变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法与流程

变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，本发明属于微生物分离纯化技术领域，具体涉及金黄色葡萄球菌分离纯化技术领域。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，为一种常见的食源性致病微生物，金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性，金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长ph7.4，平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm，血平板菌落周围形成透明的溶血环，金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15％nacl肉汤中生长，可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，甲基红反应阳性，vp反应弱阳性，许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶，金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

变形杆菌为能活泼运动而又极为多形性的一群肠道菌，有球形和丝状形，具有鞭毛、无荚膜、无芽胞、革兰氏阴性，运动活泼，在固体培养基上呈扩散生长，形成迁徙生长现象，若在培养基中加入0.1％石炭酸或0.4％硼酸可以抑制其扩散生长，形成一般的单个菌落，在ss平板上可以形成圆形、扁薄、半透明的菌落，易与其他肠道致病菌混淆，在血琼脂平板上有溶血现象。

因变形杆菌迁徙生长的特性，随着其的生长，菌落会覆盖整个培养基，让生长在其中的金黄色葡萄球菌无法分纯用于药物敏感试验，病人提供过来的临床标本中，金黄色葡萄球菌是致病菌，但会被变形杆菌污染，目前很好的的分纯方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于：变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，以解决现有的由于变形杆菌的前夕生长特性，无法从变形杆菌中分纯金黄色葡萄球菌的缺陷。

本发明采用的技术方案如下：

变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，包括如下步骤：

步骤1、取2ml浓度为0.45-0.9％的生理盐水；

步骤2、向生理盐水中放入1片或1片以上的氨曲南药敏纸片(大小6mm，氨曲南含量30微升)，氨曲南药敏纸片用镊子夹取，混匀得氨曲南药物液体；

步骤3、用棉签蘸取氨曲南药物液体；

步骤4、均匀涂抹在血琼脂平板，再静置5-10分钟，得含有氨曲南药物的血琼脂平板；

步骤5、挑取变形杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物，接种于含有氨曲南药物的血琼脂平板，再3区或4区划线；

步骤6、培养箱(用于细菌培养的常规的培养箱)中孵育16-24小时，即分离出金黄色葡萄球菌。

本申请的技术方案中：由于氨曲南能抑制变形杆菌的生长，对金黄色葡萄球菌无作用，将氨曲南药敏纸片浸泡在生理盐水中，释放出氨曲南，再用含有氨曲南的液体涂布整个平板，静置5-10分钟，待平板干燥后，接种变形杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物的菌落或菌液，培养箱中孵育16-24小时，仅生长金黄色葡萄球菌，并可用于药敏试验，而变形杆菌被彻底抑制。变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，减少分纯步骤，大大缩短了分纯时间，一步到位，重复性好，简单易操作；只要混合物中有金黄色葡萄球菌，就能准确分离出大量单个纯菌落，并且不被变形杆菌污染，可以直接用于药物敏感试验，大大缩短时间周期，最快30小时左右便可出具药敏报告，工作效率高，对临床及时调整用药起到积极作用。

优选的，步骤1中用药敏比浊管取盐水。

优选的，步骤2中用混匀器混匀15-45s。

优选的，步骤2中用混匀器混匀30s。

优选的，步骤2中向生理盐水中放入0.5-6片中任一片氨曲南药敏纸片。

优选的，步骤3中，用棉签蘸取氨曲南药物液体，拭去多余氨曲南药物液体。

更为优选的，用棉签蘸取氨曲南药物液体并均匀涂抹在血琼脂平板，重复1-4次，每次涂抹完成后，将血琼脂平板转60度角。

更为优选的，用棉签蘸取氨曲南药物液体并均匀涂抹在血琼脂平板3次。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明中，变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，减少分纯步骤，大大缩短了分纯时间，一步到位，重复性好，简单易操作；

2、本发明中，只要混合物中有金黄色葡萄球菌，就能准确分离出大量单个纯菌落，并且不被混合菌中的变形杆菌污染，无需再次分纯，可以直接用于药物敏感试验，大大缩短时间周期，最快30小时左右便可出具药敏报告，工作效率极大提高，对临床及时调整用药起到积极作用；

3、本发明中，1/4片/ml氨曲南溶液可作为临界浓度，0.5片/ml可作为稳定的抑制浓度。

附图说明

图1为本发明不同氨曲南浓度下变形杆菌与金黄色葡萄球菌的生长情况。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，包括如下步骤：

步骤1、用药敏比浊管取2ml浓度为0.45％的生理盐水；

步骤2、向生理盐水中放入2片以上的氨曲南药敏纸片，混匀得氨曲南药物液体，混匀器混匀30s；

步骤3、用棉签蘸取氨曲南药物液体，拭去多余氨曲南药物液体；

步骤4、用棉签蘸取氨曲南药物液体并均匀涂抹在血琼脂平板，重复3次，每次涂抹完成后，将血琼脂平板转60度角，再静置8分钟，得含有氨曲南药物的血琼脂平板；

步骤5、挑取变形杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物，接种于含有氨曲南药物的血琼脂平板，再4区划线；

步骤6、培养箱中孵育18小时，即分离出金黄色葡萄球菌。

实施例2

变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，包括如下步骤：

步骤1、用药敏比浊管取2ml浓度为0.45％的生理盐水；

步骤2、向生理盐水中放入4片以上的氨曲南药敏纸片，混匀得氨曲南药物液体，混匀器混匀30s；

步骤3、用棉签蘸取氨曲南药物液体，拭去多余氨曲南药物液体；

步骤4、用棉签蘸取氨曲南药物液体并均匀涂抹在血琼脂平板，重复2次，每次涂抹完成后，将血琼脂平板转60度角，再静置10分钟，得含有氨曲南药物的血琼脂平板；

步骤5、挑取变形杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物，接种于含有氨曲南药物的血琼脂平板，再3区划线；

步骤6、培养箱中孵育20小时，即分离出金黄色葡萄球菌。

实施例3

变形杆菌中金黄色葡萄球菌的分纯方法，包括如下步骤：

步骤1、用药敏比浊管取2ml浓度为0.9％的生理盐水；

步骤2、向生理盐水中放入1片以上的氨曲南药敏纸片，混匀得氨曲南药物液体，混匀器混匀30s；

步骤3、用棉签蘸取氨曲南药物液体，拭去多余氨曲南药物液体；

步骤4、用棉签蘸取氨曲南药物液体并均匀涂抹在血琼脂平板，重复3次，每次涂抹完成后，将血琼脂平板转60度角，再静置6分钟，得含有氨曲南药物的血琼脂平板；

步骤5、挑取变形杆菌和金黄色葡萄球菌的混合物，接种于含有氨曲南药物的血琼脂平板，再4区划线；

步骤6、培养箱中孵育16小时，即分离出金黄色葡萄球菌。

实验例1

对照1，向每毫升生理盐水中加入1/4片氨曲南药敏纸片，仅接种变形杆菌；对照2，向每毫升生理盐水中加入3片氨曲南药敏纸片，仅接种金黄色葡萄球菌；①、②、③、④、⑤和⑥，分别向每毫升生理盐水中加入1/32、1/20、1/16、1/8、1/4和1/2片氨曲南药敏纸片(本发明的技术方案中，是按倍比稀释方法得到的一系列的氨曲南浓度)，其余均同实施例2，分别于接种后1天、2天和3天观察各菌的生长状况见表1和图1(35℃，48小时)。

表1各菌的生长状况

由表1知：氨曲南药敏纸片对金黄色葡萄球菌生长，无抑制作用；当氨曲南纸片剂量为1/4片/ml时，变形杆菌接种量较大时，对变形杆菌抑制效果不理想；1/2片/ml时，抑制效果明显，故1/4片/ml氨曲南溶液可作为临界浓度，0.5片/ml可作为稳定的抑制浓度。

实验例2

用0.5片/ml、1片/ml、2片/ml、3片/ml的氨曲南血琼脂平板上分纯的金黄色葡萄球菌进行5次增菌液增菌培养和梅里埃vitek2compact仪器药敏试验，实验结果如表2和表3。

表2挑取分纯后的单个金黄色葡萄球菌肉汤增菌培养的生长情况

由表2知，0.5片/ml氨曲南的浓度可以有效抑制变形杆菌的生长，但是部分变形在药物压力下可能仍然存活，故在变形杆菌中金黄色葡萄球菌分离，应选择0.5片/ml及以上的氨曲南浓度。

表3挑取分纯后的单个金黄色葡萄球菌药敏试验与单独金黄色葡萄球菌药敏对比结果

由表3知，0.5片/ml氨曲南平板及以上浓度平板上，挑取分纯后的单个金黄色葡萄球菌药敏试验与单独金黄色药敏试验结果均一。利用本法0.5片/ml氨曲南溶液分纯后，金黄色葡萄球菌不会受到平板中携带的变形杆菌的干扰，故氨曲南平板分纯后的单个金黄色葡萄球菌可直接用于药物敏感试验。

根据以上数据，综合考虑到方法的简单易操作、结果稳定可靠、重复性好、快速分离药敏试验等诸多因素后，得出以下试验结论：

选择1片/ml及以上浓度的氨曲南溶液涂抹血液培养基后，将混合菌落在此溶液中进行稀释后取50-100微升(1-2滴)混合液接种于此平板上，孵育16-18小时，用来进行金黄色葡萄球菌的分离培养；

选择2片/ml-3片/ml浓度的氨曲南溶液涂抹血液培养基后，将混合菌落在此溶液中进行稀释后，再取50-100微升(1-2滴)混合液接种于此平板上，孵育20-24小时，用来进行金黄色葡萄球菌的分离培养后直接单个菌落药物敏感试验。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。