预测或诊断非酒精性脂肪肝病的试剂盒及诊断非酒精性脂肪肝病的方法与流程

1.本发明涉及一种用于预测或诊断非酒精性脂肪肝病的试剂盒，以及诊断非酒精性脂肪肝病的方法。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝病(nafld)的特征是代谢紊乱的肝脏疾病，从简单的脂肪变性，到非酒精性脂肪性肝炎(nash)，这是一种侵略性的组织形式，最终导致晚期纤维化和肝硬化。在大多数流行病学研究中，非酒精性脂肪肝病的全球患病率估计为24-30％，并与肥胖症和代谢综合征同步增长。尽管非酒精性脂肪肝病通常与肥胖有关，但与在肥胖型非酒精性脂肪肝病患者中所观察到的类似的临床症状和病理严重程度可能发生在非肥胖型受试者中。在不考虑定义肥胖的不同身体质量指数(bmi)的界限(亚洲人≥25，其他种族≥30)的情况下，据一致报道，在西方和东方，3-30％的非肥胖人口有非酒精性脂肪肝病。尽管内脏脂肪、食物成分和遗传因素可能与非肥胖型非酒精性脂肪肝病有关，但还需要考虑其他环境因素的额外研究来阐明非肥胖型非酒精性脂肪肝病的发病机制。
3.最近，人们越来越关注识别和了解肠道菌群在各种代谢性疾病中的具体作用。肠道失调是指肠道菌群与正常菌群相比的异常变化，与产生有益短链脂肪酸(scfa)的细菌减少、胆汁酸成分的变化、对脂多糖(lps)的免疫反应的激活、乙醇产生细菌增生导致的乙醇产量增加、以及磷脂酰胆碱转化为胆碱和三甲胺有关。已知，影响肠道-肝脏轴的肠道菌群的变化有助于慢性肝病的发展，如非酒精性脂肪肝病和肝硬化以及晚期纤维化。
4.boursier等人比较了轻度和重度纤维化患者的菌群变化，观察到重度纤维化患者明显的肠道细菌失衡和功能变化(非专利文献1)。loomba等人利用元基因组数据确定了37种在晚期纤维化的非酒精性脂肪肝病患者中明显富集或明显减少的细菌，并提出了一种基于菌群的生物标志物来预测纤维化(非专利文献2)。bajaj等人定义了肝硬化进展过程中的肠道菌群概况(非专利文献3)。中国队列研究观察到肝硬化患者的肠道菌群变化(非专利文献4)。然而，与疾病严重程度和纤维化阶段相关的微生物分类群与以前的非酒精性脂肪肝病研究不一致。这种差异可能是由于地区差异的影响(非专利文献5)。然而，基本bmi状态的差异可解释这种不一致的结果。此外，非肥胖型非酒精性脂肪肝病组的肠道菌群和相关代谢物的具体变化也很少被定义。
5.因此，需要一种预防、治疗和诊断非肥胖型非酒精性脂肪肝病的方法，该方法可以确定非酒精性脂肪肝病的组织学严重程度，很好地描述了肠道菌群的变化，且该方法是有效的。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明是为了解决上述问题，其目的是提供非酒精性脂肪肝病的检测标志物，该
检测标志物包含选自由微生物标志物、胆汁酸及其成分和肠道短链脂肪酸组成的组中的一种或多种检测标志物；使用该检测标志物预测或诊断非酒精性脂肪肝病的风险程度的试剂盒；预测或诊断的方法，或提供使用该检测标志物预测或诊断非酒精性脂肪肝病的风险程度信息的方法；以及筛选非酒精性脂肪肝病的治疗剂的方法。
8.技术方案
9.为了实现上述目的，本发明提供了非酒精性脂肪肝病的检测标志物和用于预测或诊断非酒精性脂肪肝病的风险程度的试剂盒，包含一种或多种检测该检测标志物的检测装置。
10.试剂盒可用于通过以下来预测或诊断非酒精性脂肪肝病的风险程度，包括上述检测特定受试者并指定特定检测受试者的数量、活性、人群等的检测装置，或与其他检测受试者进行结果比较。
11.在本发明中，诊断包括确认疾病的存在与否、疾病的风险程度、疾病的状态和疾病的预后，并包括用于获得疾病状态和决策的所有类型的分析。
12.在本发明的一种实施方式中，非酒精性脂肪肝病可以是非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化。
13.在本发明的一种实施方式中，预测疾病的风险程度可以预测纤维化的严重程度。纤维化的严重程度可包括f＝0至f＝4，f＝0表示无肝纤维化；f＝1表示轻度肝纤维化；f＝2表示显著肝纤维化；f＝3表示晚期肝纤维化；f＝4表示肝硬化。
14.在本发明的一种实施方式中，该试剂盒可用于非肥胖患者，例如，bmi为25kg/m2或以下的非肥胖患者。
15.非酒精性脂肪肝病的检测标志物可包含微生物标志物、总胆汁酸及成分、肠道短链脂肪酸中的一种或多种。
16.在本发明的一种实施方式中，该试剂盒可包含能够检测选自下列检测标志物中的一种或多种的检测装置：
17.(a)分别检测选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种的一种或多种检测装置；
18.(b)分别检测选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种的一种或多种检测装置；以及
19.(c)分别检测选自由肠道短链脂肪酸所组成的组中的一种或多种的一种或多种检测装置。
20.该试剂盒可以包含例如(a)；(b)；(c)；(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)、(b)、和(c)。
21.在本说明书中，总胆汁酸、胆汁酸的成分、和短链脂肪酸等被用作包含其所有代谢物的含义。
22.非酒精性脂肪肝病的微生物标志物，在科水平上，可以是选自由肠杆菌科(enterobacteriaceae)、韦荣球菌科(veillonellaceae)、理研菌科(rikenellaceae)、梭杆菌科(fusobacteriaceae)、瘤胃球菌科(ruminococcaceae)、毛螺菌科(lachnospiraceae)、放线菌科(actinomycetaceae)、脱硫菌科(desulfovibrioceae)和脱硫弧菌科(desulfovibrionaceae)所组成的组中的一种或多种。例如，可以是选自由肠杆菌科、韦荣
球菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科和放线菌科所组成的组中的一种或多种，选自由肠杆菌科、韦荣球菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科所组成的组中的一种或多种，或者选自由肠杆菌科、韦荣球菌科和瘤胃球菌科所组成的组中的一种或多种。
23.肠杆菌科微生物的一个实例可以是枸橼酸杆菌属(citrobacter)和克雷伯氏杆菌属(klebsiella)中的一种或多种，韦荣球菌科微生物的一个实例可以是韦荣球菌属(veillonella)和巨单胞菌属(megamonas)中的一种或多种，梭杆菌科微生物的一个实例可以是梭杆菌属(fusobacterium)。脱硫弧菌科微生物的一个实例可以是脱硫弧菌属(desulfovibrio)，瘤胃球菌科(ruminococcaceae)微生物可以是瘤胃球菌属(ruminococcus)、粪杆菌属(faecalibacterium)和颤螺菌属(oscillospira)中的一种或多种，毛螺菌科微生物可以是粪球菌属(coprococcus)和毛螺菌属(lachnospira)中的一种或多种，且放线菌科微生物可以是放线菌属(actinomyces)。
24.作为一个实例，(a)可以是一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由肠杆菌科、韦荣球菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科所组成的组中的一种或多种。
25.根据本发明的微生物标志物，在属水平上，可以是选自由枸橼酸杆菌属、克雷伯氏杆菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属和毛螺菌属所组成的组中的一种或多种，具体而言，其可以是选自由瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属、韦荣球菌属、巨单胞菌属和毛螺菌属所组成的组中的一种或多种，更具体地说，其可以是选自由瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属和毛螺菌属所组成的组中的一种或多种，或选自由韦荣球菌属和巨单胞菌属所组成的组中的一种或多种。
26.总胆汁酸和胆汁酸成分可以是选自由包含总胆汁酸、胆酸和鹅去氧胆酸(chendeoxycholic acid)的初级胆汁酸；以及包含熊去氧胆酸(ursodeoxycholic)、石胆酸(lithocholic acid)和去氧胆酸(deoxycholic acid)的次级胆汁酸所组成的组中的一种或多种。
27.作为一个实例，(b)可以是一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸和去氧胆酸所组成的组中的一种或多种。
28.作为一个实例，(c)可以是一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由乙酸盐(acetate)、丙酸盐(propionate)和丁酸盐(butyrate)所组成的组中的一种或多种。
29.在本发明的一种实施方式中，试剂盒可包含选自以下(a)至(h)的组合：
30.(a)中的检测装置，
31.(b)的检测装置，
32.(c)的检测装置，
33.(d)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由肠杆菌科、韦荣球菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和丙酸盐所组成的组中的一种或多种，
34.(e)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属、毛螺菌属、总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸和去氧胆酸所组成的组中的一种或多种，
35.(f)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属、毛螺菌属和粪便丙酸盐(fecal propionate)组成的组中的一种或多
种，
36.(g)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由韦荣球菌属、巨单胞菌属、总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸和去氧胆酸所组成的组中的一种或多种；以及
37.(h)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由韦荣球菌属、巨单胞菌属和粪便丙酸盐所组成的组中的一种或多种。
38.检测装置(a)可以是，例如，一种或多种检测装置，每种检测装置都能检测选自由肠杆菌科、韦荣球菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科所组成的组中的一种或多种。
39.检测装置(b)可以是，例如，一种或多种检测装置，每种检测装置都能检测选自由总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸和去氧胆酸组成的组中的一种或多种。
40.检测装置(c)可以是，例如，一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由短链脂肪酸、乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐所组成的组中的一种或多种。
41.在本发明的一种实施方式中，试剂盒可包含选自以下(i)至(k)的组合中的一种或多种：
42.(i)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由肠杆菌科、韦荣球菌科、瘤胃球菌科、枸橼酸杆菌属、克雷伯氏杆菌属、韦荣球菌属、巨单胞菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属和颤螺菌属所组成的组中的一种或多种，
43.(j)一种或多种检测装置，每种检测装置能够检测选自由胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和其代谢物所组成的组中的一种或多种；以及
44.(k)一种或多种检测装置，每种检测装置都能检测选自由肠道短链脂肪酸和丙酸盐所组成的组中的一种或多种。
45.作为一个实例，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可以包含选自由以下组成的组中的一种或多种：肠杆菌科、韦荣球菌科、理研菌科、梭杆菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科、放线菌科、脱硫菌科(desulfovibrioceae)、脱硫弧菌科、枸橼酸杆菌属、克雷伯氏杆菌属、韦荣球菌属、巨单胞菌属、梭杆菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属、毛螺菌属、放线菌属、脱硫弧菌属、总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸、去氧胆酸、短链脂肪酸、乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。
46.作为一个具体实例，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可以包含肠杆菌科、韦荣球菌科和瘤胃球菌科。根据本技术的实例，在结合使用三种细菌标志物的情况下，可以对非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝进行预测，准确度高达auroc 0.8或更高(图5a)。
47.作为一个具体的实例，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可以包含巨单胞菌属和瘤胃球菌属。根据本技术的实例，在结合使用两种细菌标志物的情况下，可以预测非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝，准确度高达auroc 0.7或更高(图5b)。
48.作为一个具体的实例，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可以包含胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和丙酸盐。根据本技术的实例，在结合使用4种代谢物标志物的情况下，可以对非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝进行预测，准确度高达auroc 0.7或更高。
49.作为一个具体实例，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可包含肠杆菌
科、韦荣球菌科、瘤胃球菌科、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和丙酸盐。根据本技术的实例，在结合使用3种细菌标志物和4种代谢物标志物的情况下，可以对非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝进行预测，准确度高达auroc 0.9或更高。另外，根据本发明的非酒精性脂肪肝病的检测标志物可包含巨单胞菌属、瘤胃球菌属、胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和丙酸盐。根据本技术的实例，在结合使用2种细菌标志物和4种代谢物标志物的情况下，可以预测非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝，准确度高达auroc 0.9或更高。这显著高于传统使用的非酒精性脂肪肝的生物标志物的准确度，因此，可以看出，根据本发明的预测非酒精性脂肪肝的生物标志物可以准确地预测非酒精性脂肪肝，特别是可以更准确地预测非肥胖型受试者的非酒精性脂肪肝。
50.本发明提供了一种预测或诊断的方法，或提供预测或诊断非酒精性脂肪肝病风险程度的信息的方法，包括检测选自由以下组成的组中的一种或多种检测标志物：(a)选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物；(b)选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物；以及(c)选自由肠道短链脂肪酸所组成的组中的一种或多种检测标志物。
51.在本发明的一种实施方式中，非酒精性脂肪肝病可以是非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化。在本发明的一种实施方式中，预测风险程度可以是预测纤维化的严重程度。在本发明的一种实施方式中，用于诊断的方法或用于提供诊断信息的方法可以是针对bmi《25kg/m2的非肥胖型患者。
52.在本发明的一种实施方式中，该方法可包括选自以下的一个或多个步骤：
53.(i)测量微生物标志物的丰度，作为选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物；
54.(ii)测量粪便中选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物的含量；以及
55.(iii)测量粪便中选自由肠道短链脂肪酸，例如，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐所组成的组中的一种或多种检测标志物的含量。
56.在本发明的一种实施方式中，该方法可包括：针对可包含在试剂盒中的检测标志物(a)至(c)、(a)至(h)、(i)至(k)或(a)至(k)，将受试者个体的检测值和与其相对应的健康个体的参考值进行比较。
57.在本发明的一种实施方式中，由于比较受试者的检测值和与其相对应的健康个体的参考值的结果，根据以下检测标志物的增加或减少，受试者个体的检测值与健康个体的参考值相比增加或减少，该方法可包含确定纤维化的严重程度高。
58.(a)关于选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物，肠杆菌科的丰度增加，韦荣球菌科的丰度增加，或瘤胃球菌科的丰度减少，
59.(b)关于选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物，粪便中胆酸的含量增加，粪便中鹅去氧胆酸的含量增加，或粪便中熊去氧胆酸的含量增加，或
60.(c)关于选自由肠道短链脂肪酸所组成的组中的一种或多种检测标志物，例如，在粪便中选自由乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐所组成的组中的一种或多种的含量增加的情况下，作为一个实例，在粪便中丙酸盐的含量增加的情况下，可以包括确定纤维化的严重程度高。
61.本发明提供了一种筛选非酒精性脂肪肝病的治疗剂的方法，包括以下步骤：
62.(1)向具有非酒精性脂肪肝病的实验动物施用测试物质。
63.(2)在未用测试物质处理的实验动物和用测试物质处理的实验动物中，测量选自由以下组成组中的一种或多种检测标志物：(a)选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物；(b)选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物；以及(c)选自由肠道短链脂肪酸所组成的组中的一种或多种检测标志物；以及
64.(3)比较未用测试物质处理的对照组和用测试物质处理的实验组的测量结果。
65.在本发明的一种实施方式中，非酒精性脂肪肝病可以是非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎或肝硬化。
66.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)的实验动物可以具有以下(1)至(5)中的一种或多种特征：
67.(1)血液alt浓度升高的情况，例如，血液alt浓度超过正常对照组的血液alt浓度的1倍、1.1倍或以上，1.2倍或以上，1.3倍或以上，1.4倍或以上，1.5倍或以上，1.6倍或以上，1.7倍或以上，1.8倍或以上，1.9倍或以上，2倍或以上，2.1倍或以上，2.2倍或以上，2.3倍或以上，2.4倍或以上，2.5倍或以上，2.6倍或以上，2.7倍或以上，2.8倍或以上，2.9倍或以上，3倍或以上，3.5倍或以上，4倍或以上，4.5倍或以上，5倍或以上，5.5倍或以上，6倍或以上，6.5倍或以上，7倍或以上，7.5倍或以上，8倍或以上，8.5倍或以上，9倍或以上，9.5倍或以上，或10倍或以上的情况。
68.(2)血液ast浓度升高的情况，例如，血液ast浓度超过正常对照组的血液ast浓度的1倍，1.1倍或以上，1.2倍或以上，1.3倍或以上，1.4倍或以上，1.5倍或以上，1.6倍或以上，1.7倍或以上，1.8倍或以上，1.9倍或以上，2倍或以上，2.1倍或以上，2.2倍或以上，2.3倍或以上，2.4倍或以上，2.5倍或以上，2.6倍或以上，2.7倍或以上，2.8倍或以上，2.9倍或以上，3倍或以上，3.5倍或以上，4倍或以上，4.5倍或以上，5倍或以上，5.5倍或以上，6倍或以上，6.5倍或以上，7倍或以上，7.5倍或以上，8倍或以上，8.5倍或以上，9倍或以上，9.5倍或以上，或10倍或以上的情况。
69.(3)盲肠中次级胆汁酸浓度下降的情况，例如，盲肠中次级胆汁酸浓度低于正常对照组的盲肠中次级胆汁酸浓度的1倍，0.9倍或更少，0.8倍或更少，0.7倍或更少，0.6倍或更少，0.5倍或更少，0.4倍或更少，0.3倍或更少，0.2倍或更少或0.1倍或更少的情况。
70.(4)纤维化标志物基因表达增加的情况，例如，纤维化标志物基因表达超过正常对照组的纤维化标志物基因表达的1倍以上，1.1倍以上，1.2倍以上，1.3倍以上，1.4倍以上，1.5倍以上，1.6倍以上，1.7倍或以上，1.8倍或以上，1.9倍或以上，2倍或以上，2.1倍或以上，2.2倍或以上，2.3倍或以上，2.4倍或以上，2.5倍或以上，2.6倍或以上，2.7倍或以上，2.8倍或以上，2.9倍或以上，3倍或以上，3.5倍或以上，4倍或以上，4.5倍或以上，5倍或以上，5.5倍或以上，6倍或以上，6.5倍或以上，7倍或以上，7.5倍或以上，8倍或以上，8.5倍或以上，9倍或以上，9.5倍或更多，10倍或更多，11倍或更多，12倍或更多，13倍或更多，14倍或更多，15倍或更多，16倍或更多，17倍或更多，18倍或更多，19倍或更多，或20倍或更多的情况。纤维化标志物基因可选自由col1a1、timp1和α-sma所组成的组中的一种或多种。
71.(5)肝脏重量与体重的比率升高的情况，例如，肝脏重量与体重的比率超过正常对
照组的肝脏重量与体重的比率的1倍，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，或3倍或更多的情况。
72.在本发明的一种实施方式中，测试物质可包含非酒精性脂肪肝病的治疗剂的候选物质，例如，其可以是选自由肽、蛋白质、非肽化合物、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆所组成的组中的一种或多种。
73.在本发明的一种实施方式中，该方法可包括选自以下的一个或多个步骤：
74.测量粪便中选自由以下组成的组中的一种或多种检测标志物的含量：
75.(i)测量微生物标志物的丰度，作为选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物；
76.(ii)测量粪便中选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物的含量；以及
77.(iii)测量粪便中选自由肠道短链脂肪酸，例如，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐所组成的组中的一种或多种检测标志物的含量。
78.在本发明的一种实施方式中，该方法可包括对患有非酒精性脂肪肝病的实验动物，比较施用测试物质的实验组和未施用测试物质的对照组的检测标志物(a)至(c)、(a)至(h)、(i)至(k)或(a)至(k)的测量值。
79.在本发明的一种实施方式中，由于比较实验组的检测值和对照组的参考值，根据与对照组的参考值相比的，实验组的检测值的每种检测标志物的增加或减少结果，该方法可选择测试物质作为非酒精性脂肪肝病的治疗剂：
80.(a)关于选自由非酒精性脂肪肝病的微生物标志物所组成的组中的一种或多种检测标志物，肠杆菌科的丰度增加，韦荣球菌科的丰度增加，或瘤胃球菌科的丰度减少。
81.(b)关于选自由总胆汁酸和胆汁酸成分所组成的组中的一种或多种检测标志物，粪便中胆酸的含量增加，粪便中鹅去氧胆酸的含量增加，或粪便中熊去氧胆酸的含量增加，或
82.(c)关于选自由肠道短链脂肪酸所组成的组中的一种或多种检测标志物，例如，在粪便中选自由乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐所组成的组中的一种或多种的含量增加的情况下，或者作为一个实例，粪便中丙酸盐的含量增加，可包含确定纤维化严重程度高的步骤。
83.在本发明的一种实施方式中，该方法可包含选择测试物质，其中与未经测试物质处理的对照组相比，肠杆菌科的丰度减少，韦荣球菌科的丰度减少，瘤胃球菌科的丰度增加，粪便中胆酸的含量减少，粪便中鹅去氧胆酸的含量减少，粪便中熊去氧胆酸的含量减少，或者粪便中丙酸盐的含量减少。
84.根据本发明的一个实例，预测非酒精性脂肪肝病的风险程度的方法、提供预测信息的方法、诊断的方法或提供诊断信息的方法可进一步包括向受试者施用非酒精性脂肪肝病的治疗剂。
85.本发明的其他实施方式涉及一种治疗非酒精性脂肪肝病的方法，该方法包括，通过根据本发明的用于预测或诊断非酒精性脂肪肝病风险程度的试剂盒、预测非酒精性脂肪肝病风险程度的方法、提供预测信息的方法、诊断的方法或提供诊断信息的方法，向被确定
为具有非酒精性脂肪肝病风险的受试者施用非酒精性脂肪肝病的治疗剂。
86.有益效果
87.使用本发明的用于预测或诊断的试剂盒可以有效地预测或诊断非酒精性脂肪肝病的风险程度，特别是在非肥胖型受试者中提供的信息的可预测性和显著性优异。因此，通过本发明提供非酒精性脂肪肝病的有效信息，可以有效地用于预防或治疗相应的疾病。
附图说明
88.图1a至图1l是比较肠道菌群的多样性的结果。所有受试者的α和β多样性除以非酒精性脂肪肝病或纤维化严重程度的组织学光谱所得的数值显示在图1a至图1d中，非肥胖型受试者的数值显示在图1e至1h中，肥胖型受试者的数值显示在图1i至图1l中。稀疏曲线是用香农指数生成的，每个样本有12,000个序列。统计分析采用非参数的kruskal-wallis检验执行。根据bray-curtis距离，使用相对otu丰度数据生成nmds图，并使用adonis分析确定统计学显著性。**p《0.01
89.图2a至图2d是根据纤维化的严重程度对特定微生物分类群的差异进行的单变量分析结果。为了更加清晰易懂，显示了13个科和14个属水平的分类群以及它们的相对丰度上限。箱形图显示了第一四分位数和第三四分位数之间的四分位差(iqr)和tukey whiskers。箱中的颜色表示纤维化的严重程度。对于统计学显著性，采用非参数的kruskal-wallis检验。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001
90.图2e至图2h是根据纤维化严重程度对特定微生物分类群的差异进行的多变量分析结果。根据纤维化的严重程度对四种细菌的arcsin根修饰丰度进行年龄、性别和bmi的回归，且标准残差用箱形图表示。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001
91.图2i至图2k是对全部、非肥胖型和肥胖型受试者的特定肠道菌群元素的共表达分析结果。实线(橙色)和虚线(灰色)分别表示正相关和负相关。节点的大小表示细菌的相对数量，颜色表示根据纤维化的严重程度的相关程度。
92.图3a至图3j是主要与肠道菌群有关的粪便代谢物的评价结果。图3a是不同临床环境下的胆汁酸数据图结果，用五种胆汁酸的平均丰度生成堆叠图。在图3b至图3g中，箱形图显示了根据纤维化严重程度和肥胖状态的分层的粪便胆汁酸水平。五种粪便胆汁酸的浓度按纤维化严重程度和肥胖状态进行了分层。在图3h至图3j中，箱形图显示了按纤维化严重程度和肥胖状态分层的最丰富的粪便scfa(乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)。第一四分位数和第三四分位数之间的四分位差(iqr)被描述为tukey whiskers。对于统计学显著性，采用非参数的kruskal-wallis检验。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001
93.图4是非肥胖型(a)受试者和肥胖型(b)受试者的微生物分类群和粪便代谢物成分之间的网络数据图结果。使用sparcc计算，cytoscape描述的科水平菌群元素和粪便代谢物之间的共表达系数。实线(橙色)和虚线(灰色)分别表示正相关和负相关。节点的形状表示本研究中使用的成分(椭圆形：菌群，菱形：粪便胆汁酸，和圆角矩形：scfa)，且颜色表示根据纤维化的严重程度的相关程度。
94.图5a和图5b是预测全部的非肥胖和肥胖型受试者显著纤维化的接收操作特征曲线(roc)。图5a是使用三种选定的细菌(韦荣球菌科、瘤胃球菌科和肠杆菌科)和四种粪便代谢物(cd、cdca、udca和丙酸盐)的组合绘制的roc曲线，用于预测所有非肥胖型受试者和肥
胖型受试者的显著纤维化，并计算了曲线下面积(auc)。图5b是使用两种选定的细菌(巨单胞菌属和瘤胃球菌属)和四种粪代谢物(cd、cdca、udca和丙酸盐)的组合绘制的roc曲线，用于预测所有非肥胖型受试者和肥胖型受试者的显著纤维化，并计算了曲线下面积(auc)。
95.图6是示意性图示，其全面总结了非肥胖型受试者和肥胖型受试者的肠道菌群的差异、微生物和代谢物的变化以及通过代表微生物和代谢物的组合预测纤维化的结果所对应的含量。
96.图7表示按纤维化严重程度分层的研究受试者的组织学分布的图。
97.图8表示非肥胖型患者和肥胖型患者中微生物分类群和代谢指数之间的相关性的图。
98.图9a至9e表示非肥胖型患者和肥胖型患者的微生物分类群和代谢指数之间的相关性的图。
99.图10a至10c表示特定肠道微生物分类群的相对丰度与按肥胖程度分层的属水平的纤维化严重程度之间的关系图。
100.图11表示按肥胖程度分层的放线菌属的相对丰度与tm6sf2(rs58542926)变体之间的关系图。
101.图12a至12d表示特定肠道菌群成分的相对丰度与是否存在糖尿病的关系图。
102.图13a至图13e表示按纤维化严重程度和肥胖程度分层的粪便胆汁酸的相对丰度的图。
具体实施方式
103.下面，提供具体的实例以帮助理解本发明，但以下实例只是说明本发明，显然对于本领域的技术人员来说，在本发明的范围和精神内可以进行各种修改和变型，并且显然这些修改和变型落入所附权利要求书的范围。在以下实施例和比较例中，除非另有说明，表示含量的“％”和“部分”按重量计。
104.以下实验例中的数值以平均值
±
标准差(s.d.)表示，各处理组之间差异的统计学显著性通过单因素方差分析anova使用graph pad prism 4.0(san diego.ca)确定。
105.实验例1
106.1.材料和方法
107.1)实验受试者
108.包含171名经活检证明患有非酒精性脂肪肝病的受试者和31名没有非酒精性脂肪肝病的受试者。当非酒精性脂肪肝病经组织学证实且bmi《25kg/m2时，被归类为非肥胖型非酒精性脂肪肝病组。
109.2)受试者纳入和排除标准
110.受试者从2013年1月至2017年2月长期入选，纳入标准如下：
111.1.至少18岁的成年人，
112.2.超声检查结果证实了肝脏的脂肪浸润，以及
113.3.过去6个月内不明原因的丙氨酸转氨酶(alt)水平升高。
114.另一方面，符合以下任何一项标准的受试者被排除在外：
115.1.乙型或丙型肝炎感染，
116.2.自身免疫性肝炎，原发性胆汁性胆管炎，或原发性硬化性胆管炎，
117.3.胃肠道癌症或肝细胞癌，
118.4.药物引起的脂肪变性或肝损伤，
119.5.威尔逊病或血色素沉着病，
120.6.过度饮酒(男性：》210克/周，女性：》140克/周)，
121.7.前一个月内使用抗生素，
122.8.过去一年内诊断为恶性肿瘤，
123.9.人类免疫缺陷病毒感染，和
124.10.与脂肪代谢障碍或免疫抑制有关的慢性疾病。
125.(a)在评估活供体肝移植期间或(b)在根据影像学研究对怀疑为肝腺瘤或局灶性结节增生的固体肝脏肿块进行表征的肝脏活检期间(koo bk,joo sk,kim d,bae jm,park jh,kim jh,et al.pnpla3和tm6sf2对非酒精性脂肪肝病的组织学严重程度的累加效应(additive effects of pnpla3 and tm6sf2 on the histological severity of non-alcoholic fatty liver disease).j gastroenterol hepatol 2018；33:1277-1285)，非肥胖型对照组和肥胖型对照组包括没有任何怀疑nfald的受试者。
126.3)肝脏组织学
127.肝脏组织学由一位肝脏病理学家使用nash crn组织学评分系统进行评估。根据组织学检查，nafld被定义为存在≥5％的大泡性脂肪变性。根据brunt等人的标准(brunt em,janney cg,di bisceglie am,neuschwander-tetri ba,bacon br.非酒精性脂肪性肝炎：组织学病变的分级和分阶段建议(nonalcoholic steatohepatitis:a proposal for grading and staging the histological lesions).am j gastroenterol 1999；94:2467-2474；brunt em,kleiner de,wilson la,belt p,neuschwander-tetri ba.非酒精性脂肪性肝炎(nafld)活动性评分和nafld的组织病理学诊断：明显的临床病理含义(nonalcoholic fatty liver disease(nafld)activity score and the histopathologic diagnosis in nafld:distinct clinicopathologic meanings).hepatology 2011；53:810-820)，nash的定义基于整体肝损伤模式，肝损伤包括脂肪变性、小叶炎症或肝细胞气球样变性。此外，根据非酒精性脂肪肝病活动评分系统对脂肪变性、肝小叶炎症和肿胀进行评分，并根据kleiner等人(kleiner de,brunt em,van natta m,behling c,contos mj,cummings ow,et al.用于非酒精性脂肪肝病的组织评分系统的设计和验证(design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease).hepatology 2005；41:1313-1321)的标准评估纤维化的严重程度。
128.4)使用16s rrna测序进行菌群分析
129.使用qiaamp dna粪便微型试剂盒(qiagen，hilden，germany)提取粪便样品的dna。使用miseq平台(illumina,san diego,ca,usa)进行16s rrna的v4区测序目标，并且使用qiime管道(v 1.8.0)(caporaso jg,kuczynski j,stombaugh j,bittinger k,bushman fd,costello ek,et al.qiime允许分析高通量群体测序数据(qiime allows analysis of high-throughput community sequencing data).nat methods 2010；7:335-336)对原始测序数据进行额外处理。
130.5)使用gc-fid和q-top系统测量粪便代谢物
131.根据david的方法(caporaso jg,kuczynski j,stombaugh j,bittinger k,bushman fd,costello ek,et al.qiime允许分析高通量群体测序数据(qiime allows analysis of high-throughput community sequencing data).nat methods2010；7:335-336)，使用agilent technologies 7890a gc系统(agilent technologies,santa clara,ca,usa)测量粪便scfa，并且使用q-tof质谱仪(waters micromass technologies,manchester,uk)对胆汁酸特征进行评估。
132.6)生物信息学分析和统计学检验
133.使用graphpad prism软件ver.7.0d(graphpad software,san diego,ca,usa)和kruskal-wallis检验进行统计学比较。对于稀缺曲线，out表由每个样品12,000个序列选择，香农指数由qiime测量。非参数多维缩放(nmds)图用r的vergan包表示(oksanen j,kindt r,legendre p,o'hara b,stevens mhh,oksanen mj,et al.the vegan package.community ecology package 2007；10)，并使用bray-curtis方法测量距离。组间的统计学显著性是用adonis函数估计的。使用菌群数据进行多变量关联分析，其使用线性模型(maaslin)识别与宿主表型相关的特定类群，不受其他元数据影响(morgan xc,tickle tl,sokol h,gevers d,devaney kl,ward dv,et al.炎性肠病的肠道菌群失调和治疗(dysfunction of the gut microbiome in inflammatory bowel disease and treatment).genome biol 2012；13:r79)。此外，年龄、性别和bmi或糖尿病被指定为固定变量，当经benjamini和hochberg的错误发现率(fdr)调整的p值低于0.20时，认为关联率显著。
134.7)通过roc曲线对纤维化的显著性预测
135.为了证明基于微生物群组的生物标志物对纤维化的预测能力，采用了接受者操作特征曲线下面积(auroc)的方法。本实验中确认的三种科水平的细菌、受试者的基本特征(年龄、性别和bmi)和fib-4的相对丰度作为auroc的输入值，在spss ver.25.0(spss inc.,armonk,ny,usa)中使用二元逻辑回归计算它们的因素组合。使用medcalc软件ver.18.2.1(medcalc software bvba,ostend,belgium)通过delong检验进行auroc比较。
136.2.实验结果
137.1)基本特征
138.纳入171名经活检证明为nafld(nafl，n＝88；nash，n＝83)的受试者和31名非nafld受试者，将所有受试者分为两组(非肥胖组，bmi《25；肥胖组，bmi≥25)，并根据nafld或纤维化的组织学光谱，将每个受试者分为三个亚组。在表1和表2中，显示了各组的详细特征(临床、代谢、生化和组织学特征)结果。
139.表1
140.按肥胖状况和nafld组织学光谱分层的研究受试者的基准特征。
[0141][0142]
[0143]
缩略语：bmi，身体质量指数；wc，腰围；ast，天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase)；alt，丙氨酸转氨酶(alanine transaminase)；ggt，γ-谷酰转移酶(gamma-glutamyl transferase)；nas，非酒精性脂肪肝病活动评分；hdl，高密度脂蛋白(glycosylated hemoglobin)；ldl，低密度脂蛋白；ha，透明质酸(gamma-glutamyl transferase)；hba1c，糖化血红蛋白；homa-ir，胰岛素抗性的稳态模型评估；adipo-ir，脂肪组织胰岛素抗性；ffa，游离脂肪酸；hscrp，高强度c反应蛋白；tg，甘油三酯(triglycerides)；fbg，空腹血糖；htn，高血压。数据以平均值
±
sd或n(％)表示。具有不同的上标字母的平均值
±
sd或n(％)表示通过非参数kruskal-wallis检验或卡方检验的显著性差异。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001
[0144]
表2
[0145]
按肥胖状态和纤维化严重程度分层的研究受试者的基准特征。
[0146]
[0147][0148]
由于确认结果，在所有肥胖组和非肥胖组中，患有nash或显著纤维化(f2-4)的受试者具有高水平的天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)和糖尿病标志物。有显著纤维化的受试者具有更高的nafld活动分数，并且在非酒精性脂肪肝病的组织学分类方面显示出更严重的肝脏组织学(表3和图7)。每个纤维化阶段更详细的标准特征，包含已知的nafld相关基因变异，如pnpla3、tm6sf2、mboat7-tmc4和srebf-2，见表4。
[0149]
表3
[0150]
按肥胖状态和纤维化严重程度分层的研究受试者的组织学特征。
[0151][0152]
缩略语：nafld，非酒精性脂肪肝病；nafl，非酒精性脂肪肝；nash，非酒精性脂肪性肝炎；nas，nafld活动分数。日期以平均值
±
sd或n(％)表示。
[0153]
表4
[0154]
按肥胖状态和纤维化阶段分层的研究受试者的基准临床、代谢、组织学和基因特征。
[0155]
[0156]
[0157][0158]
缩略语:bmi，身体质量指数；wc，腰围；sbp，收缩压；dbp，舒张压；ast，天冬氨酸转氨酶；alt，丙氨酸转氨酶；ggt，γ-谷酰转移酶；hba1c，糖化血红蛋白；homa-ir，胰岛素抗性的稳态模型评估；adipo-ir，脂肪组织胰岛素抗性；tg，甘油三酯；fbg，空腹血糖；nafld，非酒精性脂肪肝病；nash，非酒精性脂肪性肝炎；pnpla3，含有马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域的蛋白3；tm6sf2，跨膜6超家族2；mboat7-tmc4，含有膜结合的o-酰基转移酶结构域的7基因和跨膜通道样4基因；srebf-2，固醇调节元件结合转录因子2。数据以平均值
±
sd或n(％)表示。
[0159]
2)根据纤维化严重程度观察菌群的变化
[0160]
根据纤维化的严重程度，在非肥胖型nafld受试者和肥胖型nafld受试者中，菌群的变化显示不同。
[0161]
具体来说，根据nafld的组织学光谱或纤维化严重程度来比较菌群的多样性(图1)。为了比较α多样性，绘制了基于香农度量的稀疏曲线，而基于bray-curtis距离的nmds图则绘制了β多样性。由于确认的结果，在合并的受试者中没有发现按nafld的组织学光谱或纤维化严重程度分层的组间的任何显著变化(图1a至图1d)。
[0162]
根据受试者的bmi状态，将其分为两组。在非肥胖组中，观察到f1和f0之间(p＝0.0074)以及f2-4和f0之间(p＝0.0084)的菌群多样性显著下降(图1e至图1h)。此外，还观察到f0和f2-4之间有明显的聚集(p＝0.038)。在肥胖组中，按非酒精性脂肪肝病的组织学分类或纤维化严重程度分层的组间多样性没有显著变化(图1i至图1l)。
[0163]
该结果表明，与坏死性炎症活动相比，纤维化严重程度与肠道菌群的变化更为相关，基本bmi状态也可能是导致肠道菌群变化的重要因素。
[0164]
3)观察纤维化相关微生物分类群的增殖情况
[0165]
在非肥胖型nafld受试者中，纤维化相关的微生物分类群的增殖表现明显。具体来说，在非肥胖和肥胖受试者中，使用单变量和多变量分析比较了根据纤维化严重程度的特定微生物分类群的差异(图2a至图2d和图2e至图2h)。
[0166]
在单变量分析中，根据非肥型胖受试者的纤维化严重程度，不仅发现在口腔、小肠和大肠中韦荣球菌科逐渐增殖，而且还发现了肠杆菌科。在肥胖受试者中，理研菌科逐渐富集。相反，随着纤维化变得更加严重，瘤胃球菌科的丰度显著减少，这只在非肥胖型受试者中发现。这一结果可以在相关图中得到证实(图8)，肠杆菌科和韦荣球菌科与纤维化严重程
度呈正相关(分别为p＝1.09
×
10-4
，p＝2.44
×
10-3
)，但瘤胃球菌科则呈反相关关系。
[0167]
在属水平上，粪杆菌属(瘤胃球菌科)、瘤胃球菌属(瘤胃球菌科)、粪球菌属(毛螺菌科)和毛螺菌属(毛螺菌科)在显著纤维化组中明显地急剧减少，但肠杆菌科_其他(肠杆菌科)和枸橼酸杆菌属的丰度则根据纤维化严重程度逐渐增加。这种变化只在非肥胖型受试者中观察到。
[0168]
对于多变量分析，使用maaslin对年龄、性别和bmi进行了调整。肠杆菌科是一个丰富的科，与非肥胖型受试者的纤维化严重程度显著相关(p＝0.0108，q＝0.214)(图2e至图2h)。在厚壁菌门中，韦荣球菌科在非肥胖型受试者中的相对丰度与肥胖型受试者相比急剧增加(非肥胖型，p＝0.0002，q＝0.0195)，但瘤胃球菌科的丰度与非肥胖型受试者的纤维化严重程度呈反相关(p＝0.0019，q＝0.0908)。瘤胃球菌科的一个代表属，瘤胃球菌属根据纤维化严重程度也呈显著反相关(p＝0.0009，q＝0.135)(图10a至图10c)。此外，韦荣球菌科和肠杆菌科与非肥胖型受试者的血清游离脂肪酸(ffa)水平呈明显的正相关(分别为q＝0.178，q＝0.118)，但在肥胖型受试者中则没有(图9a至图9e)。
[0169]
adipo-ir和糖化血红蛋白(hba1c)也根据韦荣球菌科的丰度呈现正相关(adipo-ir，q＝0.142；hba1c，q＝0.157)。相反，在所有受试者(q＝0.0838)和非肥胖型受试者(q＝0.0838)中，血清ffa水平与瘤胃球菌属的丰度呈反相关，但在肥胖型受试者中则没有(q＝1.00)。
[0170]
为了阐明非肥胖型受试者的这些显著的菌群变化是否与宿主基因效应有关，使用maaslin分析了细菌与pnpl3、tm6sf2、mboat7-tmc4和srebf-2的基因突变之间的关联。然而，没有观察到四种基因突变与三种细菌的显著关联。在非肥胖型受试者中，只有放线菌属富集了tm6sf2(c/t)的次要等位基因(q＝0.169)(图11)。
[0171]
除了年龄、性别和bmi这三个变量外，众所周知的是2型糖尿病(dm)的存在会影响菌群的总体变化(qin j,li y,cai z,li s,zhu j,zhang f,et al.a metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2diabetes.nature 2012；490:55-60)。在对dm进行额外调整后，发现肠杆菌科(p＝0.00197，q＝0.0616)和粪杆菌属(p＝0.00242，q＝0.0707)与所有受试者的dm存在有关(图12a至图12d)。在非肥胖型受试者中，不仅毛螺菌属(p＝5.26
×
10-4，q＝0.0676)的减少，而且在dm受试者中也观察到属于肠杆菌科的克雷伯氏杆菌属(p＝0.00339，q＝0.141)的增殖。
[0172]
为了了解肥胖和非肥胖受试者的微生物成分和肠道菌群网特征之间的相互作用，测量了与纤维化严重程度相关的分类群的共同表达，并显示了相对丰度(图2i至图2k)。
[0173]
结果，在非肥胖受试者中，韦荣球菌科和肠杆菌科与瘤胃球菌科有反相关(分别为rho＝-0.275和-0.333)，普雷沃氏菌科(prevotellaceae)与拟杆菌科(bacteroidaceae)显示反相关(rho＝-0.391)。然而，在肥胖型受试者和所有受试者中没有观察到韦荣球菌科/肠杆菌科与瘤胃球菌科之间的强烈相互作用。特别是，韦荣球菌科与纤维化严重程度的相关性在肥胖型受试者和所有受试者中并不显著，这表明其在非肥胖型受试者的纤维化发展中的具体作用。
[0174]
总之，根据纤维化严重程度的特定分类群的增殖在非肥胖组中比肥胖组更明显。
[0175]
4)根据非肥胖和肥胖下nafld受试者的纤维化严重程度观察粪便代谢物水平
[0176]
根据纤维化严重程度，非肥胖型和肥胖型nafld受试者的粪便代谢物水平不同。具
体来说，对主要与肠道菌群有关的粪便代谢物进行了评估。
[0177]
非肥胖型受试者和肥胖型受试者之间的总胆汁酸池的组成是不同的，根据纤维化阶段的增加，非肥胖型受试者的初级胆汁酸水平增加(图3a)。
[0178]
有明显纤维化的非肥胖型受试者(f2-4)的总粪便总胆汁酸水平是没有纤维化的非肥胖型受试者(f0)的3倍(图3b至图3g)。特别是，随着根据非肥胖型受试者的纤维化严重程度增加，胆酸(ca)、鹅去氧胆酸(cdca)和熊去氧胆酸(udca)的水平也随之增加(图3b至图3g和图13a至13e)。在有明显纤维化的肥胖型受试者中，石胆酸(lca)和去氧胆酸(dca)水平明显偏高，只有石胆酸在百分比显示后有明显改善。
[0179]
在三种scfa中，非肥胖受试者的粪便丙酸盐水平随着纤维化变得严重而逐渐升高(非肥胖；p＝0.0032，肥胖；p＝0.7979)，并与被称为丙酸盐生产菌的韦荣球菌科的数量呈现明显的正相关(p＝0.0155)(图3h至图3j)。
[0180]
与胆汁酸特征相反，只在非肥胖受试者中观察到粪便scfa的显著变化与其细菌分类群之间的相关性(图4b)。已知的瘤胃球菌属(p＝0.0189)、颤螺菌属(p＝1.57
×
10-4)和脱硫弧菌属(p＝9.76
×
10-4)作为scfa产生的细菌，与粪便丙酸盐水平呈反相关。在所有非肥胖和肥胖型受试者中，没有发现根据纤维化严重程度的粪便丁酸盐水平的变化，减少瘤胃球菌科并不影响粪便丁酸盐水平(非肥胖型，p＝0.597；肥胖型，p＝0.109)。
[0181]
5)非肥胖和肥胖型nafld中细菌分类群-代谢物网模式的观察
[0182]
细菌分类群-代谢物网在非肥胖和肥胖型nafld中显示出独特的模式。具体来说，当根据纤维化的严重程度和肥胖状态来比较肠道菌群的元素时，只在非肥胖型受试者中观察到菌群的明显变化。为了研究其核心原因，我们进行了非酒精性脂肪肝病相关的遗传变体和肠道代谢物分析。
[0183]
根据分析结果，评估了分类群和代谢物的共同表达，其相互作用网如图4所示。在所有非肥胖和肥胖型受试者中都观察到了胆汁酸之间的强烈相互作用。然而，根据纤维化的严重程度，细菌分类群和代谢物的共同表达模式在非肥胖型受试者和肥胖型受试者中是不同的。非肥胖型受试者比肥胖型受试者显示出更显著的共表达模式。
[0184]
有趣的是，在所有非肥胖和肥胖型受试者中，初级胆汁酸与被称为健康肠道指数的瘤胃球菌科和理研菌科呈反相关。韦荣球菌科与丙酸盐以及初级胆汁酸表现出正相关。胆汁酸通常有调节易感细菌的生长或增殖相对抗性的细菌而与肥胖状态无关的潜力。然而，在非肥胖型非酒精性脂肪肝病受试者中，肠道细菌分类群和粪便代谢物与严重纤维化的相关性比肥胖型受试者更显著。
[0185]
6)通过菌群和代谢物组合对非肥胖型受试者的nafld预测
[0186]
菌群-代谢物组合准确地预测了非肥胖型nafld受试者的显著纤维化。具体来说，为了评估肠道菌群和相关粪便代谢物作为预测纤维化的生物标志物的有用性，比较了预测显著纤维化的auroc(图5a和图5b)。
[0187]
肠杆菌科、韦荣球菌科和瘤胃球菌科被选为最具代表性的、与纤维化显著相关的细菌分类群。如图5a所示，预测显著纤维化的组合的细菌标志物在非肥胖型受试者中产生了0.824的auroc(所有受试者为0.661；肥胖型受试者为0.584)。
[0188]
此外，属于韦荣球菌科的巨单胞菌属和属于瘤胃球菌科的瘤胃球菌属被选择。如图5b所示，预测显著纤维化的auroc产生为0.718(所有受试者为0.673；肥胖型受试者为
0.648)。
[0189]
作为纤维化相关的代谢物，选择了四种粪便代谢物(胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和丙酸盐)，这四种代谢物的组合预测非肥胖型受试者的下周纤维化的auroc为0.758(所有受试者为0.505；肥胖型受试者为0.520)。
[0190]
如图5a所示，在科水平，将肠道代谢物添加到细菌标志物中时，预测能力明显增强，auroc提高到0.977(所有受试者为0.786；肥胖型受试者为0.609)。此外，如图5b所示，在属水平，将肠道代谢物加入细菌标志物时，其预测能力得到了提高，auroc为0.955(所有受试者为0.590；肥胖型受试者为0.636)。这种新型菌群-代谢物生物标志物的预测能力显著高于广泛用作nafld的非侵入性生物标志物的fib-4。
[0191]
结果表明，将已确定的肠道细菌分类群和粪便代谢物组合，预测非酒精性脂肪肝病受试者的显著纤维化的诊断准确度在非肥胖受试者中显著高于肥胖型受试者，而且可以证实肥胖型nafld组和非肥胖型nafld组之间的特定细菌分类群和大肠代谢物之间的明显差异。这一结果不仅强调了肠道菌群作为解释非肥胖型非酒精性脂肪肝病发病机制的风险因素的重要性，而且还强调了将新型菌群-代谢物组合作为非肥胖型nafld显著纤维化的非侵入性生物标志物应用于诊断的重要性。