一种甘露醇的生物制备方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甘露醇的生物制备方法。


背景技术：

2.d
‑
甘露醇(以下简称甘露醇)又名d
‑
甘露糖醇、己六醇、虫草酸、d
‑
木蜜醇，是一种天然化合物，广泛存在于自然界的多种细菌、真菌、藻类和植物中。
3.甘露醇广泛应用于食品、制药、化工等领域。在食品工业方面，甘露醇吸水性小，并具有爽口的甜味，可用于口香糖、年糕等食品的防粘；在制药工业方面，甘露醇进入体内后能提高血浆渗透压，使组织脱水，可降低颅内压和眼内压，也是良好的利尿剂；在化工领域，以甘露醇为起始剂加压而制成的聚甘露醇
‑
氧化丙烯醚广泛应用于塑料行业中，而由硬脂酸与甘露醇酯化反应制得硬脂酸甘露醇酯可作为工业乳化剂和分散剂等。
4.目前，应用最广泛的生产甘露醇的方法为化学合成法，以镍作为催化剂，在高温高压条件下，以淀粉、蔗糖或果葡糖浆等为原料，通过催化加氢制备得到甘露醇。该方法原料来源稳定，生产期限不受限制，然而化学催化法的选择性较低，在反应过程中产生大量副产物d
‑
山梨醇。例如，使用蔗糖水溶液甲酸水解成葡萄糖和果糖再进行催化氢化反应的方法获得的实际产物中，山梨醇占80％，而甘露醇仅占20％(吴国荃等.2004.化工技术经济(04):4
‑
6.)从海藻、海带等天然物质中提取甘露醇是另一种工业生产甘露醇的方法，该方法可得到单一的甘露醇，然而受到原料资源、提取收率、气候条件、能源消耗等限制。微生物发酵生产甘露醇具有反应选择性高、反应条件温和、能耗低等优势，但存在微生物工程菌代谢改造困难、易产生代谢副产物等缺点。
5.因此，亟待开发一种低成本、高产率的生产甘露醇的新方法。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何通过体外多酶反应体系催化生产甘露醇或如何提高生产甘露醇的产物收率。
7.为解决上述技术问题，本发明首先提供了体外多酶催化反应制备甘露醇的方法。
8.所述方法包括以淀粉和/或淀粉衍生物为底物，采用用于制备甘露醇的组合物进行多酶催化反应，得到甘露醇的步骤；所述多酶催化反应的温度为25
‑
70℃，ph值为5.0
‑
8.5，催化反应的时间为1
‑
72小时。
9.所述用于制备甘露醇的组合物为组合物x、组合物y或组合物z；所述组合物x含有酶x，所述酶x是活性成分为淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶、甘露醇1
‑
磷酸酶和甲酸脱氢酶的组合物；所述组合物y含有酶y，所述酶y是活性成分为所述组合物x和异淀粉酶的组合物；所述组合物z含有酶z，所述酶z是活性成分为所述组合物x、异淀粉酶、4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的组合物。
10.所述淀粉磷酸化酶可为如下a1)、a2)、a3)或a4)的蛋白质：
11.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质，
12.a2)氨基酸序列是序列表中序列1的第21
‑
817位的蛋白质，
13.a3)在a1)或a2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
14.a4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)或a2)衍生的或与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
15.所述葡萄糖磷酸变位酶可为如下b1)、b2)、b3)、b4)或b5)的蛋白质：
16.b1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质，
17.b2)氨基酸序列是序列表中序列2的第330
‑
921位的蛋白质，
18.b3)氨基酸序列是序列表中序列2的第344
‑
921位的蛋白质，
19.b4)在b1)或b2)或b3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
20.b5)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由b1)或b2)或b3)衍生的或与b1)或b2)或b3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
21.所述磷酸葡糖异构酶可为如下c1)、c2)、c3)、c4)或c5)的蛋白质：
22.c1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质，
23.c2)氨基酸序列是序列表中序列3的第330
‑
788位的蛋白质，
24.c3)氨基酸序列是序列表中序列3的第341
‑
788位的蛋白质，
25.c4)在c1)或c2)或c3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
26.c5)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由c1)或c2)或c3)衍生的或与c1)或c2)或c3)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
27.所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶可为如下d1)、d2)、d3)或d4)的蛋白质：
28.d1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质，
29.d2)氨基酸序列是序列表中序列4的第1
‑
382位的蛋白质，
30.d3)在d1)或d2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
31.d4)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由d1)或d2)衍生的或与d1)或d2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
32.所述甘露醇1
‑
磷酸酶可为如下e1)、e2)、e3)或e4)的蛋白质：
33.e1)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质，
34.e2)氨基酸序列是序列表中序列5的第35
‑
343位的蛋白质，
35.e3)在e1)或e2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
36.e4)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由e1)或e2)衍生的或与e1)或e2)所示的蛋白质具
有80％以上的同一性的蛋白质。
37.上述甘露醇1
‑
磷酸酶是使所述甘露醇1
‑
磷酸酶的编码基因在生物中进行表达得到的，所述生物可为所述埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌bl21(de3)。
38.所述甘露醇1
‑
磷酸酶的基因可为下述任一种dna分子：
39.e1)核苷酸序列为序列表中序列11的dna分子；
40.e2)核苷酸序列为序列表中序列11的第103
‑
1032位核苷酸的dna分子；
41.e3)与e1)或e2)所示的dna分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的dna分子。
42.所述甲酸脱氢酶可为如下f1)、f2)、f3)或f4)的蛋白质：
43.f1)氨基酸序列是序列表中序列6的蛋白质，
44.f2)氨基酸序列是序列表中序列6的第1
‑
401位的蛋白质，
45.f3)在f1)或f2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
46.f4)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由f1)或f2)衍生的或与f1)或f2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
47.所述异淀粉酶可为如下g1)、g2)、g3)或g4)的蛋白质：
48.g1)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质，
49.g2)氨基酸序列是序列表中序列7的第1
‑
716位的蛋白质，
50.g3)在g1)或g2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
51.g4)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由g1)或g2)衍生的或与g1)或g2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
52.所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶可为如下h1)、h2)、h3)或h4)的蛋白质：
53.h1)氨基酸序列是序列表中序列8的蛋白质，
54.h2)氨基酸序列是序列表中序列8的第1
‑
659位的蛋白质，
55.h3)在h1)或h2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
56.h4)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由h1)或h2)衍生的或与h1)或h2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。
57.所述聚磷酸葡萄糖激酶可为如下i1)、i2)、i3)或i4)的蛋白质：
58.i1)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质，
59.i2)氨基酸序列是序列表中序列9的第1
‑
262位的蛋白质，
60.i3)在i1)或i2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白，
61.i4)将序列表中序列9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由i1)或i2)衍生的或与i1)或i2)所示的蛋白质具
有80％以上的同一性的蛋白质。
62.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
63.所述生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
64.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
65.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
66.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
67.上文中，所述淀粉磷酸化酶可为天然的淀粉磷酸化酶，如来源于大肠杆菌(escherichia coli，uniprot编号p00490、a0a0a0hb49等)、海栖热袍菌(thermotoga maritima，uniprot编号g4feh8)或热纤维梭菌(clostridium thermocellum，uniprot编号a3dcb6)；也可为非天然的淀粉磷酸化酶，如重组淀粉磷酸化酶。
68.上文中，所述葡萄糖磷酸变位酶可为天然的葡萄糖磷酸变位酶，如来源于热纤梭菌(clostridium thermocellum，uniprot编号a3dew8)或thermococcus kodakarensis(uniprot编号q68bj6)；也可为非天然的葡萄糖磷酸变位酶，如重组葡萄糖磷酸变位酶。
69.上文中，所述磷酸葡糖异构酶可为天然的磷酸葡糖异构酶，如来源于热纤梭菌(clostridium thermocellum，uniprot编号a3dbx9)或嗜热栖热菌(thermus thermophilus，uniprot编号q5sll6)；也可为非天然的磷酸葡糖异构酶，如重组磷酸葡糖异构酶。
70.上文中，所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶可为天然的甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶，如来源于大肠杆菌(escherichia coli，uniprot编号p09424、q8xdg9、q8fcb7、b1izj2等)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis，uniprot编号p42957)、粪肠球菌(enterococcus faecalis，uniprot编号p27543)或变形链球菌(streptococcus mutans，uniprot编号q02418)；也可为非天然的甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶，如重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶。
71.上文中，所述甘露醇1
‑
磷酸酶可为天然的甘露醇1
‑
磷酸酶，如来源于柔嫩艾美球虫(eimeria tenella，uniprot编号o43980)或食用海带(saccharina japonica，uniprot编号a0a068b0r3)；也可为非天然的甘露醇1
‑
磷酸酶，如重组甘露醇1
‑
磷酸酶。
72.上文中，所述甲酸脱氢酶可为天然的甲酸脱氢酶，如来源于硫杆菌(thiobacillus sp.，uniprot编号q76eb7)、博伊丁假丝酵母(candida boidinii，uniprot编号o13437)、假单胞菌(pseudomonas sp.，uniprot编号p33160)、稳定伯克霍尔德菌(burkholderia stabilis，uniprot编号b5a8w5)或mycolicibacterium vaccae(uniprot编号q93gv1)；也可为非天然的甲酸脱氢酶，如重组甲酸脱氢酶。
73.上文中，当所述方法使用来源于柔嫩艾美球虫(eimeria tenella)的甘露醇1
‑
磷
酸酶时，优选地，所述甘露醇1
‑
磷酸酶的基因序列为经过大肠杆菌(escherichia coli)偏爱密码子优化的dna序列，即通过对甘露醇1
‑
磷酸酶基因编码的密码子的在大肠杆菌中表达的密码子偏好性进行优化和对甘露醇1
‑
磷酸酶基因的gc含量和mrna在大肠杆菌的稳定性进行优化后获得的dna序列。
74.上文中，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶可为天然的4
‑
α
‑
转葡糖苷酶，如来源于海岸热球菌(thermococcus litoralis，uniprot编号o32462)、海栖热袍菌(thermotoga maritima，uniprot编号p80099)、新阿波罗栖热袍菌(thermotoga neapolitana，uniprot编号o86956)或丁酸梭菌(clostridium butyricum，uniprot编号q59266)；也可为非天然的4
‑
α
‑
转葡糖苷酶，如重组4
‑
α
‑
转葡糖苷酶。
75.上文中，所述聚磷酸葡萄糖激酶可为天然的聚磷酸葡萄糖激酶，如来源于嗜热子囊菌(thermobifida fusca，uniprot编号q47nx5)或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，uniprot编号a5u654、p9win1等)；也可为非天然的聚磷酸葡萄糖激酶，如重组聚磷酸葡萄糖激酶。
76.上述用于制备甘露醇的组合物中的活性成分可混合包装或可单独包装再混合。
77.上述组合物x还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。
78.上述组合物y还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。
79.上述组合物z还含有聚磷酸盐。
80.上述聚磷酸盐可为六偏磷酸钠和/或三聚磷酸钠。
81.上述组合物z还可含有磷酸盐、辅酶、甲酸盐和/或镁盐。
82.上述磷酸盐可为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的至少一种。
83.上述辅酶可为nadh、nad+、nadph、nadp+中的至少一种。
84.上述甲酸盐可为甲酸钠、甲酸钾、甲酸铵、甲酸钙中的至少一种。
85.上述镁盐可为氯化镁和/或硫酸镁。
86.上述淀粉和/或淀粉衍生物为可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精和/或麦芽多糖。
87.上述多酶催化反应为分步进行催化或同时进行催化。所述同时进行催化的时间为1
‑
72小时。
88.所述多酶催化反应为多酶催化反应l、多酶催化反应m或多酶催化反应n。
89.上述方法中所述多酶催化反应l中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物x。所述进行分步催化的催化反应过程可如图2所示，具体可为：所述淀粉磷酸化酶利用无机磷催化所述淀粉和/或淀粉的衍生物磷酸化为葡萄糖1
‑
磷酸，所述葡萄糖磷酸变位酶催化所述葡萄糖1
‑
磷酸转化为葡萄糖6
‑
磷酸，所述磷酸葡糖异构酶催化所述葡萄糖6
‑
磷酸转化为果糖6
‑
磷酸，所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶利用辅酶催化将所述果糖6
‑
磷酸还原为甘露醇1
‑
磷酸，同时nad+或nadp+依赖的所述甲酸脱氢酶催化甲酸盐为底物进行所述辅酶的再生，所述甘露醇1
‑
磷酸酶催化所述甘露醇1
‑
磷酸脱磷酸基团生成甘露醇。
90.上述方法中所述多酶催化反应m中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物y。所述进行分步催化的催化反应过程可为：加入所述异淀粉酶进行催化反应0.1
‑
72小时后，加入所述组合物x进行所述多酶催化反应l得到甘露醇。
91.上述方法中所述多酶催化反应n中，所述用于制备甘露醇的组合物为组合物z。所述进行分步催化的催化反应过程可为：加入所述异淀粉酶进行催化反应0.1
‑
72小时后，加入所述组合物x进行所述多酶催化反应l1
‑
48小时，之后加入所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶进行催化反应得到甘露醇。加入所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶进行催化反应的时间可为0.5
‑
30小时。
92.上述方法中所述多酶催化反应l中可包含缓冲液体系。所述缓冲液可为hepes缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的任一种。所述缓冲液可为tris
‑
hcl缓冲液。所述tris
‑
hcl缓冲液的浓度可为20
‑
300mm。所述tris
‑
hcl缓冲液的浓度可为100
‑
300mm。所述tris
‑
hcl缓冲液的浓度可为200mm。
93.上述方法中所述多酶催化反应m或n中的异淀粉酶催化反应中可包含缓冲液体系，所述缓冲液可为乙酸钠缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的任一种。所述缓冲液的浓度可为1
‑
50mm，所述缓冲液的浓度可为2
‑
20mm。所述缓冲液的浓度可为3
‑
10mm，所述缓冲液的浓度可为5mm。
94.上述方法中所述多酶催化反应为多酶催化反应l，所述多酶催化反应l为分步进行催化或同时进行催化。所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1
‑
200g/l。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述甲酸脱氢酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述辅酶的浓度可为0.005
‑
60mm。所述甲酸盐的浓度可为10
‑
2000mm。所述磷酸盐的浓度可为1
‑
150mm。所述镁盐的浓度可为0.1
‑
20mm。所述多酶催化反应l的反应温度可为25
‑
70℃。ph值可为5.0
‑
8.5。所述同时进行催化的时间可为1
‑
48小时。
95.或，
96.上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应m。所述多酶催化反应m为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1
‑
500g/l，所述异淀粉酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml，所述镁盐的浓度可为0.01
‑
10mm。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为10
‑
99℃，ph值可为4.0
‑
8.5，所述催化反应时间可为0.1
‑
72小时。
97.所述多酶催化反应m为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1
‑
200g/l。所述多酶催化反应m的反应温度可为25
‑
70℃。ph值可为5.0
‑
8.5。所述同时进行催化的时间可为1
‑
72小时。
98.或，
99.上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应n。所述多酶催化反应n为分步进行催化，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为0.1
‑
10u/ml。所述聚磷酸盐的浓度可为0.01
‑
20mm。所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为25
‑
70℃，ph值可为5.0
‑
8.5，所述催化反应反应时间可为0.5
‑
30小时。
100.所述多酶催化反应n为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为1
‑
200g/l，所述多酶催化反应n的反应温度可为25
‑
70℃。ph值可为5.0
‑
8.5。所述同时进行催化的时间可为1
‑
72小时。
101.上述方法中所述多酶催化反应为多酶催化反应l，所述多酶催化反应l为分步进行
催化或同时进行催化。所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为5
‑
100g/l。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述甲酸脱氢酶的浓度可为0.2
‑
5u/ml。所述辅酶的浓度可为0.01
‑
10mm。所述甲酸盐的浓度可为40
‑
800mm。所述磷酸盐的浓度可为2
‑
50mm。所述镁盐的浓度可为2
‑
15mm。所述多酶催化反应l的反应温度可为30
‑
50℃，ph值为6.0
‑
7.5，所述同时进行催化的时间可为8
‑
36小时。
102.或，
103.上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应m，所述多酶催化反应m为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10
‑
400g/l。所述异淀粉酶的浓度可为0.5
‑
2u/ml。所述镁盐的浓度可为0.2
‑
1mm。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为50
‑
90℃，ph值可为4.5
‑
6.5，所述催化反应的时间可为1
‑
24小时。
104.所述多酶催化反应m为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为5
‑
100g/l。所述多酶催化反应m的反应温度可为30
‑
50℃。ph值可为6.0
‑
7.5。所述同时进行催化的时间可为8
‑
60小时。
105.或，
106.上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应n，所述多酶催化反应n为分步进行催化，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶的浓度可为0.5
‑
2u/ml。所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为0.5
‑
2u/ml。所述聚磷酸盐的浓度可为0.5
‑
6mm。所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为30
‑
50℃，ph值可为6.0
‑
7.5，所述催化反应时间可为5
‑
20小时。
107.所述多酶催化反应n为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为85
‑
100g/l。所述多酶催化反应n的反应温度可为30
‑
50℃。ph值可为6.0
‑
7.5。所述同时进行催化的时间可为8
‑
60小时。
108.上述方法中多酶催化反应为多酶催化反应l，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/l。所述淀粉磷酸化酶的浓度可为2u/ml。所述葡萄糖磷酸变位酶的浓度可为2u/ml。所述磷酸葡糖异构酶的浓度可为1u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶的浓度可为1u/ml。所述甘露醇1
‑
磷酸酶的浓度可为1u/ml。所述甲酸脱氢酶的浓度可为1u/ml。所述辅酶的浓度可为0.1mm。所述甲酸盐的浓度可为100mm。所述磷酸盐的浓度可为15mm。所述镁盐可为氯化镁，所述氯化镁的浓度可为10mm。所述多酶催化反应l的反应温度可为37℃，ph值可为7.4，所述同时进行催化的时间可为24小时。
109.或，
110.上述方法中多酶催化反应为所述多酶催化反应m，所述多酶催化反应m为分步进行催化，所述异淀粉酶的催化步骤中，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为300g/l。所述异淀粉酶的浓度可为1u/ml，所述镁盐可为氯化镁，所述氯化镁的浓度可为10mm。所述异淀粉酶催化反应的反应温度可为85℃，ph值可为5.5，所述催化反应的时间可为12小时。
111.所述多酶催化反应m为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/l。所述多酶催化反应m的反应温度可为37℃。ph值可为7.4。所述同时进行催化的时间可为48小时。
112.或，
113.上述方法中所述多酶催化反应为所述多酶催化反应n，所述多酶催化反应n为分步进行催化，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和聚磷酸葡萄糖激酶的催化步骤中，所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶的浓度可为1u/ml，所述聚磷酸葡萄糖激酶的浓度可为1u/ml，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠，所述六偏磷酸钠的浓度可为5mm。所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶催化反应的反应温度可为37℃，ph值可为7.4，所述催化反应的时间可为12小时。
114.所述多酶催化反应n为同时进行催化，所述淀粉和/或淀粉的衍生物的浓度可为10g/l。所述多酶催化反应n的反应温度可为37℃。ph值可为7.4。所述同时进行催化的时间可为48小时。
115.上述体外多酶催化反应制备甘露醇的方法可在生物反应器中进行，上述多酶催化反应m或n中加入异淀粉酶的反应步骤与多酶催化反应l可以分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行，也可以与所述多酶催化反应l同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。
116.上述多酶催化反应n中所述4
‑
α
‑
转葡糖苷酶和/或聚磷酸葡萄糖激酶进行催化的反应可以与所述异淀粉酶的催化反应步骤和/或多酶催化反应l分步进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行或在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行，也可以同时进行，例如可以在一个生物反应器或反应容器中进行。
117.优选地，采用异淀粉酶催化反应的步骤在反应l之前进行。此时，优选地，在异淀粉酶催化的反应进行10
‑
99℃反应0.1
‑
72小时，进一步优选在30
‑
95℃反应0.5
‑
48小时，更优选在50
‑
90℃反应1
‑
24小时，最优选在85℃反应12小时后，在反应系统中添加组合物x。
118.优选地，采用4
‑
α
‑
转葡糖苷酶催化反应的步骤在将淀粉和/或淀粉的衍生物、磷酸盐转化为葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)的反应进行一段时间后进行。此时，优选地，在将淀粉和/或淀粉的衍生物、磷酸盐转化为g1p的反应进行0.5
‑
30小时，优选5
‑
20小时，最优选18小时后在反应体系中添加4
‑
α
‑
转葡糖苷酶。
119.为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备甘露醇的产品。所述产品为试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒含有上文所述的组合物。
120.上文所述的用于制备甘露醇的组合物也属于本发明的保护范围。
121.本发明的实施例中的酶催化反应采用如下方法：在一个反应体系中，以10g/l经异淀粉酶处理的可溶性淀粉为底物，加入10mm氯化镁、15mm磷酸二氢钠、100mm甲酸钠、200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)、0.1mm nad
+
、2u/ml淀粉磷酸化酶、2u/ml葡萄糖磷酸变位酶、1u/ml磷酸葡糖异构酶、1u/ml甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶、1u/ml甘露醇1
‑
磷酸酶、1u/ml甲酸脱氢酶，反应混合物在37℃下进行催化反应24h，得到甘露醇。优选地，在反应进行18h时向反应体系中还加入终浓度为1u/ml的4
‑
α
‑
转葡糖苷酶、终浓度为1u/ml的聚磷酸葡萄糖激酶和终浓度为5mm的六偏磷酸钠。最终得到的甘露醇的浓度为9.9g/l，产物收率为99％。
122.本发明首次使用体外多酶催化反应以淀粉、淀粉衍生物或其任意混合物为底物制备甘露醇。本发明的方法可以使用多种原料，并可以以接近理论值的收率获得目标产物。因此，本发明的方法具有原料廉价易得、生产成本低、底物转化率和产品收率高、环境友好等优点，适宜推广。加入异淀粉酶、4
‑
α
‑
转葡糖苷酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐可以极大地提高目标产物的收率。
附图说明
123.图1为编码来源于柔嫩艾美球虫的甘露醇1
‑
磷酸酶的核苷酸优化前后序列比对结果。
124.图2为以淀粉为底物制备甘露醇的体外多酶催化途径的示意图。其中αgp为淀粉磷酸化酶，pgm为葡萄糖磷酸变位酶，pgi为磷酸葡糖异构酶，m1pdh为甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶，m1pase为甘露醇1
‑
磷酸酶，fdh为甲酸脱氢酶，p
i
为无机磷。
125.图3为sds
‑
page检测以淀粉为底物制备甘露醇的关键酶。m：marker，αgp表示重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp，pgm表示重组葡萄糖磷酸变位酶l
‑
ctpgm，pgi表示重组磷酸葡糖异构酶l
‑
ctpgi，m1pdh表示重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶ecm1pdh
‑
his，m1pase表示重组甘露醇1
‑
磷酸酶his
‑
etm1pase，fdh表示重组甲酸脱氢酶tsfdh
‑
his。
126.图4为利用hplc分析甘露醇标准品。其中3a为甘露醇标准品的hplc峰图；其中3b为甘露醇标准品的浓度与hplc峰高的线性关系图，通过甘露醇峰的强度可以对所得到的甘露醇的浓度进行定量。
127.图5为利用体外多酶体系催化可溶性淀粉合成甘露醇。其中4a为体外多催化可溶性淀粉生成甘露醇的高效液相色谱(hplc)分析结果；其中4b为体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇的反应进程曲线。
128.图6为体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的反应进程曲线。
具体实施方式
129.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
130.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
131.本发明实施例中使用的部分材料信息如下：
132.可溶性淀粉：acros公司产品，产品编号：424490020；
133.pet20b(+)和pet28a(+)载体：novagen，madison，wi usa；
134.ptwin1载体：new england biolabs,ipswich,ma usa；
135.大肠杆菌表达菌bl21(de3)：invitrogen，carlsbad，ca usa；
136.实施例1：甘露醇的酶法合成途径中的酶活测定
137.通过体外多酶催化体系将淀粉转化为甘露醇的催化途径见图2。在本实施例中，(1)淀粉磷酸化酶(α
‑
glucan phosphorylase,ec 2.4.1.1,αgp)来源于大肠杆菌(escherichia coli，uniprot编号p00490)；(2)葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase,ec 5.4.2.2,pgm)来源于热纤梭菌(clostridiumthermocellum，uniprot编号a3dew8)；(3)磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase,ec 5.3.1.9,pgi)来源于热纤梭菌(clostridium thermocellum，uniprot编号a3dbx9)；(4)甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶(mannitol 1
‑
phosphate 5
‑
dehydrogenase,ec 1.1.1.17,m1pdh)来源于大肠杆菌(escherichia coli，uniprot编号p09424)；(5)甘露醇1
‑
磷酸酶(mannitol 1
‑
phosphatase,ec 3.1.3.22,
m1pase)来源于柔嫩艾美球虫(eimeria tenella，uniprot编号o43980)；(6)甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，ec 1.17.1.9或ec 1.17.1.10，fdh)来源于硫杆菌(thiobacillus sp.，uniprot编号q76eb7)。除甘露醇1
‑
磷酸酶的基因之外，上述其他5种酶的基因的dna序列都可从uniprot的官方网站(https://www.uniprot.org/)上获得。经密码子优化获得的甘露醇1
‑
磷酸酶的基因(核苷酸序列如序列表中序列11的第103
‑
1032位dna分子所示)的合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。如图1所示，优化前(图1中seq id no.2所示)与优化后(图1中seq id no.1所示)的序列相比有22.0％的核苷酸序列不同。通过simple cloning(you et al.2012.appl.environ.microbiol.78(5):1593
‑
1595.)的方法，将上述来源于大肠杆菌的甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶基因、来源于柔嫩艾美球虫的甘露醇1
‑
磷酸酶基因分别克隆至pet28a(+)载体(novagen，madison，wi)中，分别获得相应的表达载体pet28a
‑
ecm1pdh、pet28a
‑
etm1pase。利用同样的simple cloning的方法，将来源于硫杆菌的甲酸脱氢酶的基因克隆至pet20b(+)载体(novagen，madison，wi)中，获得相应的表达载体pet20b
‑
tsfdh。按照文献(wei xl et al.2018.chemcatchem 10(24):5597
‑
5601.)所述，通过simple cloning的方法，将上述来源于大肠杆菌的淀粉磷酸化酶基因克隆至pet28a(+)载体中，获得相应的表达载体pet28a
‑
ecαgp。按照文献(hong et al.2008.j chromatogr a 1194:150
‑
154.)所述，利用pcr分别扩增来源于clostridium thermocellum的纤维素结合模块(cellulose
‑
binding module，cbm)基因片段、来源于synechocystis sp.的dnab内含肽(intein)基因片段、来源于clostridium thermocellum的pgm的基因片段，并使用dna连接酶将上述三个片段同时连接至ptwin1载体(new england biolabs,ipswich,ma)，获得相应的表达载体ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm。按照文献(myung et al.2011.biotechnol.prog.27(4):969
‑
975.)所述，利用pcr扩增来源于clostridium thermocellum的pgi的基因片段，得到含有ctpgi基因的pcr扩增片段，利用上述含有ctpgi基因的pcr扩增片段替代构建ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm时所用的ctpgm基因片段，使用dna连接酶将cbm、intein、ctpgi三个片段同时连接至ptwin1载体(new england biolabs,ipswich,ma)，获得相应的表达载体ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi。
138.将pet28a
‑
ecαgp、ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm、ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi、pet28a
‑
ecm1pdh、pet28a
‑
etm1pase、pet20b
‑
tsfdh分别单独转入大肠杆菌bl21(de3)的感受态细胞中。将含有pet28a
‑
ecαgp的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a
‑
ecαgp，bl21(de3)/pet28a
‑
ecαgp能表达序列表中序列1所示的蛋白质—重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp；将含有ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm，bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm能表达序列表中序列2所示的蛋白质—重组葡萄糖磷酸变位酶cbm
‑
intein
‑
ctpgm；将含有ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi，bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi能表达序列表中序列3所示的蛋白质—重组磷酸葡糖异构酶cbm
‑
intein
‑
ctpgi；将含有pet28a
‑
ecm1pdh的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a
‑
ecm1pdh，bl21(de3)/pet28a
‑
ecm1pdh能表达序列表中序列4所示的蛋白质—重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶ecm1pdh
‑
his，编码ecm1pdh
‑
his的核苷酸序列如序列表中序列10所示；将含有pet28a
‑
etm1pase的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a
‑
etm1pase，bl21(de3)/pet28a
‑
etm1pase能表达序列表中序列5所示的蛋白质—重组甘露醇1
‑
磷酸酶his
‑
etm1pase，编码his
‑
etm1pase的核苷酸序列如序列表中序列11所示；将含有pet20b
‑
tsfdh的重组大肠杆菌
命名为bl21(de3)/pet20b
‑
tsfdh，bl21(de3)/pet20b
‑
tsfdh能表达序列表中序列6所示的蛋白质—重组甲酸脱氢酶tsfdh
‑
his，编码tsfdh
‑
his的核苷酸序列如序列表中序列12所示。
139.将bl21(de3)/pet28a
‑
ecαgp、bl21(de3)/pet28a
‑
ecm1pdh、bl21(de3)/pet28a
‑
etm1pase这3个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，将bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgm、bl21(de3)/ptwin1
‑
ci
‑
ctpgi、bl21(de3)/pet20b
‑
tsfdh这3个菌株分别单独姐终于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为100μg/ml得到的培养基)中，37℃，220rpm振荡培养至0d
600
值(以含50μg/ml卡那霉素或含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，分别得到诱导表达的菌液。上述6株菌的诱导表达均是用0.1mm的iptg在18℃诱导16
‑
18小时。将上述诱导表达的菌液于4℃，6000rpm离心10min，收集菌体。
140.制备含有his标签的重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp、重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶ecm1pdh
‑
his、重组甘露醇1
‑
磷酸酶his
‑
etm1pase、重组甲酸脱氢酶tsfdh
‑
his的方法如下：向菌体中加入20ml预冷的裂解缓冲液a(含50mm磷酸钠，250mm nacl，ph 7.4)，重悬菌体，随后进行超声破碎(超声5s，间隔5s，总超声时间10min，功率300w)，超声结束后，4℃，10000rpm离心10min，收集上清液。上清液为含目的蛋白质的上清液。取4ml ni
‑
beads到柱子中，然后用预冷的裂解缓冲液a洗三遍，加入上述含目的蛋白质的上清液，将结合目的蛋白质的ni
‑
beads用wash buffer 1(溶质及其浓度如下：50mm nah2po4、250mm nacl、25mm咪唑，溶剂是水，ph 7.4的溶液)洗2次，5ml/次，用离心管收集wash buffer1洗液，wash buffer 2(溶质及其浓度如下：50mm nah2po4、250mm nacl、50mm咪唑，溶剂是水，ph 7.4的溶液)洗2次，4ml/次，收集wash buffer 2洗液。随后用elution buffer(溶质及其浓度如下：50mm nah2po4、250mm nacl、500mm咪唑，溶剂是水，ph 7.4的溶液)洗脱目的蛋白2次，4ml/次，收集两次洗脱出的液体，得到含目的蛋白质的液体(含重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp的液体、含重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶ecm1pdh
‑
his的液体、含重组甘露醇1
‑
磷酸酶his
‑
etm1pase的液体、含重组甲酸脱氢酶tsfdh
‑
his的液体)。
141.制备重组葡萄糖磷酸变位酶l
‑
ctpgm(l
‑
ctpgm是cbm
‑
intein
‑
ctpgm去掉了cbm和intein标签的重组葡萄糖磷酸变位酶)、重组磷酸葡糖异构酶l
‑
ctpgi(l
‑
ctpgi是cbm
‑
intein
‑
ctpgi去掉了cbm和intein标签的重组磷酸葡糖异构酶)的方法如下：按照文献(zhang et al.2006.biomacromolecules 7(2):644
‑
8.)所述方法制备再生无定型纤维素。向菌体中加入20ml预冷的裂解缓冲液b(含30mm tris
‑
hcl，1mmβ
‑
巯基乙醇，1mm edta，ph 8.5)，重悬菌体，随后进行超声破碎(超声5s，间隔5s，总超声时间10min，功率300w)，超声结束后，4℃，10000rpm离心10min，收集上清液。上清液为含目的蛋白质的上清液。将按照上述方法所得的再生无定型纤维素5ml与20ml含目的蛋白质的细胞破碎上清液混合，室温孵育30min，4℃8000rpm离心，所得沉淀为与cbm
‑
intein
‑
ctpgm、cbm
‑
intein
‑
ctpgi结合的再生无定型纤维素。使用20ml裂解缓冲液洗涤沉淀1次，4℃8000rpm离心获得沉淀，再使用intein切割缓冲液(含50mm hepes，0.5m nacl，0.1mm edta，ph 6.5)洗涤沉淀两次，每次20ml，4℃8000rpm离心获得沉淀，向所得沉淀加入10ml intein切割缓冲液，40℃水浴孵育8
小时，4℃12000rpm离心，收集上清液，所得上清液为含有重组目的蛋白l
‑
ctpgm或l
‑
ctpgi的溶液。
142.取少量上述方法制备的目的蛋白质的液体加入蛋白裂解液煮样，进行sds
‑
page凝胶电泳，然后用考马斯亮蓝染色检测蛋白纯化效果(图3)。结果表明得到了大小为92.7kda的重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp(图3中αgp)，大小为65kda的重组葡萄糖磷酸变位酶l
‑
ctpgm(图3中pgm)，大小为51.5kda的重组磷酸葡糖异构酶l
‑
ctpgi(图3中pgi)，大小为42.2kda的重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶ecm1pdh
‑
his(图3中m1pdh)，大小为38.3kda的重组甘露醇1
‑
磷酸酶his
‑
etm1pase(图3中m1pase)，大小为45.1kda的重组甲酸脱氢酶tsfdh
‑
his(图3中fdh)。
143.重组葡萄糖磷酸变位酶(l
‑
ctpgm)的酶活测定在含有10mm氯化镁的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4，溶质是10mm氯化镁，溶剂是200mm tris
‑
hcl缓冲液)中进行。以10mm葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)为底物，在37℃下反应10min，测定产生的葡萄糖6
‑
磷酸(g6p)的量。g6p的定量检测方法如下：取40μl含有g6p的样品溶液，添加200μl含有2mm氯化镁、0.15mm nad
+
、0.5u/ml葡萄糖6
‑
磷酸脱氢酶(glucose6
‑
phosphate dehydrogenase，g6pdh)的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4，溶质是2mm氯化镁、0.15mm nad
+
、0.5u/ml g6pdh，溶剂为200mm tris
‑
hcl缓冲液)，37℃反应30分钟，测定340nm处的吸光度，计算产生的nadh的量。实验结果显示，纯化后的重组葡萄糖磷酸变位酶在37℃下的比酶活为44.6u/mg。其中，酶活力单位(u)定义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol g6p的酶量。
144.重组淀粉磷酸化酶his
‑
ecαgp的酶活测定在含有10mm氯化镁、15mm磷酸二氢钠、1u/ml葡萄糖磷酸变位酶的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)中进行。以10g/l可溶性淀粉为底物，在37℃下反应10min，将重组淀粉磷酸化酶产生的葡萄糖1
‑
磷酸(g1p)转化为葡萄糖6
‑
磷酸(g6p)，测定产生的g6p的量。实验结果显示，纯化后的重组淀粉磷酸化酶在37℃下的比酶活为1.0u/mg。其中，酶活力单位(u)定义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol g1p的酶量。
145.重组磷酸葡糖异构酶(l
‑
ctpgi)的酶活测定在含有10mm氯化镁的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)中进行。以10mm果糖6
‑
磷酸(f6p)为底物，在37℃下反应10min，测定产生的葡萄糖6
‑
磷酸(g6p)的量。实验结果显示，纯化后的重组磷酸葡糖异构酶在37℃下的比酶活为884.7u/mg。其中，酶活力单位(u)定义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol g6p的酶量。
146.重组甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶(m1pdh
‑
his)的酶活测定在含有10mm氯化镁的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)中进行。以10mm果糖6
‑
磷酸(f6p)和0.15mm nadh为底物，在37℃下反应10min，测定消耗的nadh的量。实验结果显示，大肠杆菌来源的甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶在37℃下的比酶活为387.4u/mg。其中，酶活力单位(u)定义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol nad+的酶量。
147.重组甘露醇1
‑
磷酸酶(his
‑
m1pase)的酶活测定在含有10mm氯化镁、1u/ml甘露醇1
‑
磷酸脱氢酶的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)中进行。以10mm果糖6
‑
磷酸(f6p)和1mm nadh为底物，在37℃下反应10min，通过文献中无机磷酸根的检测方法(saheki et al.1985.anal.biochem.148(2):277
‑
81.)，测定产生的无机磷酸根的量。实验结果显示，柔嫩艾美球虫来源的甘露醇1
‑
磷酸酶在37℃下的比酶活为58.9u/mg。其中，酶活力单位(u)定
义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol无机磷酸根的酶量。
148.重组甲酸脱氢酶(fdh
‑
his)的酶活测定在含有10mm氯化镁的200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)中进行。以10mm甲酸和1mm nad
+
为底物，在37℃下反应10min，测定产生的nadh的量。实验结果显示，硫杆菌来源的甲酸脱氢酶在37℃下的比酶活为9.2u/mg。其中，酶活力单位(u)定义为：在上述条件(37℃ph 7.4)下，在1min内产生1μmol nadh的酶量。
149.实施例2：体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇
150.本实施例采用酶在体外催化可溶性淀粉合成甘露醇。首先重组表达了六种酶(实施例1)：来源于大肠杆菌的αgp、来源于热纤梭菌的pgm、来源于热纤梭菌的pgi、来源于大肠杆菌的m1pdh、来源于柔嫩艾美球虫的m1pase、来源于硫杆菌的fdh。
151.采用高效液相色谱法(hplc)定量分析甘露醇。所用色谱柱为bio
‑
rad aminex hpx
‑
87h，流动相为5mm硫酸，流速0.6ml/min，柱温60℃，所用检测器为示差折光检测器。标准样品检测如图4中a所示，甘露醇保留时间约为10.0分钟。甘露醇浓度与甘露醇的hplc特征峰的响应强度成正比，标准曲线如图4中b所示。
152.将含有10g/l可溶性淀粉、10mm氯化镁、15mm磷酸二氢钠、100mm甲酸钠、0.1mm nad
+
、200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)、2u/mlαgp、2u/ml pgm、1u/ml pgi、1u/ml m1pdh、1u/ml m1pase、1u/ml fdh，其余为水的1ml反应混合物在37℃下反应24h。反应结束后，取样77μl，添加50μl的2m高氯酸溶液终止反应，之后添加20μl的5m氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定反应溶液中的甘露醇的浓度(图5中a)。反应进行24h时，上清液中，甘露醇的浓度为4.9g/l，产物收率为49％(图5中b)。
153.产物收率的计算公式如下：
[0154][0155]
实施例3体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇
[0156]
淀粉为经α
‑
1,4和α
‑
1,6糖苷键混合连接的多糖，不能被淀粉磷酸化酶完全磷酸解。异淀粉酶(ia，ec 3.2.1.68)能够水解淀粉中的α
‑
1,6糖苷键，从而帮助淀粉磷酸化酶磷酸解底物，提高甘露醇的得率。
[0157]
在本实施例中，异淀粉酶来源于来源于头寇岱硫化叶菌(sulfolobus tokodaii，uniprot编号q973h3)。将文献(cheng et al.2015.scientific reports 5:13184.)报道的表达载体pet20b
‑
stia导入大肠杆菌bl21(de3),得到含有pet20b
‑
stia的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet20b
‑
stia，bl21(de3)/pet20b
‑
stia能表达序列表中序列7所示的重组异淀粉酶stia
‑
his。按照实施例1的方法进行重组异淀粉酶stia
‑
his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行stia
‑
his的纯化。
[0158]
将含有300g/l可溶性淀粉、5mm乙酸钠缓冲液(ph 5.5)、0.5mm氯化镁和1u/ml异淀粉酶，其余为水的1ml反应混合物，在85℃处理12个小时，得到的液体为300g/l经异淀粉酶处理的可溶性淀粉溶液。其中，酶活力单位(u)定义为：80℃,ph 5.5的条件下，在1min内能够产生1μmol淀粉还原端的酶量。
[0159]
将含有10g/l经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10mm氯化镁、15mm磷酸二氢钠、100mm甲酸钠、0.1mm nad
+
、200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)、2u/mlαgp、2u/ml pgm、1u/ml pgi、1u/ml m1pdh、1u/ml m1pase、1u/ml fdh，其余为水的1ml反应混合物在37℃下孵育24h。不
同时间取样77μl用以检测生成的甘露醇浓度，通过添加50μl的2m高氯酸溶液终止反应，之后添加20μl的5m氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定甘露醇的浓度(同实施例2)。实验结果表明，体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的反应进行24h时，上清液中，甘露醇的浓度为6.6g/l，产物收率为66％(图6中实线所示)，添加异淀粉酶可有效提高体外多酶催化可溶性淀粉合成甘露醇的产物收率。
[0160]
实施例4通过添加4
‑
α
‑
转葡糖苷酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐，提高合成甘露醇的产物收率
[0161]
淀粉磷酸化酶将异淀粉酶处理的可溶性淀粉磷酸解，最终剩余的底物为麦芽三糖和麦芽糖。4
‑
α
‑
转葡糖苷酶(4gt，ec 2.4.1.25)能够通过转糖基作用将短链麦芽寡糖的糖链进行延长，进一步被淀粉磷酸化酶利用，进而转化为甘露醇，提高产物得率。4
‑
α
‑
转葡糖苷酶在转糖基过程中产生较长链的麦芽寡糖和葡萄糖。聚磷酸葡萄糖激酶(ppgk，ec 2.7.1.63)能够利用聚磷酸盐，将包含d
‑
葡萄糖单元的二糖、多糖或其任意混合物发生转糖基反应后产生的葡萄糖磷酸化为g6p，进一步被磷酸葡糖异构酶利用，进而转化为甘露醇，提高产物得率。
[0162]
在本实施例中，4
‑
α
‑
转葡糖苷酶来源于海岸热球菌(thermococcus litoralis，uniprot编号o32462)。将文献(zhou et al.2016.j.agric.food chem.64(8):1777
‑
83.)报道的表达载体p20b
‑
ti4gf
‑
co导入大肠杆菌bl21(de3)，得到含有p20b
‑
ti4gf
‑
co的重组大肠杆菌bl21(de3)/p20b
‑
ti4gf
‑
co，bl21(de3)/p20b
‑
ti4gf
‑
co能表达序列表中序列8所示的重组4
‑
α
‑
转葡糖苷酶tl4gt
‑
his。按照实施例1的方法进行重组4
‑
α
‑
转葡糖苷酶tl4gt
‑
his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行tl4gt
‑
his的纯化。
[0163]
在本实施例中，聚磷酸葡萄糖激酶来源于嗜热子囊菌(thermobifida fusca，uniprot编号q47nx5)。将文献(zhou et al.2018.appl.environ.microbiol.84(16):e01224
‑
18.)报道的含有五个突变位点的ppgk基因(文献中为突变体4
‑
1)的重组表达载体pet28a
‑
p
tac
‑
ppgk导入大肠杆菌bl21(de3)，得到含有pet28a
‑
p
tac
‑
ppgk的重组大肠杆菌bl21(de3)/pet28a
‑
p
tac
‑
ppgk，bl21(de3)/pet28a
‑
p
tac
‑
ppgk能表达序列表中序列9所示的重组聚磷酸葡萄糖激酶tfuppgk
‑
his。按照实施例1的方法进行重组聚磷酸葡萄糖激酶tfuppgk
‑
his的蛋白质表达。按照实施例1中制备含有his标签的重组酶的方法进行tfuppgk
‑
his的纯化。
[0164]
将含有实施例3中的10g/l经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10mm氯化镁、15mm磷酸二氢钠、100mm甲酸钠、0.1mm nad
+
、200mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 7.4)、2u/mlαgp、2u/ml pgm、1u/ml pgi、1u/ml m1pdh、1u/ml m1pase、1u/ml fdh，其余为水的1ml反应混合物在37℃下孵育18h。然后向体系中加入4gt、ppgk和六偏磷酸钠，使4gt的含量为1u/ml、ppgk的含量为1u/ml和六偏磷酸钠的含量为5mm，37℃继续反应至30h。其中，4gt酶活力单位(u)定义为：37℃,ph 7.4的条件下，在1min内能够产生1μmol葡萄糖的酶量，ppgk酶活力单位(u)定义为：37℃,ph 7.4的条件下，在1min内能够产生1μmol g6p的酶量。不同时间取样77μl用以测定合成甘露醇的浓度，通过添加50μl的2m高氯酸终止反应，之后添加20μl的5m氢氧化钾中和反应液，13800x g离心5min，取上清液通过高效液相色谱法测定甘露醇的浓度。实验结果表明，通过添加4gt和ppgk到甘露醇的合成反应体系中，反应进行30h时，上清液中甘露醇
的浓度为9.9g/l，产物收率为99％(图6中虚线所示)，体外多酶催化异淀粉酶处理过的可溶性淀粉合成甘露醇的产物收率显著提高。
[0165]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。