应用人工MHC呈递特异性癌症新抗原的工程化红细胞的制作方法

应用人工mhc呈递特异性癌症新抗原的工程化红细胞
技术领域
1.本公开涉及用于产生红细胞或工程化红细胞的方法，更具体地，涉及具有人工mhc分子的工程化红细胞。


背景技术：

2.人体中有效的抗肿瘤免疫已经与针对癌症新抗原的t细胞的存在相关联，这是一类由肿瘤特异性突变引起的hla结合型肽，并且新近的数据表明，对此类新抗原的识别是影响临床免疫治疗的活性的主要因素。大规模平行全外显子组测序已用于检测肿瘤中的所有突变以预测新抗原。应用新抗原的疫苗接种可以扩大预先存在的新抗原特异性t细胞群并诱导新的癌症特异性t细胞。尽管新抗原已成为抗肿瘤免疫反应的潜在理想靶点，但在临床应用之前仍有许多问题有待回答。
3.t细胞活化需要mhc分子将mhc限制性肽呈递给特定的t细胞受体。缺乏特异性抗原呈递系统是新抗原疫苗接种的问题之一。
4.红细胞(rbcs)是血液中最丰富的细胞类型，占人体细胞总数的四分之一。红细胞具有许多独特的特性，使其成为体内递送天然和合成载荷物质(payload)的有吸引力的工具：循环范围广(红细胞穿行身体的整个血液循环系统)；良好的生物相容性；长循环半衰期(在人体中的寿命约为120天)；较大的表面积与体积比；无细胞核和线粒体(没有蛋白质合成，增殖，突变的能力)。
5.工程化红细胞(erbcs)是将新的治疗剂、免疫调节剂和诊断成像探针引入人体的有吸引力的载体。人红细胞可以从造血干细胞培养产生，但造血干细胞的来源限制了临床应用。
6.发明概述
7.在一个方面，本公开提供了一种生产红细胞(rbc)的方法，其包括：
8.1)从血液样本中收集谱系阴性和cd34阴性细胞(lin-cd34-细胞)，
9.2)扩增该lin-cd34-细胞；和
10.3)诱导扩增的lin-cd34-细胞分化为成熟红细胞。
11.在一些实施方案中，血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血液样本。
12.在一些实施方案中，血液样本是人外周血样本。
13.在一些实施方案中，步骤1)包括从外周血样本中分离外周血单个核细胞(pbmc)和从pbmc中分离lin-cd34-细胞。
14.在一些实施方案中，步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒，从血液样本中去除谱系阳性(lin
+
)细胞。
15.在一些实施方案中，步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养lin-cd34-细胞，其中所述细胞因子组合包括fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)、干细胞因子(scf)、白介素3(il-3)和白介素6(il-6)。
16.在一些实施方案中，细胞因子组合包含50ng/ml人flt3l、50ng/ml人scf、10ng/ml
人il-3和10ng/ml人il-6。
17.在一些实施方案中，造血干细胞扩增培养基是stemspan
tm sfem无血清扩增培养基。
18.在一些实施方案中，步骤2)包括在37℃、5％co2下培养lin-cd34-细胞约2-5天。
19.在一些实施方案中，步骤3)包括：
20.i)培养扩增的lin-cd34-细胞以诱导其分化成红系细胞(erythroid cells)；和
21.ii)培养该红系细胞以诱导去核。
22.在一些实施方案中，步骤i)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的lin-cd34-细胞。
23.在一些实施方案中，与红系发育相关的细胞因子包括il-3和scf。
24.在一些实施方案中，第一分化培养基是含有胎牛血清(fbs)、人血浆、谷氨酰胺、bsa、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素、il-3、epo和scf的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
25.在一些实施方案中，第一分化培养基是含有10-15％fbs、5-10％人血浆、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa、300-600μg/ml人转铁蛋白、8-13μg/ml人胰岛素、2％青霉素-链霉素、3-5ng/ml人il-3、4-7u/ml人epo和100ng/ml人scf的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
26.在一些实施方案中，步骤i)包括在37℃、5％co2下培养扩增的lin-cd34-细胞约9天。
27.在一些实施方案中，步骤ii)包括在第二分化培养基中培养红系细胞，其中所述第二分化培养基与第一分化培养基相比缺少与红系发育相关的细胞因子。
28.在一些实施方案中，第二分化培养基是含有fbs、人血浆、谷氨酰胺、bsa、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素和epo的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
29.在一些实施方案中，第二分化培养基是含有15％fbs、5-10％人血浆、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa、300-600μg/ml人转铁蛋白、8-13μg/ml人胰岛素、2％青霉素-链霉素和1-5u/ml人epo的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
30.在一些实施方案中，步骤ii)包括在37℃、5％co2下培养红系细胞约7天。
31.在另一方面，本公开提供通过上述方法产生的红细胞。
32.在另一方面，本公开提供用于产生工程化红细胞(erbcs)的方法，其包括：
33.1)从血液样本或骨髓样本中收集谱系阴性细胞(lin-细胞)；
34.2)扩增该lin-细胞；
35.3)培养扩增的lin-细胞以诱导其分化成红系细胞；并在分化之前或同时，将外源核酸引入该扩增的lin-细胞；和
36.4)培养该红系细胞以诱导去核。
37.在一些实施方案中，血液样本是外周血样本、脐带血样本或胎儿血液样本。
38.在一些实施方案中，血液样本是人外周血样本。
39.在一些实施方案中，lin-细胞是lin-cd34-细胞。
40.在一些实施方案中，步骤1)包括从外周血样本中分离pbmcs和从pbmcs分离lin-cd34-细胞。
41.在一些实施方案中，步骤1)包括通过使用谱系细胞去除试剂盒，从外周血样本中
去除谱系阳性(lin
+
)细胞。
42.在一些实施方案中，步骤2)包括在补充有细胞因子组合的造血干细胞扩增培养基中培养lin-细胞，其中所述细胞因子组合包括flt3l、scf、il-3和il-6。
43.在一些实施方案中，造血干细胞扩增培养基是stemspan
tm sfem无血清扩增培养基。
44.在一些实施方案中，步骤2)包括在37℃、5％co2下培养lin-细胞约2-5天。
45.在一些实施方案中，步骤3)包括在补充有与红系发育相关的细胞因子的第一分化培养基中培养扩增的lin-细胞。
46.在一些实施方案中，与红系发育相关的细胞因子包括il-3和scf。
47.在一些实施方案中，第一分化培养基是含有fbs、人血浆、谷氨酰胺、bsa、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素、il-3、epo和scf的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
48.在一些实施方案中，第一分化培养基是含有10-15％fbs、5-10％人血浆、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa、300-600μg/ml人转铁蛋白、8-13μg/ml人胰岛素、2％青霉素-链霉素、3-5ng/ml人il-3、4-7u/ml人epo和100ng/ml人scf的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
49.在一些实施方案中，步骤3)包括在37℃、5％co2下培养扩增的lin-细胞约9天。
50.在一些实施方案中，步骤4)包括在第二分化培养基中培养该红系细胞，其中所述第二分化培养基与第一分化培养基相比缺少与红系发育相关的细胞因子。
51.在一些实施方案中，第二分化培养基是含有fbs、人血浆、谷氨酰胺、bsa、转铁蛋白、胰岛素、青霉素-链霉素和epo的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
52.在一些实施方案中，第二分化培养基是含有15％fbs、5-10％人血浆、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa、300-600μg/ml人转铁蛋白、8-13μg/ml人胰岛素、2％青霉素-链霉素和1-5u/ml人epo的iscove改良dulbecco培养基(imdm)。
53.在一些实施方案中，步骤4)包括在37℃、5％co2下培养红系细胞约7天。
54.在一些实施方案中，在步骤3)中，在第一分化培养基中培养扩增的lin-细胞的第一天，将外源核酸引入到该扩增的lin-细胞中。
55.在一些实施方案中，外源核酸是携带旨在于扩增的lin-细胞中表达的目的基因的表达载体。
56.在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
57.在一些实施方案中，目的基因编码融合蛋白。
58.在一些实施方案中，融合蛋白是包含锚定部分的细胞表面膜蛋白，其中所述锚定部分至少含有cd235a的跨膜区。
59.在一些实施方案中，融合蛋白包含人工mhc单链分子，且从n端到c端包含抗原肽、第一肽接头、β2-微球蛋白、第二肽接头和缺少跨膜区和胞质区的mhc i类分子重链。
60.在一些实施方案中，人工mhc单链分子在其c端与锚定部分的n端融合，任选地通过第三肽接头融合。
61.在一些实施方案中，融合蛋白还包含选自β2-微球蛋白信号肽、cd235a信号肽或其组合的信号肽。
62.在一些实施方案中，第一肽接头和第二肽接头富含gly和ser。
63.在一些实施方案中，抗原肽与病症相关，并且当由mhc i类分子呈递时能够激活
cd8
+
t细胞。
64.在一些实施方案中，抗原肽是癌症新抗原、或源自癌蛋白或病毒蛋白。
65.在一些实施方案中，抗原肽的长度为8、9、10或11个氨基酸。
66.在另一方面，本公开提供通过上述方法产生的erbcs。
67.在另一方面，本公开提供包含融合蛋白的erbcs，该融合蛋白从n端到c端包含抗原肽、第一肽接头、β2-微球蛋白、第二肽接头、缺少跨膜区和胞质区的mhc i类分子重链、第三肽接头和锚定部分，其中所述抗原肽与病症相关，并且当由mhc i类分子呈递时能够激活cd8
+
t细胞，并且其中所述锚定部分至少包含cd235a的跨膜区。
68.在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本公开的erbcs和生理学上可接受的赋形剂。
69.在另一方面，本公开提供，本公开的erbcs在制备治疗与抗原肽相关的病症的药物中的用途。
70.在另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者中与抗原肽相关的病症的方法，其包括：
71.a)从受试者采集血液样本或骨髓样本，
72.b)使用本公开的方法产生erbcs和
73.c)将治疗有效量的erbcs输注给受试者。
74.在一些实施方案中，抗原肽是hpv e6或e7蛋白的片段。
75.在另一方面，本公开提供包含具有seq id no:2或4序列的肽的鼠erbcs。
76.附图简述
77.图1：人工erbcs抗原呈递系统的设计。
78.(a)人工erbcs抗原呈递系统利用工程化红细胞表达嵌合mhc i类分子，该分子与特异性新抗原肽连接并与红系细胞膜蛋白如cd235a或其他蛋白融合。这些工程化的erbcs可以将新抗原呈递给新抗原特异性记忆t细胞并激活该t细胞的功能。
79.(b)ot-1肽-微球蛋白-mhc-cd235a构建体的构建(上图和中图)和提议的构象(下图)(其核酸序列和氨基酸序列显示在seq id no：1-4中)。设计的嵌合mhc分子由膜定位信号肽(上图：b2m信号肽；中图：与b2m信号肽连接的cd235a信号肽)、通过甘氨酸/丝氨酸接头连接的用于t细胞识别的特异性肽(如新抗原)、β2-微球蛋白和mhc重链区组成。由于所述mhc重链缺少跨膜结构域，因此，cd235a融合确保该蛋白质复合物转移到细胞膜。(ot-1：卵清蛋白肽残基257-264(ova257-264)；b2m，β-2微球蛋白；pep，肽；t2a，2a自切割肽；copgfp，从桡足动物pontellina plumata克隆的绿色荧光蛋白；β：使用β2-微球蛋白信号肽；αβ：使用cd235a和β2-微球蛋白信号肽)。
80.(c)erbc治疗的工作流程。从个体采集外周血样本。分离lin-cd34
+
hscs或lin-cd34-pbmcs，用编码嵌合mhc抗原呈递分子的慢病毒转导。转导的hscs或pbmcs在诱导红系增殖和分化的条件下培养。终末分化(去核)的erbcs被回输给患者用于治疗目的。
81.图2.表达嵌合mhc分子的erbcs的生成和表征。
82.(a)显示lin-cd34-pbmcs转导效率的显微图像。在第5天用慢病毒载体转导lin-cd34-pbmcs，所述慢病毒载体编码单独的mscv启动子(对照)或编码mscv-mhc-i ot1β。在转导后48小时检查病毒感染效率。gfp信号指示阳性转导的细胞。在用mscv-mhc-i ot1αβ转导
的lin-cd34
+
hscs、用mscv-mhc-i ot1β转导的lin-cd34
+
hsc、用mscv-mhc-i ot1αβ转导的lin-cd34-pbmcs中可以获得类似的结果。
83.(b)细胞增殖试验。在红系培养期间，每三天使用invitrogen countess ii评估一次有或没有慢病毒转导的lin-pbmc的细胞数。
84.(c)红系分化分析。流式细胞术用于在红系培养期间每两天检查一次细胞表面标志物的表达水平，以指示红系分化进展。用针对人cd235a、cd71和cd117的抗体对细胞进行染色。
85.(d)红系培养结束时erbcs的去核分析。dna染料hoechst 33342用于染色dna。去核的erbcs染色为cd235a阳性和hoechst 33342阴性。约80％的去核erbcs呈gfp阳性，表明工程化蛋白直至终末分化和去核阶段仍保持表达。
86.(e)联苯胺-吉姆萨染色显示培养第21天erbcs的细胞形态。
87.图3：表达嵌合mhc分子的erbcs的体内分布。erbcs来源于用mscv-mhc-i ot1β转导的lin-cd34-pbmc。用dir预染色的1
×
108erbcs，静脉内注射到负荷mc38肿瘤的nsg小鼠中。在erbcs注射后7天进行体内荧光成像分析。(左图)：1只小鼠的腹、背和侧的代表性活体成像图。(右图)：各器官的erbcs分布。在用mscv-mhc-i ot1αβ转导的lin-cd34
+
hscs、用mscv-mhc-i ot1β转导的lin-cd34
+
hscs、用mscv-mhc-i ot1αβ转导的lin-cd34-pbmcs中，可以获得类似的结果。
88.图4：erbcs的体外抗原呈递能力评价
89.(a)体外t细胞活化的实验方案。从e13.5-14.5胎肝中分离出小鼠红系祖细胞(bfu-es/cfu-es)。这些小鼠红系祖细胞用编码mscv-mhc iαβot1的慢病毒转导，并诱导分化为erbcs-mhc iαβot1。自ot1小鼠(c57bl/6-tg(tcratcrb)1100mjb/j；该小鼠的cd8
+
t细胞主要识别通过mhc i呈递的ova
257-264
)，分离cd8
+
t细胞。将erbcs-mhc iαβot1和ot1小鼠的cd8
+
t细胞共培养2天，通过facs分析两种cd8
+
t细胞活化标志物，即cd107a(b)和cd44(c)。(d)ot1 cd8
+
t细胞单独(左上)或ot1 cd8
+
t细胞和erbcs共培养物在明视场显微镜下的形态。白色箭头：活化的t细胞簇。erbc:cd8
+
t细胞的细胞数比＝1:10。
90.发明详述
91.除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所述相似或等同的任何方法、装置和材料都可以用于实施本发明。提供以下定义是为了便于理解本文中频繁使用的某些术语，并不旨在限制本公开的范围。
92.冠词“a”和“an”在本文中用于指，一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。举例来说，“an”元素是指一个元素或多于一个元素。
93.如本文所用，术语“谱系阴性细胞”或“lin-细胞”是指，基本上无谱系标志物的细胞。谱系标志物是细胞谱系的特征。示例性谱系标志物是cd1c、cd3、cd11c、cd14、cd15、cd16、cd20、cd41、cd56、cd203c、cd235a和/或bdca2。事实上，谱系阴性细胞基本上不被谱系抗体染色。谱系阴性细胞包括干细胞和祖细胞。因此，谱系阴性细胞也显示出干细胞和祖细胞活性。可以通过富集基本上不含谱系标志物的血细胞群，来纯化lin阴性细胞或富含谱系阴性细胞的血细胞群。例如，谱系阴性细胞可以通过去除选自以下的至少一个谱系标志物呈阳性的细胞来纯化：cd1c、cd3、cd11c、cd14、cd15、cd16、cd20、cd41、cd56、cd203c、cd235a、和/或bdca2。在某些情况下，可以使用谱系细胞去除试剂盒进行纯化。相反，谱系阳
性(lin
+
)细胞是表达成熟细胞谱系标志物的所有细胞的混合物。谱系阳性细胞的例子包括t细胞、b细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、红系细胞和它们的定向前体细胞。
94.如本文所用，术语“抗原肽”是指，能够与mhc分子(尤其是mhc i类分子)的肽结合结构域结合、从而与mhc分子形成mhc复合物的肽。如本领域熟知，在apc表面上抗原肽在mhc复合物中的呈递通常不涉及例如完整蛋白质。相反，位于结合结构域中的抗原肽典型地是完整蛋白质的小片段。在一些实施方案中，抗原肽来源于病原体蛋白，例如病毒蛋白。在一些实施方案中，抗原肽是癌症新抗原。
95.如本文所用，术语“人工mhc单链分子”或“人工mhc”是指，包含抗原肽、β2微球蛋白和mhc i类分子重链的融合蛋白。这种融合蛋白在一些文献中也被称为“单链三聚体”。通常，在抗原肽和β-2微球蛋白之间存在肽接头，在β-2微球蛋白和mhc i类分子重链之间存在肽接头。因此，人工mhc单链分子可以从n端到c端包含抗原肽、第一肽接头、β-2微球蛋白、第二肽接头和mhc i类分子重链。在一些方案中，人工mhc单链分子还可在n端包含信号肽。在一些方案中，人工mhc单链分子中的mhc i类分子重链部分是截短形式，缺少跨膜区和胞质区。在本公开的一些实施方案中，人工mhc单链分子在c端融合至cd235a分子或其至少包含跨膜区的片段。在这种方案中，一旦在宿主细胞(例如，lin-cd34-pbmcs)中表达，人工mhc单链分子可以通过cd235a分子或其片段锚定到细胞膜上。
96.如本文所用，术语“培养”是指，将细胞在培养基中保持任何一段时间，无论有无细胞扩增或分化。
97.如本文所用，术语“分化”是指，特化程度较低的细胞(例如干细胞)发育或成熟以具有更独特的形式和功能并同时伴随潜力丧失的过程。可通过在本领域已知的特定条件或特定培养基中培养细胞，将特化程度较低的细胞分化成特化程度较高的细胞。
98.如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指，药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、载体、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁)、溶剂或包封材料，其参与携带或运输治疗化合物以施用于受试者。在与制剂的其他成分相容且对受试者无害的意义上，每种赋形剂应该是“可接受的”。
99.cd235a，也称为“血型糖蛋白a”，是一种在成熟红细胞和红系前体细胞中表达的单次跨膜糖蛋白，是红细胞表面的特异性标志物蛋白。cd235a的表达指示细胞分化成红系细胞。
100.cd117，也称为“c-kit”，是一种在造血干细胞和其他细胞表面表达的scf干细胞生长因子受体。scf在调节细胞存活和增殖、造血、干细胞维持、细胞发育、迁移和功能方面发挥着重要作用。
101.cd71，也称为“转铁蛋白受体1”，是由两个二硫键连接的两个单体组成的跨膜糖蛋白。每个单体都与完整的转铁蛋白分子结合，产生铁-转铁蛋白-转铁蛋白受体复合物，该复合物通过内吞作用进入细胞，用于在红系发育过程中产生细胞血红蛋白。
102.在本研究中，我们产生了一系列新方法，利用谱系阴性cd34阴性外周血单个核细胞(lin-cd34-pbmcs)或谱系阴性cd34阳性造血干细胞(lin-cd34
+
hscs)来诱导红系细胞增殖和分化，从而为erbcs治疗奠定了基础。通过慢病毒转导，将编码与各种工程化蛋白融合的细胞表面蛋白的基因，引入这些造血干细胞和祖细胞。然后在诱导红系分化和去核的条件下培养细胞。这些携带表达的治疗蛋白的去核网织红细胞或rbcs可作为长期药物载体用
于各种治疗目的。
103.经典抗原呈递利用apc来展示抗原肽。抗原的获得等同于产生有错误的蛋白质，其是由非同义突变引起的蛋白质突变。因此，为了生成个性化的erbc-抗原呈递系统，我们进行了全外显子组测序(wes)和rna-seq来识别和预测肿瘤特异性新抗原。为了生成抗原呈递系统，mhc分子是必需的组分；因此，我们设计了一种人工mhc，它是由新抗原肽、β2微球蛋白和mhc i类分子重链组成的单链单元(图1b)。这种由新抗原肽-β2-微球蛋白-mhc i单链组成的重组肽，可以被肽特异性t细胞识别(图1a)。在正常情况下，当网织红细胞分化为成熟的红细胞时，mhc分子将被去除。为了避免在分化过程中mhc分子的去除，我们选择将含有mhc的工程化肽与成熟红细胞表面膜蛋白cd235a融合。这意味着，在我们的系统中，只有该特定的新抗原才能呈递在表面上，这一特性将大大提高t细胞识别和激活的效率。
104.一些出版物已经证明，成熟红细胞可以从源自造血干细胞(lin-cd34
+
hscs)的早期红系祖细胞以不同的效率分化。
105.实施例1.从lin-cd34-pbmcs或lin-cd34
+
hscs制备和表征rbcs或erbcs
106.慢病毒载体构建
107.基因合成以获得设计的mhc i ot1基因。在慢病毒载体mscv上构建这些序列，得到序列载体mscv-mhc-i ot1αβ或mscv-mhc-i ot1β用于病毒包装。
108.病毒包装
109.病毒包装采用mhc-i ot1:pspax2:vsvg＝2:1:1比例包装。以6孔板为例。根据mhc-i ot1：pspax2：vsvg＝2μg:1μg:1μg，使用磷酸钙转染方法。将质粒转染到hek 293t细胞中进行病毒包装。转染12小时后，换液除去磷酸钙，在48小时和72小时收集上清液，用0.45μm滤器过滤细胞培养上清液。
110.病毒浓缩
111.将收集和过滤的细胞培养上清液，在4℃的温度以70000rcf的速度进行超速离心和浓缩2小时。离心后移出上清，用分化1期培养基重悬沉淀，用elisa定量病毒滴度，-80℃保存。
112.lin-cd34-pbmcs分离
113.从人外周血中分离lin-cd34-pbmcs。全血用磷酸盐缓冲液1:1稀释，使用淋巴细胞分离溶液(lymphoprep
tm
,stemcell technologies)和淋巴细胞分离管，以1200
×
g离心15分钟，分离外周血单个核细胞(pbmcs)。
114.该步骤的目的是通过淋巴细胞分离液实现细胞成分的密度梯度离心，将pbmcs从红细胞、血小板等不同细胞中分离出来，以保证lin-cd34-细胞的后续富集。使用人类谱系细胞去除套盒(bd biosciences)分离lin-cd34-细胞。
115.lin-cd34
+
hscs分离
116.全血用磷酸盐缓冲液1:1稀释，使用淋巴细胞分离溶液(lymphopreptm，stemcell technologies)在淋巴细胞分离管中以1200
×
g离心15分钟，分离预富集hsc。
117.此步骤的目的是通过淋巴细胞分离溶液实现细胞成分的密度梯度离心，将预富集hscs与红细胞和血小板等其他细胞类型分离，以确保lin-cd34
+
hscs的后续富集。应用easysep
tm
人脐带血cd34阳性选择试剂盒ii(stemcell technologies)，从预富集hsc中分离cd34
+
hscs。将cd34
+
细胞与生物素标记的针对谱系特异性抗原的抗体一起孵育。去除具有特
异性谱系标志物的cd34
+
细胞，并使用与链霉亲和素缀合的磁珠，通过负向选择，获得lin-cd34
+
hscs。
118.从小鼠胚胎纯化胎肝红系祖细胞
119.1.设置定时交配，以获得妊娠13.5-14.5天的雌性小鼠。
120.2.冰上从各单个胚胎中分离胎肝细胞(flc)并放入1ml pbs中。
121.3.用移液器上下吹吸，得到单细胞悬液，并通过25μm滤器(bd falcon 35-2235)。用1ml pbs冲洗筛网。合并穿流液(每个胚胎1ml)。
122.4.以1.5k rpm离心5分钟沉淀细胞，用红细胞裂解缓冲液(来自stemcell的氯化铵溶液)重悬，并在冰上放置10分钟。
123.5.以1.5k rpm离心5分钟沉淀细胞，去除裂解缓冲液，并用10ml pbs-2％fbs重悬。
124.6.以50μl/小鼠，加入chrompure大鼠igg(jackson immunoresearch,#012-000-003)，4℃孵育5分钟，计数细胞(小孔
×
25
×
104＝细胞数/ml)。
125.7.加入1μl/1
×
106个细胞的生物素化抗小鼠ter119(bd pharmingen，#553672)，4℃孵育15分钟。
126.8.将ms lineage panel(fisher scientific(thermo fisher scientific)#bdb559971)加入细胞中(2μl/1
×
106个细胞)，4℃孵育15分钟。
127.9.用10倍体积的pbs洗涤一次，并在4℃以1.5k rpm离心细胞5分钟。
128.10.加入streptavidin particles plus-dm(磁珠)(bd pharmigen,#557812)(5μl/1
×
106个细胞)，4℃孵育30分钟。
129.11.在磁性支架上准备2-4个facs管，两侧配对。
130.12.在每管中分装2ml细胞(共4ml)，小心地将细胞从管中取出并放入另一侧的另一管中，避免破坏磁性粘附的珠。重复相同的步骤，将ter119阴性和谱系阴性细胞转移到新试管中。
131.13.计数活细胞并浓缩细胞，用50-100μl pbs(2％fbs)重悬细胞。
132.慢病毒转导lin-cd34
+
hscs或lin-cd34-pbmcs
133.在扩增5天后，使用mscv-mhc-i ot1病毒，转导lin-cd34
+
hscs或lin-cd34-pbmcs。使用分化1期培养基以1
×
106的密度重新悬浮细胞。计算感染体积和病毒剂量。根据终浓度5
×
107tu/ml至5
×
108tu/ml，计算病毒用量；根据感染体积，以10μg/ml，将混合物与polybrene在浓缩的病毒溶液中孵育5分钟。将孵育后的浓缩病毒溶液添加到细胞中并混合。使用水平转子离心机，以500
×
g的速度、32℃的温度和90分钟的时间，进行离心感染。离心后，细胞在37℃，5％co2下培养。两天后，在荧光显微镜下检测病毒感染效率。gfp阳性细胞的百分比指示阳性转导的细胞。
134.erbcs培养
135.在第0天培养分离的lin-cd34-或lin-cd34
+
细胞，将细胞培养在造血干细胞扩增培养基(stemspan
tm sfem，stemcell technologies)中，并加入细胞因子组合和青霉素-链霉素(gibco)。细胞在37℃、5％co2下培养。在这些培养条件下培养至第5天。
136.此步骤的目的是在stemspan
tm sfem无血清扩增培养基中加入细胞因子组合，以在诱导红系分化前扩增和维持lin-cd34-或lin-cd34
+
细胞。细胞因子组合包含50ng/ml重组人fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)、50ng/ml重组人干细胞因子(scf)、10ng/ml重组人白介素3
(il-3)、10ng/ml重组人白介素6(il-6)等。
137.第5天更换培养系统，培养基更换为分化1期培养基，所述培养基由以下成分组成：imdm(iscove改良dulbecco培养基，sigma-aldrich)、10-15％胎牛血清(fbs，gibco)、5-10％人血浆(plasma)、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa(牛血清白蛋白)、300-600μg/ml人转铁蛋白(holo human transferrin，sigma-aldrich)、8-13μg/ml重组人胰岛素(sigma-aldrich)、2％青霉素-链霉素(gibco)、3-5ng/ml重组人白介素iii(rhil-3,peprotech)、4-7u/ml重组人红细胞生成素(rhepo,amgen)、100ng/ml重组人干细胞因子(rhscf，peprotech)。细胞在37℃、5％co2下培养。在这些培养条件下培养至第14天。该实验程序的目的是，在有足够的红系相关细胞因子的条件下，诱导lin-cd34-或lin-cd34
+
细胞分化为红系细胞并实现实质性扩增。在该培养体系中，仅提供与红系发育相关的细胞因子，并确保细胞增殖和分化为红系细胞。同时，病毒感染发生在分化最快的阶段，从而确保靶基因插入并在细胞膜上表达。
138.第14天更换培养体系，培养基更换成由imdm(iscove改良dulbecco培养基，sigma-aldrich)、15％胎牛血清(fbs，gibco)、5-10％人血浆(plasma)、1-4mm谷氨酰胺、1-2％bsa、300-600μg/ml人转铁蛋白(sigma-aldrich)、8-13μg/ml重组人胰岛素(sigma-aldrich)、2％青霉素-链霉素(gibco)，1-5u/ml重组人红细胞生成素(rhepo，amgen)组成的分化2期培养基。细胞在37℃、5％co2下培养。在这些培养条件下培养至第21天。该实验程序的目的是，减少或去除在之前的培养系统条件下使用的一些细胞因子，以促进去核，这是红细胞成熟的最后一步。
139.联苯胺-吉姆萨染色
140.1.在cytospin后，用-20℃甲醇在rt固定细胞2分钟。
141.2.用水清洗并风干。(载玻片可以储存在rt以备后面染色。)
142.3.《制备联苯胺染色液》将1片联苯胺片(sigma#d5905)用10ml pbs溶解，加入10μl h2o2，用注射器过滤。
143.4.用300-500μl联苯胺溶液覆盖细胞点。rt孵育1小时。
144.5.用水清洗。
145.6.《吉姆萨染色》用水1:20稀释吉姆萨染色剂(sigma#gs500)。
146.7.rt染色35-40分钟。
147.8.用水清洗并风干。
148.9.封片。
149.10.显微成像。
150.流式细胞仪
151.在200μl测定系统中，用小鼠抗人cd235a apc抗体(bd biosciences)1μl、小鼠抗人cd71 percp cy5.5抗体(biolegend)1μl、小鼠抗人cd117 pe cy7抗体(ebioscisence)1μl、hoechst 33342(thermofisher)0.25μl，染色细胞。在cytoflex lx平台(beckman coulter)上进行数据采集。使用flowjo软件分析结果。
152.试剂
153.重组人fms样酪氨酸激酶3配体(rhflt3l)：fms样酪氨酸激酶3配体(flt-3配体)，又称fl、flt3l和flt3lg，可促进hscs分化为各种造血谱系细胞。flt3lg在结构上与干细胞
因子(scf)和集落刺激因子1(csf-1)同源。flt3lg通过活化造血祖细胞，增加细胞数量。
154.重组人干细胞因子(rhscf)：kit配体(kitlg)，也称为干细胞因子(scf)，属于scf家族的i型跨膜糖蛋白。kitlg是受体型蛋白酪氨酸激酶kit的配体。scf在调节细胞存活和增殖、造血、干细胞维持、细胞发育、迁移和功能方面,发挥着重要作用。
155.重组人白介素3(rhil-3)：是一种糖蛋白，属于造血生长因子家族，在临床前体外和体内研究中表现出多谱系活性。造血祖细胞在il-3蛋白的帮助下可增殖和分化为成熟的红细胞、肥大细胞、巨核细胞和粒细胞。
156.重组人白介素6(rhil-6)：是一种多功能细胞因子，可调节免疫反应、造血功能、急性期反应和炎症反应。与il-3协同促进造血细胞增殖。
157.重组人红细胞生成素(rhepo)：是一种主要的红细胞生成素，可与多种其他生长因子(il-3、il-6、糖皮质激素和scf)相互作用，由此从多能祖细胞发展出红系谱系。红系爆式形成单位(bfu-e)细胞开始表达红细胞生成素受体并对红细胞生成素敏感。它是一种重要的红系造血细胞因子。
158.holo人转铁蛋白：是血浆中的主要铁蛋白，与铁离子形成复合物，用于在红细胞中血红蛋白的产生。
159.hoechst33342：是一种用于染色dna的荧光染料。该染料可以穿过细胞膜与dna结合。
160.结果
161.我们严格进行了一系列实验来表征红细胞增殖/分化的效率和erbc的功能。lin-cd34
+
hsc或lin-cd34-pbmc用编码mhc i ot1αβ/mhc i ot1β基因的慢病毒转导。95％以上的细胞被阳性转导(由gfp信号指示，图2a)。我们发现，工程化lin-cd34
+
hsc或lin-cd34-pbmc不会影响细胞在21天红系培养期间的增殖和分化(图2b-d)。在培养结束时，大多数的成熟erbcs仍然表达该工程化的蛋白质。此外，转导不改变去核效率和erbc的形态(图2d和2e)。
162.流式细胞术分析表明，细胞在sfem(无血清扩增培养基)(扩增)阶段不表达cd235a，而细胞在分化阶段开始表达cd235a，且cd235a阳性细胞随着分化的进展而增加。接近分化后期(dif2)，几乎所有细胞都表达cd235a，表明几乎所有细胞都是红系细胞。这说明，我们的分化系统在体外高效地诱导了红系分化。
163.cd117(scf受体)表达水平的变化反映红系分化过程中scf的差异利用。scf在调节干细胞存活、维持和增殖方面至关重要。cd117在sfem条件下不表达，但cd117水平在分化早期(dif1)迅速升高，然后在分化后期降低。
164.cd71是转铁蛋白受体，其表达对红系细胞功能至关重要。cd71在sfem条件下不在lin-细胞中表达，但cd71的水平在分化早期迅速上升，以保证血红蛋白的充分合成。然后在分化后期cd71水平下降。在体外红系培养期间转导的lin-pbmc的细胞表面标志物表达谱表明，红系分化正常进行(图2c)。
165.实施例2.小鼠中erbcs的体内组织分布
166.在为临床应用建立细胞治疗时，细胞的体内组织分布是重要的。我们接下来评估了erbc-抗原呈递系统是否表现出任何优先的组织分布位点和动态。我们使用负荷mc38结直肠肿瘤的nsg小鼠作为疾病模型。将mc38细胞接种于皮下部位，1周后将dir预染色的erbcs静脉注射到小鼠体内。在erbcs注射7天后，体内荧光成像显示，除了大脑(可能是由于
血脑屏障)和心脏(可能是由于缺乏毛细血管)之外，erbcs在全身均表现出强信号。erbcs信号在肿瘤组织中更为明显，表明erbcs可以有效地分布到肿瘤组织中，说明呈递抗原的erbcs可以有效地与肿瘤中的局部淋巴细胞相互作用并引发t细胞活化(图3)。
167.实施例3.erbcs体外抗原呈递能力的评估
168.为了评估erbcs系统的抗原呈递能力，我们使用了ot1小鼠，其cd8
+
t细胞主要识别由mhc i分子呈递的ova
257-264
肽。为了概念验证，我们为特定的ova
257-264
(mhc-ot1)肽设计了erbc抗原呈递系统。将erbcs-mhc-ot1和来自ot1小鼠的cd8
+
t细胞共培养表明，erbc-mhc-ot1具有强的特异性t细胞活化功能(图4)。
169.体外实验表明，我们的erbcs系统可以有效地呈递特异性抗原。我们接下来使用肿瘤负荷小鼠设计了体内模型。mc38和ct26是两种具有许多非同义突变的结直肠癌细胞系。对于这些非同义突变，我们预测并设计了特异性新抗原。我们相信，这些抗原可以使用我们的系统呈递，以活化t细胞并促进肿瘤的根除。
170.该系统也适用于人类。例如，hpv e6和e7癌蛋白对于恶性肿瘤的发生和维持是必需的；因此，某些癌细胞不太可能通过突变e6和e7来逃避免疫反应。e6和e7常以高水平组成型表达，并因此可能是开发针对已建立的hpv感染和病变的疫苗的理想靶标。我们为16/18/52/59型hpv的e6/e7蛋白设计了新抗原。此外，活化针对hpv e6/7的特异性t细胞，可能是hpv阳性宫颈癌的潜在治疗策略。
171.在本公开中，我们产生了具有人工嵌合mhc模式的erbcs以呈递特异性抗原来激活t细胞，并且该erbcs抗原呈递系统引发了强t细胞反应。这项技术将使erbcs成为一种新型的抗原呈递细胞，用于调节癌症或免疫疾病中的免疫反应。
172.下面列出本文提及的一些氨基酸序列。
173.mhc i ot1βcd235a核苷酸序列:(seq id no:1)
[0174][0175]
mhc i ot1βcd235a蛋白序列：小鼠β2-微球蛋白信号肽用点式下划线指示，ot-1肽
用实线下划线指示，三个肽接头以粗体显示，小鼠β2-微球蛋白以斜体显示，h2-kb(y84c)重链用双下划线指示，cd235a用波浪下划线指示。(seq id no:2)
[0176][0177][0178]
mhc i ot1αβcd235a核苷酸序列:(seq id no:3)
[0179][0180]
mhc i ot1αβcd235a蛋白序列：cd235a信号肽用短线下划线指示，小鼠β2-微球蛋白信号肽用点式下划线指示，ot-1肽用实线下划线指示，三个肽接头用粗体显示，小鼠β2-微球蛋白以斜体显示，h2-b(y84c)重链用双下划线指示，cd235a用波浪下划线指示。(seq id no:4)
[0181][0181]