新型抗癌肽及其用途

1.本发明涉及可用于治疗癌症的抗癌肽(acps)家族。


背景技术：

2.肿瘤在细胞水平上是异质性的，由一系列不同亚型的癌细胞组成。在这些亚型中，癌症干细胞(cancer stem cells，csc)逐渐被认为是使用现有抗癌药物进行传统药物治疗的主要难点。乳腺癌是世界上第二常见的癌症，主要发生于女性。多项研究表明，乳腺癌干细胞可能对传统抗癌药物产生耐药性，从而存活、自我更新、分化和复发
1-6
。肿瘤干细胞很容易对抗癌药物产生耐药性，而实体瘤的化疗通常会导致患者中耐药肿瘤干细胞的比例显著增加。这可能导致复发和转移的形成。此外，同一患者体内的乳腺肿瘤可能不同，常规抗癌药物可能会失效
7-9
。由于阿霉素等常用抗癌药物对健康组织的毒性通常很高，导致肝脏、肾脏和心脏等器官的急性损伤，因此难以进行高剂量治疗
10-12
。因此，迫切需要开发新的抗癌药物，以提高对癌细胞的选择性，在足以杀死实体瘤中所有巨块型癌症和癌症干细胞的剂量下，使健康组织不受损害。


技术实现要素：

3.在本发明的第一方面，提供了一种用于治疗癌症的药学上可接受的组合物，所述组合物包含一个或多个肽，所述肽的序列包含基序gllxllxlllxaag，其中每个x独立地选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
4.发明人惊奇地发现，符合所要求保护的公式的一系列肽提高了对癌细胞的选择性，在足以杀死实体瘤中所有巨块型癌症和csc的剂量下，使健康组织不受伤害。与许多传统抗癌药物不同，本文开发的成孔膜活性的肽靶向并破坏质膜以杀死癌细胞。这消除了必须将药物运输到细胞质中的复杂性，因此，与传统化疗药物相比，所述肽改善了肿瘤的渗透性。当前要求保护的肽通过选择性地靶向癌细胞的质膜并在其中形成孔来发挥作用，从而通过使其电化学梯度发生短路来杀死细胞。不希望受到理论的约束，我们认为这些肽直接靶向癌细胞膜的脂质成分和化学微环境。因此，由于肿瘤细胞很难改变其脂质成分，肽诱导耐药性的可能性要小得多(类似于细胞很难对洗涤剂产生耐药性)
13-15
。
5.所公开的几种肽具有抗巨块型癌症和csc的纳摩尔活性，与当前批准的抗癌药物(如盐霉素)相当。此外，在目前最好的体外乳腺癌模型之一，即通过将细胞生长成球形团块来模拟真实实体瘤的乳腺球体模型中，本文公开的几种肽对癌细胞表现出优异的活性，同时对正常健康细胞保持较低的毒性。
6.所述肽以l和d型氨基酸形式(后者是体内抗蛋白酶降解稳定性的主要优势)发挥作用，以极低微摩尔浓度(在某些情况下为纳摩尔浓度)选择性地消除二维生长的癌细胞，以及三维(球状)癌细胞培养物。非癌人类乳腺和肾细胞需要3到200倍以上的浓度才会受到伤害。
7.这些肽价格低廉，合成简单，易于修饰和高通量筛选，并为特异性靶向癌细胞提供化学和结构库。
8.当前要求保护的肽是从头设计的，没有已知的天然类似物，通过与现有肽数据库的比较证实了这一点。这类短柔性肽的免疫原性较低，因此适合制药应用。
9.如本文所述，术语“肽”指任何包含通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸的肽，即肽电子等排体。所述肽通常将包含天然存在的氨基酸，但可包括通过自然过程(例如翻译后加工)或通过化学修饰技术修饰的氨基酸序列，这在本领域是众所周知的。这些修饰在基础文本中有很好的描述。所述修饰可以发生在肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应了解，相同类型的修饰可在给定肽中的多个位点以相同或不同程度存在。此外，给定的肽可能包含许多类型的修饰。
10.优选地，所述肽是分离的肽。术语“分离”指将肽从其原始环境中去除。例如，存在于活体动物中的肽未被分离，但从自然系统中的部分或全部共存物质中分离出的相同肽或此类肽的片段是分离的肽。这类肽可以是载体的一部分和/或所述肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这类载体或组合物不是其自然环境的一部分。
11.包含所述肽的药物组合物可用于人类或动物在人类和兽医中的用途，并且通常将包含一种或多种合适的赋形剂。用于治疗用途的可接受赋形剂在药学领域是众所周知的，并在remington's pharmaceutical sciences，mack publishing co.(a.r.gennaro edit.1985)中进行了描述。药物赋形剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践进行选择。所述药物组合物可包括作为赋形剂的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂，或除此之外的赋形剂。
12.可在所述药物组合物中提供防腐剂、稳定剂和染料。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。
13.所述药物组合物还可包含促进耐受的佐剂和/或促进耐受的细胞。促进耐受的佐剂包括il-10、重组霍乱毒素b亚单位(rctb)、toll样受体2的配体，以及调节免疫应答的生物制剂和单克隆抗体，如抗cd3和共刺激阻断剂，它们可以与所述肽共同施用。促进耐受的细胞包括未成熟树突状细胞和经维生素d3(1α,25-二羟基维生素d3)或其类似物处理的树突状细胞。
14.当癌症被“治疗(treated)”时，这意味着癌症的一个或多个临床表现得到改善。这并不意味着癌症的症状已经完全治愈，从而使其不再出现在患者身上，尽管在某些方法中，情况可能是这样。“治疗(treatment)”使得一种或多种癌症症状比治疗前减轻。例如，肿瘤可以缩小或完全根除。
15.本发明的第二方面涉及用于制备治疗癌症的药物的药学上可接受的组合物，所述组合物包含一个或多个肽，所述肽的序列包含基序gllxllxalllxag，其中每个x独立地选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
16.在一个实施方案中，所述肽可包含选自seq id no:1-36中的任一个或其混合物的序列。在另一实施方案中，肽可由seq id no:1-36中任一个的序列组成。
17.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含具有包含基序gllxllelllxaag的序列的肽，其中x选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或
谷氨酸(e)及其混合物。发明人惊奇地发现，具有这种序列的肽对癌细胞有更好的选择性。
18.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含具有包含基序gllxllxalllxag的序列的肽，其中x选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)及其混合物，但其中所述序列不包含seq id no:29或seq id no:33。
19.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含选自seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:14、seq id no:25或seq id no:26的序列及其混合物。更优选地，所述药学上可接受的组合物包含选自seq id no:2、seq id no:4、seq id no:14、seq id no:25或seq id no:26的序列及其混合物。更优选地，所述药学上可接受的组合物包含选自seq id no:25和/或seq id no:26的序列。发明人发现这些序列对癌细胞具有特殊选择性。
20.本发明所述的药学上可接受的组合物可用于治疗任何类型的癌症，例如皮肤癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌、淋巴瘤、肾癌、胰腺癌或子宫内膜癌。然而，在本发明的特定实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
21.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含肽，所述肽还包含基序c端的色氨酸残基(w)。这有助于精确的浓度测定和精确的给药剂量。
22.所述肽的序列或基序的n-和c-末端可以是本领域技术人员已知的任何末端，并且可以包括例如nh2、nh
3+
、cooh和coo-。
23.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含肽，其中所述肽序列包含基序gllxllxlllxaag。
24.在本发明的一个实施方案中，所述组合物用于与化疗剂联合使用。发明人发现，由于当前要求保护的肽的成孔特性，这使得标准化疗药物更容易接近目标癌细胞。所述化疗剂可选自环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、阿霉素、多西紫杉醇、博莱霉素、长春花碱、达卡巴嗪、氮芥、长春新碱、甲基苄肼、强的松龙、足叶乙甙、顺铂、表阿霉素、甲氨蝶呤、卡培他滨、长春瑞滨、四氢叶酸、奥沙利铂及其混合物。优选地，所述化疗剂为阿霉素。图10提供了将现有肽与化疗剂结合的方法的一个示例。
25.根据所选择的递送系统，药物组合物可能有不同的组成/配方要求。举例来说，本发明的药物组合物可配制成以注射形式配制的肠外给药，以通过例如静脉内、皮内、肌肉内、皮下或腹腔内途径给药。对于肠外给药，所述组合物最好以无菌水溶液的形式使用，所述溶液可能含有其他物质，例如足够的盐或单糖，以使溶液与血液等渗。皮内给药途径包括任何皮肤进入方式，例如，使用基于微针的注射和输注系统(或其他精确靶向皮内空间的方式)，向皮内空间无针(needless)或无针(needle-free)弹道注射液体或粉末，mantoux型皮内注射，通过微装置增强离子导入，以及将液体、固体或其他剂量形式直接沉积到皮肤中，包括使用贴片将组合物沉积到皮肤上。所述组合物也可配制成通过口服或局部途径给药，包括经鼻、经口或经皮给药。优选地，所述组合物被配制成通过静脉途径递送。
26.所公开的抗癌肽的施用量或剂量应足以在体内有效靶向癌细胞。所述剂量将由特定制剂的疗效、肿瘤在受试者体内的位置以及受试者的体重决定。
27.所公开的抗癌肽的剂量也将由可能伴随特定制剂给药的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常情况下，医生会考虑各种因素，如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、要施用的化合物/制剂、给药途径和所治疗疾病的严重程度，来决定治疗每个受试者
的肽剂量。适宜的剂量可由本领域技术人员确定。作为非限制性示例，本发明抗癌肽的总剂量可为治疗对象的约0.001至约1000mg/kg体重、约0.01至约100mg/kg体重、约0.1mg/kg至约10mg/kg以及约0.5mg/kg至约5mg/kg体重。在另一实施方案中，所述肽的总剂量浓度可为约1nm至约10000nm、优选约10nm至约5000nm、更优选约100nm至约500nm。
28.在优选实施方案中，包含本发明肽的组合物至少每月施用一次，优选每1至4周施用一次，共四次。
29.所述肽可以以d或l型存在。在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含l型的肽。发明人惊奇地发现，此处呈现的肽在l型时对癌细胞更具选择性。
30.在一个实施方案中，所述药学上可接受的组合物包含形成α螺旋组件的肽。优选地，该肽在癌细胞膜上形成孔。据信，这些肽直接针对癌细胞膜的脂质成分和化学微环境，并在其中形成孔隙，通过使癌细胞的电化学梯度短路而杀死癌细胞。
31.本发明的第三方面涉及一种治疗癌症的方法，其中本发明的药学上可接受的组合物被给予癌症患者。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。
32.本发明的第四方面涉及具有包含基序gllxllelllxaag的序列的肽，其中每个x独立地选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。
33.本发明的第五方面涉及具有包含基序gllxllxlllxaag的序列的肽，其中每个x独立地选自精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)，并且其中所述序列不包含seq id no:29或seq id no:33。
34.本发明的第六方面涉及一种用于治疗癌症的试剂盒，包含本发明所述的药学上可接受的组合物。在优选实施方案中，所述试剂盒用于治疗乳腺癌。所述试剂盒还可包含化疗剂。
35.本发明的第七方面涉及编码肽的核苷酸序列，所述肽包含seq id no:1-36中任一条序列。
36.本发明的第八方面涉及一种表达肽的载体，所述肽包含seq id no:1-36中任一条序列及其混合物。
37.所述载体可以是用于表达本发明的肽的任何合适载体，包括病毒载体和非病毒载体。所述病毒载体包括细小病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒。所述细小病毒可能是腺病毒相关病毒(aav)。所述载体优选为重组腺相关病毒(raav)载体或慢病毒载体。更优选地，所述载体是raav载体。
38.本发明的载体可以是基因递送载体。这种基因递送载体可以是病毒基因递送载体或非病毒基因递送载体。
39.因此，本发明提供了基于动物细小病毒的基因递送载体，尤其是依赖性病毒，例如感染性人或猿猴aav，及其组分(例如，动物细小病毒基因组)，用于在哺乳动物细胞中导入和/或表达本发明的肽。因此，本文中使用的术语“细小病毒”包括依赖性病毒，例如任何类型的aav。
40.技术人员将理解，本发明的所有方面，无论它们是否涉及例如药学上可接受的组合物、肽、其用途或治疗方法，都同样适用于本发明的所有其他方面。具体而言，与本发明的其他方面(例如肽本身)相比，可以更详细地描述例如药学上可接受的组合物的方面。然而，本领域技术人员将理解，如果已经针对本发明的特定方面给出了更详细的信息，则该信息
通常同样适用于本发明的其他方面。
附图说明
41.现在将仅参考附图以示例的方式详细描述本发明，其中：
42.图1示出了一个富含亮氨酸的组合肽库的设计，以及与其他成孔和肿瘤靶向膜活性肽的比较。a)组合肽库序列与它们在螺旋轮上的投影一起示出，螺旋轮是假定的膜活性构象。b)库肽与其他成孔和肿瘤靶向膜活性肽的等电点和疏水性的比较。抗菌肽数据库(apd)中包含26个氨基酸的肽、蜂毒素及其类似物(功能获得和功能缺失类似物)、ph依赖性蜂毒素和癌症靶向ph低插入肽(phlip)。
43.图2示出了当前鉴定的序列文库针对来源于癌症和健康人类组织的不同人类细胞系体外细胞毒性筛选结果，所述文库由36种组合肽(seq id no:1-36)组成。还示出了选定d型肽以及临床使用的抗癌药物盐霉素和阿霉素的体外细胞毒性筛选结果。对不同的人类细胞系进行细胞毒性评估，并使用半数最大抑制浓度(ic
50
)进行量化：a)hmler与mcf-10a，b)hmler-shecad与mcf-10a，c)hmler与hmler-shecad，d)hmler与hek293t，e)hmler-shecad与hek293t，以及f)u2os与hek293t。
44.图3示出了两种临床使用的抗癌药物阿霉素和盐霉素，与两种选定的d型抗癌肽(d型dek和d型eek)和36种富含亮氨酸的抗癌肽相比，对不同的人类细胞系，例如hmler(三角形)、hmlershecad(菱形)、mcf-10a(实线)、u2os(正方形)和hek293t(虚线)的体外细胞毒性剂量反应。
45.图4示出了阿霉素(实心正方形)、盐霉素(实心三角形)和富含亮氨酸的抗癌肽l型eee(正方形)、l型dek(圆圈)、l型eek(灰色圆圈)和d型eek(黑色圆圈)的肿瘤球(hmler-shecad细胞)的体外细胞毒性和剂量反应。a)测定细胞活力，以量化抗癌药物对抗肿瘤细胞(hmler-shecad)乳腺球的效力。b)使用选定的抗癌化合物治疗后的乳腺球群体。虚线表示未经任何处理的预期阴性对照。c)每种抗癌药物的ic
50
(灰色条)和ic90(黑色条)测定值以及特定浓度下乳腺球的光学显微镜图像。比例尺为100μm。
46.图5示出了阿霉素(实心正方形)、盐霉素(实心三角形)和富含亮氨酸的抗癌肽l型eee(正方形)、l型dek(圆圈)、l型eek(灰色圆圈)和d型eek(黑色圆圈)的乳腺球(mca-10a细胞)的体外细胞毒性和剂量反应。测定细胞活力以量化抗癌药物对抗健康人乳腺内皮细胞(mca-10a)乳腺球的效力。b)使用选定的抗癌化合物治疗后的乳腺球群体。虚线表示未经任何处理的阴性对照。c)每种抗癌药物的ic
50
(实线柱)和ic
90
(柱)测定值以及特定浓度下乳腺球的光学显微镜图像。比例尺为100μm。
47.图6示出了阿霉素、盐霉素、l型eek和d型eek对不同人类细胞系的体外细胞毒性和剂量反应：hmler(圆圈)、hmler shecad(灰色实心圆圈)、u2os(正方形)、mcf-10a(黑色实心圆圈)和hek293t(三角形)。阴影区域表示对癌细胞系具有细胞选择性且对正常细胞系(mcf-10a和hek293t)影响较小的理想化合物浓度。
48.图7示出了色氨酸荧光结合分析的结果。它示出了50％肽与单一脂质种类popc脂质体(圆圈)或混合脂质种类popc:popg(比例3:1，正方形)脂质体结合时的脂质浓度。简言之，将50μm肽固定并与滴定的popc囊泡(黑色)或3popc/1popg囊泡(灰色)在磷酸盐缓冲盐水(1x，ph7.4)中以0、12.5、25、50、100、250、500、1000、2500和5000μm的浓度孵育。通过色氨
酸荧光结合分析确定导致50％肽结合的脂质浓度，数值以脂质/肽表示。该数据表明，本发明的肽可以区分中性囊泡(popc)和带电囊泡(popc/popg)，后者充当癌细胞的模型(warburg效应)。
49.图8示出了导致脂质体中ants/dpx染料渗漏50％的肽浓度。简言之，将0.5mmpopc囊泡(灰色)或popc:popg囊泡(比例3:1，黑色)与肽浓度分别为0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.25、2.5、5、10和20μm的a)盐酸调节磷酸盐缓冲盐水(1x，ph4.8)和b)磷酸盐缓冲盐水(1x，ph7.4)孵育。肽诱导的染料渗漏强度报告为每个肽的脂质数量(高数值表示肽在破坏脂膜方面更有效)。
50.图9示出了富含亮氨酸的acp的作用机制。a)l型eek(黑色三角形)和d型eek(灰色三角形)对人红细胞的溶血活性。b)肽诱导的高亲和力核酸染色(sytoxgreen)以滴定肽浓度进入hela细胞系：l型eek(黑色三角形)、d型eek(灰色三角形)和蜂毒素(方形)作为阳性对照。c)在l型eek(黑圈)和d型eek(灰圈)存在下，并与necrostatin(坏死性凋亡抑制剂)和zvad-fmk(凋亡抑制剂)共同培养，hmler-shecad(人乳腺内皮癌干细胞)细胞存活率。d)阿霉素(圆圈)、阿霉素与5μm半胱天冬酶抑制剂z-vad-fmk(方形)、阿霉素与20μm necrostatin-1(三角形)联合治疗的hmler-shecad细胞的活力
51.图10示出了当前acp与铜基小分子抗癌药物结合的合成策略。
52.图11示出了原子细节的acp膜孔结构和膜穿孔机理。分子动力学模拟揭示了a.acp膜自发吸附b.插入和c.孔隙形成(所示为一个大的、非均质的、充满水的eek孔隙)的全部原子细节。d,e.结合肽形成一个由2-16个肽(顶部)组成的瞬变孔，将水(中部)和离子(底部)穿过膜。
具体实施方式
53.实施例1
54.材料和方法
55.肽的合成与纯化
56.固相合成肽并纯化至98％纯度。通过hplc和esi质谱确认肽的纯度和特性。n-末端为游离胺基，c-末端为游离羧基或酰胺基。
57.脂质体制备
58.脂质体1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(popg)购自avanti极性脂质体并溶解于氯仿中。通过使用购自avanti polar lipides挤压机和过滤器，通过100nm的微孔过滤器挤出制备大的单层囊泡(luv)。
59.细胞系和细胞培养条件
60.将hmler(人乳腺内皮癌细胞)、hmler-shecad(人乳腺内皮癌干细胞)和mcf-10a(健康人乳腺内皮细胞)细胞保存在乳腺上皮细胞生长培养基(megm)中，并添加补充物和生长因子：牛垂体提取物(bpe)、氢化可的松、人表皮生长因子(hegf)、胰岛素、庆大霉素/两性霉素b。hek293t(人类胚胎肾细胞)和u2os(人骨肉瘤)细胞保存在dulbecco的改良eagle’s培养基(dmem)中，最终浓度为10％胎牛血清。细胞在热力学温度为310k的t75烧瓶中，在含5％co2的加湿气氛中生长。
61.细胞毒性试验
62.采用比色mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)试验测定抗癌肽和常规抗癌药物的毒性。将5
×
103细胞接种在96孔微孔板的每个孔中。细胞孵育过夜。添加高浓度的化合物(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.3、12.5、25、50和100μm)，并以总体积200μl孵育72小时。将化合物的储备溶液制备为dmso中的5mm溶液，并使用介质或纯水稀释。每个孔中二甲基亚砜的最终浓度为0.5％或0％，未经处理的对照组中也为该浓度。72小时后，向每个孔中加入20μl溶于pbs的4mg/mlmtt溶液，并将培养皿再培养4小时。吸入megm/mtt混合物，并添加100μl二甲基亚砜以溶解产生的紫色甲瓒晶体。在550nm波长下读取每个孔中溶液的吸光度。将吸光度值进行相对含二甲基亚砜或不含二甲基亚砜的对照孔的标准化，并绘制为受试化合物浓度与细胞活力百分比的关系图。ic
50
值根据产生的剂量依赖曲线进行插值。报告的ic
50
值是两个独立实验的平均值，每个实验由每个浓度水平的六次重复组成(总n＝12)。36种富含亮氨酸的肽的ic
50
值是两个独立实验的平均值(总体n＝2)。
63.肿瘤球形成和活性测定
64.将hmler-shecad细胞(5
×
103)接种于超低附着96孔板(corning)中，并在添加了b27(invitrogen)、20ng/ml egf和4μg/ml肝素(sigma)的megm中培养5天。在存在和不存在抗癌肽、阿霉素和盐霉素的情况下进行研究。用抗癌肽、阿霉素和盐霉素处理过的乳腺球用倒置试剂tox8(sigma)计数和成像。培养16小时后，在590nm(λ
ex
＝560nm)处读取溶液的荧光。活的乳腺球减少了氧化的tox8的数量，同时增加了荧光tox8中间体的数量，表明受试化合物引起的乳腺球细胞毒性的程度。将荧光值相对含二甲基亚砜或不含二甲基亚砜的对照进行标准化，并绘制为试验化合物浓度与乳腺球存活率的关系图。ic
50
值根据产生的剂量依赖曲线进行插值。报告的ic
50
值是两个独立实验的平均值，每个实验由每个浓度水平的两次重复组成(总n＝4)。
65.色氨酸荧光结合分析
66.在10mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中制备肽(50μm)和popc/popg luv(600μm)。60分钟后对溶液进行培养和测定。在280nm固定激发(狭缝9nm)，在300至450nm收集发射(狭缝9nm)。使用biotek的synergy h1混合多模式阅读器(图3a)和cytation
tm
5细胞成像多模式阅读器记录光谱(图2)，并在3次扫描中取平均值。
67.脂质体渗漏测定
68.将5mmants(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐)和12.5mmdpx(对二甲苯-双吡啶溴化铵)与脂质一起包埋在直径为0.1μm的挤压囊泡中。使用sephadex g-100凝胶过滤色谱法(ge healthcare life sciences inc.)从含有截留内容物的luv中去除外部游离ants/dpx。将luv稀释至0.5mm，并通过添加等量的肽来测定渗漏活性。培养3小时后测定渗漏。10％triton作为阳性对照，测定囊泡的最大渗漏量。使用bio tek synergy h1混合多模式读取器，使用350nm和510nm的激发和发射波长记录ants/dpx的荧光发射光谱。
69.溶血试验
70.肽在pbs中以100μm的浓度连续稀释。每个孔中肽的最终体积为50μl。向每个孔中添加50μl pbs中的rbc，浓度为2
×
108cells/ml。使用1％triton作为阳性对照。混合物在37℃下培养1小时，然后在1000
×
g下离心5分钟。离心后，将10μl上清液转移至新鲜96孔板中的90μl去离子水中。记录410nm处释放血红蛋白的吸光度，并根据100％和0％溶血对照计算
溶血分数。
71.绿菁sytox试验测定hela细胞的细胞毒性
72.hela细胞在t-75烧瓶中在dmem完全培养基(10％fbs)中生长至融合。在细胞毒性实验的前一天，细胞用胰酶消化，从烧瓶中取出，并以1300rpm的速度成粒。弃去胰蛋白酶和废培养基，将细胞重悬在dmem完全培养基中。使用细胞计数器获得细胞计数。然后将细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96孔的组织培养板中。第二天，在一个单独的96孔板中，将肽在dmem完全培养基(10％含fbs)和0.1％的绿菁sytox中连续稀释，起始浓度为100μm(第1次)、67μm(第2次)，然后进行2:3连续稀释。每个孔中肽的最终体积为100μl。为了进行细胞毒性试验，从孔中取出培养基，并用肽/dmem/绿菁sytox溶液替换。不加肽和20μmmelp5分别用作阴性和阳性对照。以504nm的激发波长和523nm的发射波长，每5分钟读取一次平板荧光，持续一小时。细胞毒性是基于100％和0％裂解对照，基于因细胞壁失稳而进入细胞的绿菁sytox来计算的。
73.分子动力学模拟与分析
74.使用gromacs2018.3(www.gromacs.org)、hippo beta(http://www.biowerkzeug.com)以及vmd(http://www.ks.uiuc.edu/research/vmd/)进行无偏全原子md模拟并进行分析。
75.使用hippo beta生成扩展的肽结构。通过200次蒙特卡罗(monte carlo)步骤对这些初始结构进行弛豫(relax)，使用广义born溶剂对水进行隐式处理。弛豫后，使用charmm-gui将肽置于含有100mm k和cl离子的模型膜的原子细节的肽/脂质/水系统中(http://www.charmm-gui.org/)。蛋白质折叠模拟在对肽施加位置限制的情况下平衡10ns。对于成孔模拟，允许单个肽在双层上折叠约600ns。一旦获得稳定的表面状态，随后系统在x和y(但不是z)方向上乘以4
×
4，得到一个含有16个肽的系统。当从膜两侧的肽开始时，最初的结构有一个肽在上部小叶，一个在下部小叶。然后通过复用3
×
3构建大系统，以获得18肽模拟盒。使用charmm36力场结合tip3p水模型，使用gromacs2018.3进行md模拟。使用pme计算静电相互作用，范德华相互作用的临界值为积分时间步长为2fs，邻域列表每5步更新一次。所有模拟均在npt系综中进行，没有任何限制或偏置电位。将水和蛋白质分别耦合到热浴中，使用速度-重标度-温度耦合，时间常数τt＝0.5ps。使用可压缩性κz＝κ
xy
＝4.6
·
10-5
bar-1
和时间常数τ
p
＝1ps与弱半各向同性压力耦合将大气压力维持在1bar。
76.寡聚体群体分析
77.为了在模拟过程中揭示最密集的孔隙组合，为每个轨道框架构建了所有寡聚体的完整列表。n级寡聚体被认为是相互接触的任何一组n肽，接触定义为重原子(n，c，o)最小距离《通常，由于许多短暂的表面结合(s-状态)肽仅松散地连接到构成寡聚体核心的跨膜插入肽上，该定义过度计算了寡聚体状态。这些s-状态肽经常改变位置或在孔的稳定部分上下漂移。为了集中分析真正的长寿命tm孔，肽的倾斜角τ引入了75
°
的截止标准。任何τ≥75
°
的肽都被认为处于s状态下，并从寡聚体分析中删除。该策略通过关注真正的长寿命孔隙结构，大大降低了寡聚聚类算法中的噪声。然后构建寡聚体n的占比乘以其肽n的数量的种群图。这些揭示了在模拟过程中寡聚体状态下肽质量的集中程度。
78.置换聚类分析
79.所有相同n级的寡聚体均采用主链rmsd相似性截止标准为的聚类算法进行构象聚类。由于每个寡聚体可能由不同的肽组成—或者由相同的肽组成但顺序不同—聚类将一个低聚物与另一个低聚物的肽排列的所有n！个排列进行比较。排列是使用heap的算法生成的。构象相似性的最终rmsd值被认为是从n！排列比较获得的。聚类结果基本持平，表明结构是高度短暂(fleeting)和动态的。
80.跨膜通量
81.通过测定整个双层膜的总瞬时通量，计算了通过膜孔的水和离子通量。在和处考虑与膜法线正交的两个平面，并计算所有穿过这些平面的跨越事件。然后通过将过渡计数除以膜片面积和每个轨迹帧的运行时间来获得通量。随后通过平均1000帧来平滑曲线。
82.实施例2
83.肽原理
84.下表1包含36种肽，它们属于本发明的范围。
85.表1：
86.[0087][0088]
n-端是游离的，c-端：w-nh2。示出了等电点、估计的界面结合自由能和疏水力矩的计算预测。
[0089]
界面结合自由能是肽与膜结合的可能性的量度，疏水力矩是疏水残基以螺旋状、插入膜的构象均匀分布在肽表面的量度。
[0090]
在c-端引入额外的色氨酸以量化肽浓度。带电荷的羧基c-端(-co
2-)也被改性为中性酰胺基(-nh2)，以进一步促进膜渗透。肽被设计成使带电荷的残基位于螺旋结构的同一极面上。因此，电荷分布可能会影响肽的疏水力矩、pka、与癌细胞膜的结合强度，并最终影响癌细胞膜内肽组件的结构(图1a)。许多具有针对癌症的生物医学应用的ph依赖性肽具有约4.0的pka。这可能源于癌细胞的微环境略为酸性，这是由于warburg效应。因此认为癌细胞膜可以将本发明的负性氨基酸质子化，并导致ph触发的膜活性(图1b和表1)。
16-19
[0091]
所有36种富含亮氨酸的肽序列都合成为l型。δg
interfacal
代表肽在水和膜界面之间分配的结合自由能。使用mpex软件，使用wimley-white疏水性量表估算δg
interface
和疏水力矩。结合自由能是肽与膜结合时释放的能量。为0时，肽在水中50％，在膜上50％，为负时肽优先插入膜，为正时肽优先选择水相。疏水力矩是衡量疏水残基在螺旋轮周围的间距；力
矩大时，它们都在一侧，力矩低时，它们均匀地分布在周围。大力矩更有利于表面结合(即疏水面浸入双层，亲水面指向水)。
[0092]
实施例3
[0093]
细胞毒性和功效
[0094]
针对几种不同的人类细胞系筛选这些肽，并测定其细胞毒性。使用的细胞系包括mcf-10a(人类乳腺上皮细胞)、hmler(人类乳腺癌体细胞)、hmlershecad(人类乳腺癌干细胞)、hek293t(人类胚胎肾细胞)和u2os(人类骨肉瘤)。结果表明，这些肽与传统抗癌药物一样有效，可以以低微摩尔浓度清除癌细胞，并且许多肽对癌细胞系具有高选择性(图2和表1)。尽管与健康mcf-10a细胞相比，阿霉素和盐霉素对癌性hmler也有选择性，但它们对hek293t细胞的毒性都显著增强。此外，这两种药物在清除三维乳腺球生长的癌细胞方面的功效都要低得多，而三维乳腺球目前被认为是一种更精确的实体瘤的体外模型。阿霉素和盐霉素对二维hmler-shecad的半数最大抑制浓度(ic
50
)分别为2.5
±
0.3nm和370
±
0.5nm，但在更真实的三维细胞培养模型乳腺球中，这些值分别降至43
±
6μm和22
±
5μm，阿霉素的活性降低1700倍，盐霉素的活性降低63倍。见下表2和图3。相比之下，所选序列eek(gllellelllkaagw)及其d型肽对二维和三维乳腺球肿瘤模型均有效，对hmler、hmler shecad和u2os细胞的二维培养物具有纳摩尔至低微摩尔活性，对乳腺球具有7-13μm活性。参见图4至图6。
[0095]
所有数据点重复进行。选择的d型肽、常规抗癌药物、eek肽和25b2肽重复六次。n-端是游离的，c-端：-wnh2。
[0096]
表2
[0097]
[0098][0099]
实施例4
[0100]
色氨酸结合试验和脂质体渗漏试验
[0101]
本发明的肽大多为中性或阴离子，序列中不含许多正电荷(表1)。本发明人确定了六个序列：eee、kee、ehe、eeh、dek和eek(图2和表2)，它们对癌细胞系具有高度选择性，对mcf-10a(ic
50
≥100μm)的影响可以忽略不计且对hek293t的细胞毒性相对较低。它们的净电荷介于-2和0之间，pka为3.85-7.96，它们的序列要么包含一个正电荷(带正电荷的n-端)要么包含两个正电荷(带正电荷的-n端和位于4或11位的赖氨酸)。几项研究表明，癌细胞膜可能具有带负电的膜表面
20,21
。ishikawa等人发现，类似于hmler的乳腺癌细胞系mcf-7在膜表面含有少量带负电的唾液酸
20
。这表明，目前富含亮氨酸的肽的抗癌活性和细胞选择性不能仅用静电相互作用来解释，还可能涉及癌细胞微环境中的warburg效应引起的电荷分布。为了证实这一假设，本发明人使用两种不同的脂质模型囊泡(两性离子popc和阴离子3popc/
1popg混合物)分别在ph7.4(生理条件)和ph4.8(弱酸)下进行色氨酸结合分析(见下表3和图7)和ants/dpx脂质体渗漏分析(见下表4和图8)。
[0102]
表3表明了脂质浓度诱导的50％的肽与脂质体结合。将50μm肽固定并与滴定脂质(popc囊泡或3popc/1popg囊泡)在磷酸盐缓冲盐水(1x，ph7.4)中以0、12.5、25、50、100、250、500、1000、2500和5000μm的浓度孵育。导致50％的肽结合的脂质浓度通过色氨酸荧光结合分析确定，数值用每肽脂质表示。n-端是游离的，c-端：-w-nh2。
[0103]
表4表明了肽浓度诱导的50％的ants/dpx脂质体渗漏。将0.5mm popc和3popc/1popg囊泡固定并与滴定肽浓度(0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.25、2.5、5、10和20μm)在磷酸盐缓冲盐水(1x，ph7.4)和盐酸调节磷酸盐缓冲盐水(1x，ph4.8)中孵育。数值用每肽脂质表示。n-端是游离的，c-端：-w-nh2。
[0104]
表3
[0105]
[0106][0107]
[0108]
表4
[0109]
[0110][0111]
结果表明，在中性ph下，细胞选择性肽在两性和阴离子囊泡之间没有明显的结合选择性和肽诱导的脂质体渗漏，但在ph4.8时，六种膜选择性肽中有四种(ehe、eeh、dek和eek)具有较高的阴离子囊泡脂质体渗漏活性。这表明这四种肽是环境触发的膜活性肽，取决于脂质成分和ph条件；然而，其他两种膜选择性肽(eee和kee)的作用机制尚不清楚。
[0112]
实施例5
[0113]
富含亮氨酸的肽的作用机理
[0114]
图9示出了当浓度低于90μm时，l型eek会导致最小程度的溶解，远低于约10μm治疗浓度。d型eek更具溶解性。对高亲和力核酸染色剂绿菁sytox进入hela细胞的浓度依赖性比较表明，l型和d型eek的行为类似于强效穿孔肽蜂毒肽。这些结果共同证明，其作用机制是癌细胞质膜的选择性孔隙形成。
[0115]
图9c示出了用l型或d型eek处理的hmler-shecad细胞的细胞活力不能通过与坏死性凋亡抑制剂necrostatin共同孵育或与凋亡抑制剂z-vad-fmk共同孵育来改善，这表明acp由于质膜中的孔形成而引发坏死。相比之下，图9d显示，通过与z-vad-fmk或necrostatin共同孵育，经阿霉素处理的hmler-shecad细胞的细胞活力可以显著提高。
[0116]
这些结果共同表明，癌细胞质膜中的选择性孔隙形成导致坏死是acp抗癌活性的主要机制。
[0117]
实施例6
[0118]
apc孔结构和功能
[0119]
膜穿孔肽通常会形成暂时性孔隙，无法通过现有技术进行实验测定。为了揭示支撑膜穿孔的分子机制，我们使用无偏长时间尺度原子细节分子动力学模拟研究了eek的折叠分配和孔组装。acp迅速吸收并折叠到膜界面上(图14a)。随后，在数十微秒的时间尺度上，apc协同插入和转移穿过脂质双层，填充两个膜界面(图14b)，并形成一个完整的孔(图14d)。结构分析揭示了高度不均匀的孔结构，大多数由6-10个肽组成，这些肽在膜中不断形成和分解(图14e)。孔隙同时传导水和离子(图14d)，而渗漏主要由更大、更稳定的孔隙主导，这些孔隙由10-12个肽组成，这些肽形成排列有极性侧链和带电侧链的大型水通道(图14c)。
[0120]
序列描述
[0121]
[0122]
[0123][0124]
参考文献
[0125]
在此通过引用将本说明书中引用的所有专利和文献引入且整体并入本文。
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