分比(a列)、表达cd8的jurkat细胞的百分比(b列)、穿孔素(c列)和颗粒酶(d列)以及表达pten的肿瘤细胞的百分比(e列)。这些评估是使用荧光显微镜(原始放大倍数20倍)完成的。在这些量化中，评估了10个随机选择的区域。图8中的数据显示双特异性chi3l1xpd1抗体处理诱导协同ctl-介导的肿瘤细胞死亡反应和肿瘤细胞pten表达。
[0286]
综上所述，与α-chi3l1和α-pd1抗体单独或组合处理相比，新开发的双特异性chi3l1xpd1抗体产生了增强的t细胞和u87细胞结合，并增强了对u87肿瘤细胞的细胞毒性作用。这些结果表明，在治疗chi3l1及其受体和pd1及其配体(pd-l1，pd-l2)失调的肿瘤中，本发明的双特异性chi3l1xpd1抗体将是比α-chi3l1或α-pd1抗体单独或组合使用更有效的治疗方法。
[0287]
上述书面说明被认为足以使本领域的技术人员实践本发明和实施方式的。本发明和实施方式的范围不应受到所提供的例子的限制，因为这些例子旨在作为一个方面的单一说明，其他功能上等同的实施方式也在本公开的范围内。除了在此示出和描述的修改之外的各种修改对于本领域的技术人员来说由前述描述中是显而易见的，并属于所附权利要求的范围。本文所描述的优点和目的不一定包含在每个实施方式中。本领域技术人员应了解或能够确定采用不超过常规实验即可获得本文所述的具体实施方式的许多等同形式。这样的等同形式意在被所附权利要求所涵盖。
[0288]
参考文献：
[0289]
《a
beloff
的临床肿瘤学》(a
beloff’s c
linical o
ncology
)，第2版(2000)baltzer，l.和berkery，r.(编)丘吉尔利文斯通公司(churchill livingstone，inc.)；perry，等，第17章节，“化疗(chemotherapy.)”。
[0290]
《a
beloff
的临床肿瘤学》(a
beloff’s c
linical o
ncology
)，第5版，(2013).niederhuber，j.，等(编)爱思唯尔(elsevier)；第28-29章，“癌细胞的靶向治疗：分子靶向药物和癌症药理学时代(therapeutic targeting of cancer cells：era of molecularly targeted agents and cancer pharmacology)”(isbn：9781455728657)。
[0291]
ansell，s.m.，等(2015).“在复发性或难治性霍奇金淋巴瘤中使用纳武单抗阻断pd-1(pd-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory hodgkin’s lymphoma.)”n.engl.j.med.372：311-319。
[0292]
《分子生物学基本方法》(b
asic m
ethods in m
olecular b
iology
)，(2012).davis等(编)爱思唯尔科学出版公司(elsevier science publishing，inc.)，美国纽约(isbn 044460149x)。
[0293]
《生物化学》(b
iochemistry
)，第2版，(1975).lehninger，a.l.(编)，沃思出版公司
(worth publishers)，纽约，第73-75页。
[0294]
byrd，j.c.，等(2014).“进入慢性淋巴细胞白血病靶向治疗时代：对临床医生的影响(entering the era of targeted therapy for chronic lymphocytic leukemia：impact on the practicing clinician.)”j.clin.oncol.32：3039-3047.
[0295]
chothia，c.等(1987).“免疫球蛋白高变区的经典结构(canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.)”j.mol.biol.196：901-917。
[0296]
chothia，c.等(1989).“免疫球蛋白高变区的构象(conformations of immunoglobulin hypervariable regions.)”nature 342：877-883(1989)。
[0297]
《免疫学现行方案》(c
urrent p
rotocols in i
mmunology
)(cpi)，(2003).coligan，j.e.，等(编)约翰
·
威利父子公司(john wiley and sons，inc.)(isbn0471142735，9780471142737)。
[0298]
《分子生物学现行方案》(c
urrent p
rotocols in m
olecular b
iology
)(cpmb)，(2014).ausubel，f.m.(编)，约翰
·
威利父子公司(john wiley and sons)(isbn 047150338x，9780471503385)。
[0299]
《蛋白质科学现行方案》(c
urrent p
rotocols in p
rotein s
cience
)(cpps)，(2005).coligan，j.e.(编)，约翰
·
威利父子公司(john wiley and sons，inc.)。
[0300]
garon，e.b.，等(2015).“派姆单抗用于治疗非小细胞肺癌(pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.)”n.engl.j.m编372：2018-2028.
[0301]
《实用免疫组织化学手册》(h
andbook of p
ractical i
mmunohistochemistry
)，(2011).lin，f.，等(编)，由施普林格出版社公开。
[0302]
《哈里森内科学原理》(h
arrison
′
s p
rinciples of i
nternal m
edicine
)，第18版，(2011).longo，d.l.等(编)，由mcgraw-hill专业出版社(mcgraw-hill professional publishing)公开；slapak和kufe，《癌症治疗原理》(principles of cancer therapy)第85章。
[0303]
hellmann，m.d.，等(2019).“纳武单抗加伊匹单抗治疗晚期非小细胞肺癌(nivolumab plus ipilimumab in advanced non-small-cell lung cancer.)”n.engl.j.m编381：2020-2031。
[0304]
herbst r.s.，等(2014).“癌症患者对抗-pd-l1抗体mpdl3280a反应的预测性相关因素(predictive correlates of response to the anti-pd-l1 antibody mpdl3280a in cancer patients.)”nature.515：563-567。
[0305]
hoyos，v.，等(2012).“用于治疗血液系统恶性肿瘤的人t淋巴细胞的基因改造(genetic modification of human tlymphocytes for the treatment of hematologic malignancies.)”haematologica 97：1622-1631。
[0306]
ikeda，y.and taira，k.(2006).“治疗性sirna的配体靶向递送(ligand-targeted delivery of therapeutic sirna.)”pharmaceutical res.23：1631-1640。
[0307]immunocytochemistry
：《生物医学研究的实用指南》a p
ractical g
uide for b
iomedical r
esearch
，(2009)；burry，r.w.(编)；由施普林格出版社公开(isbn 978-1-4419-1304-3)。
[0308]
《免疫组化：基本原理和方法》(i
mmunohistochemistry
：b
asics and m
ethods
)，(2010).buchwalow，i.b.和w.(eds)；由施普林格出版社公开(isbn-10：3642046088)。
[0309]
《免疫学》(i
mmunology
)，(2006).luttmann，w.等(编)由施普林格出版社公开(isbn：9780120885442)。
[0310]
国际专利公开wo 2003/063792；kuchroo，v.k.，等，“与tim-3(一种th1特异性细胞表面分子)有关的组合物和方法(compositions and methods related to tim-3，a th1-specific cell surface molecule.)”公开：2003年8月7日。
[0311]
国际专利公开wo 2019/060675；chupp，g.和cohn，l.，“抗-ykl40抗体及使用方法(anti-ykl40 antibodiesand methods of use.)”公开：2019年3月28日。
[0312]
《j
aneway
的免疫生物学》(j
aneway
′
s i
mmunobiology
)，(2014).murphy，k.，等(编)，由泰勒与弗朗西斯有限公司(taylor&francis limited)公开，(isbn0815345305，9780815345305)。
[0313]
kabat，e.a.，等(1987和1991).《免疫学意义的蛋白质的序列》(s
equences of p
roteins of i
mmunological i
nterest
).第五版，美国卫生和人类服务部(u.s.department of health and human services)，nih出版号91 3242。
[0314]
kim，s.h.，等(2008).“利用聚电解质复合物胶束对vegf sirna进行局部和全身递送以有效治疗癌症(local and systemic delivery of vegf sirna using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer.)”journal of controlled release 129(2)：107-116。
[0315]
《酶学的实验室方法：dna》(l
aboratory m
ethods in e
nzymology
：dna)，第1版，(2013).lorsch，j.(编)爱思唯尔出版社(isbn 0124199542)。
[0316]
larkin，j.，等(2015).“纳武单抗和伊匹单抗联合治疗或单药治疗未经治疗的黑色素瘤(combined nivolumab and ipilimumab or monotherapy in untreated melanoma.)”n.engl.j.m编373：23-34。
[0317]
《l
ewin
基因xi》(l
ewin
′
s g
enes xi)，第11版，(2014).krebs，j.e.，等(编)，由琼斯和巴特利出版公司公开(isbn-1449659055)。
[0318]
lorenze，c.，等(2004).“类固醇和脂质偶联的sirna增强肝细胞的摄取和基因沉默(steroid and lipid conjugates of sirnas to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells.)”bioorg.m编chem.lett.14：4975-4977。
[0319]
maccallum，r.m.，等(1996).“抗体-抗原的相互作用：接触分析和结合点拓扑图(antibody-antigen interactions：contact analysis and binding site topography.)”j.mol.biol.262(5)：732-745。
[0320]
maher，j.and wilkie，s.(2009).“car机制：驱动t细胞进入癌症的muc(car mechanics：driving t cells into the muc of cancer.)”cancer res 69：4559-4562。
[0321]
maus，m.v.，等(2014).“抗体修饰的t细胞：car占据了血液学恶性肿瘤的前位(antibody-modified t cells：cars take the front seat for hematologic malignancies.)”blood 123：2624-2635。
[0322]
mcnamara，j.o.，等(2006).“用适配体-sirna嵌合体向特定细胞类型递送的sirna(cell type-specific delivery of sirnas with aptamer-sirna chimeras.)”nat.biotechnol.24：1005-1015。
[0323]
《分子生物学和生物技术：一本全面的案头参考书》(m
olecular b
iologyand b
iotechnology
：
of modified sirnas.)”nature 432：173-178。
[0338]
tamada，k.，等(2012).“利用带标签的抗体将基因修饰的t细胞重新导向各种癌症类型(redirecting gene-modified t cells toward various cancer types using tagged antibodies.)”clin cancer res 18：6436-6445。
[0339]
《癌症化疗手册》(t
he c
ancer c
hemotherapy h
andbook
)，第4版(2003).fischer，d.s.等(编)mosby-year book，圣路易斯(isbn-10：0801668824)。
[0340]
《分子细胞生物学和分子医学的百科全书》(t
he e
ncyclopedia of m
olecular c
ell b
iology and m
olecular m
edicine
)，(1999-2012)porter，r.s.，等(编)，由布莱克韦尔科学有限公司公开，(isbn 9783527600908)。
[0341]
《默克诊断与治疗手册》(t
he m
erck m
anual of d
iagnosis and t
herapy
)，第19版，(2011).由默克默沙东公司公开，(isbn 978-0-911910-19-3)。
[0342]
topalian s.l.，等，(2012).“抗pd-1抗体在癌症中的安全性、活性和免疫相关因素(safety，activity，and immune correlates of anti-pd-1 antibody in cancer.)”n.engl.j.m编366：2443-2454。
[0343]
美国专利号5,585,089；queen，c.l.等，“人源化免疫球蛋白(humanized immunoglobulins.)”授权：1996年12月17日。
[0344]
美国专利号6,824,989.eisinger，d.等，“将单克隆抗体重组至含磷酸酪氨酸蛋白(recombinant monoclonal antibody to phosphotyrosine-containing proteins.)”授权：2004年11月30日。
[0345]
美国专利号6,835,823；le，j.等“抗-tnf抗体和人肿瘤坏死因子肽(anti-tnf antibodies and peptides of human tumor necrosis factor.)”授权：2004年11月28日。
[0346]
美国专利号7,427,605；davis，m.e..等，“核糖核苷酸还原酶亚基2的抑制剂及其用途(inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof.)”授权：2008年9月23日。
[0347]
美国专利号8,172,901；altman，g.h.等，“假体装置及其制造方法(prosthetic device and method of manufacturing the same.)”授权：2012年5月8日。
[0348]
美国专利号8,329,660；kuchroo；v.k.，等，“tim-3配体及其方法(tim-3ligands and methods thereof.)”授权：2012年11月11日。
[0349]
美国专利号10,155,037；abdiche y.n.，等；“抗pd-1抗体及其使用方法(anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof.)”授权：2018年12月18日。
[0350]
美国专利号10,221,244；wong，b.，等；“抗csf1r抗体和抗pd-1抗体组合治疗癌症(anti-csf1r antibody and anti pd-1 antibody combination therapy for cancer.)”授权：2019年3月5日。
[0351]
美国专利号10,239,942；amirina，n.，等；“抗pd-1抗体(anti-pd-1 antibodies.)”授权：2019年3月26日。
[0352]
美国专利号10,280,224；wang c.-i.，等；“抗pd-1抗体(anti-pd-1 antibodies.)”授权：2019年5月7日。
[0353]
美国专利号10,316,089，baruah，h.，等；“pd-1抗体(pd-1 antibodies.)”授权：2019年6月11日。
[0354]
美国专利号10,323,091；van dijk，m.，等；“抗pd-1抗体及其使用方法(anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof.)”授权：2019年6月18日。
[0355]
美国专利号10,344,090；yuan，j.，等；“pd-1抗体、其抗原结合片段及其医学应用(pd-1 antibody，antigeh-binding fragment thereof，and medical application thereof.)”授权：2019年7月9日。
[0356]
美国专利号10,253,111；elias，j.a.等，“与抗-chi3l1抗体试剂相关的方法和组合物(methods and compositions relating to anti-chi3l1 antibody reagents.)”授权：2019年4月9日。
[0357]
美国公开号2011/0009960；altman，g.h.等，“假体织物结构(prosthetic fabric structure.)”公开：2011年1月13日。
[0358]
美国公开号2011/0123550；shibayama，s.等，“使用功效标志物优化抗-人pd-1抗体对癌症的治疗功效(use of an efficacy marker for optimizing therapeutic efficacy of an anti-human pd-1 antibody on cancers.)”公开：2011年5月26日。
[0359]
美国公开号2011/0167602；altman，g.h.等，“基于免疫中性丝纤维的医疗器械(immunoneutral silk fiber-based medical devices.)”公开：2011年7月14日。
[0360]
美国公开号2012/0296352；altman，g.h.等，“丝胶提取物(sericin extracted fabrics.)”公开：2012年11月22日。
[0361]
美国公开号2016/0376367；yuan，j.等，“pd-1抗体、其抗原结合片段及其医学应用。(pd-1 antibody，an antigen-binding fragment thereof，and medical application thereof.)”公开：2016年12月29日。
[0362]
美国公开号2017/0210806；liu j.，“抗pd-1抗体及其用途(anti-pd-1 antibody and use thereof.)”公开：2017年7月27日。
[0363]
美国公开号2019/0062457；elias，j.a.，“与抗chi3l1抗体试剂相关的方法和组合物(methods and compositions relating to anti-chi3l1 antibody reagents.)”公开：2019年6月28日。
[0364]
weber，j.s.，等(2015).“(纳武单抗和化疗在抗-ctla-4治疗后进展的晚期黑色素瘤患者中的对比(checkmate 037)：一项随机、对照、开放标签的3期试验。)nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-ctla-4 treatment(checkmate 037)：a randomised，controlled，open-label，phase 3 trial.”lancet oncol.16：375-384。
[0365]
wolchok，j.d.，等(2013).“(纳武单抗加上伊匹单抗在晚期黑色素瘤中)nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.”n.engl.j.m编369：122-133。
[0366]
所有专利和其他出版物；包括文献参考物、已授权专利、已公开的专利申请和共同申请的专利申请；出于描述和公开例如此类出版物中描述的可能与本文描述的技术结合使用的方法的目的，本技术全文引用的内容通过引用明确纳入本文。提供的出版物仅针对其在本技术提交日之前的公开。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权因在先发明或任何其他原因而提前于此类公开。所有关于日期或表示这些文件内容的陈述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。