一株产气克雷伯氏菌及其应用

1.本发明属于无机污染物微生物修复技术领域，特别涉及一株产气克雷伯氏菌及其应用。


背景技术：

2.镉(cd)作为毒性较强的重金属元素之一，并且是机体生长发育的非必须元素，对动植物和人体都具有毒害作用。镉在自然界中分布广泛，含量微小，其循环本来处于平衡状态，并不会对环境造成污染与危害；但由于人类活动的干预，加速了镉及其化合物的迁移流失与局部富集，造成了严重的生态环境污染，对人体健康产生严重威胁。
3.镉进入环境中的方式有多种，其中地表径流，工业与矿业废水排放是最主要的方式。镉污染因其结构特性而不同于有机物污染，不能被分解和破环；因此只能改变其存在的方式和转移位置。现在，国内外对重金属污染治理的方法主要是物理方法，化学方法和生物修复方法。其中由于物理化学方法和植物修复方法工程量大，成本高，耗时长和二次污染严重等缺点，而逐渐被微生物修复方法所取代。微生物修复方法主要的有点是成本低，特异性强，成本低，二次污染小等，而被广泛应用于污水治理和土壤污染治理。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株产气克雷伯氏菌。
5.本发明的另一目的在于提供所述产气克雷伯氏菌在去除土壤和/或水体中的镉离子方面的应用。
6.本发明的又一目的在于提供所述产气克雷伯氏菌在溶解不可溶性磷和/或钾化合物方面的应用。
7.本发明的再一目的在于提供所述产气克雷伯氏菌在增加土壤中有效磷和/或有效钾方面的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一株产气克雷伯氏菌，名称为klebsiella aerogenes(产气克雷伯氏菌)s1，保藏编号为gdmcc no：61041，该菌株于2020年6月3日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
10.所述的产气克雷伯氏菌的16s rdna序列由1416个碱基(bp)组成，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.一种培养所述产气克雷伯氏菌的方法，具体步骤为：将所述的产气克雷伯氏菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。
12.所述的培养基为lb培养基，msm培养基，含cd
2+
的msm培养基，含cd
2+
和蛋白胨的msm培养基，pko培养基和钾细菌培养基中的一种；优选为lb培养基。
13.所述的含cd
2+
的msm培养基中cd
2+
的浓度为10～80mg
·
l
‑1。
14.所述的含cd
2+
和蛋白胨的msm培养基中cd
2+
的浓度为10～80mg
·
l
‑1，蛋白胨的浓度
为10g
·
l
‑1。
15.所述的pko培养基的配方如下：葡萄糖10g
·
l
‑1，(nh4)2so
4 0.5g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.1g
·
l
‑1，kcl 0.3g
·
l
‑1，mnso4·
4h2o 0.03g
·
l
‑1，feso
4 0.003g
·
l
‑1，ca3(po4)
2 5.0g
·
l
‑1，酵母粉0.5g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph 6.8～7.0。
16.所述的钾细菌培养基的配方如下：钾长石2.5g
·
l
‑1，na2hpo
4 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.02g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，caco
3 5.0g
·
l
‑1，caso4·
2h2o 0.1g
·
l
‑1，葡萄糖10g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph调至6.8～7.0。
17.所述的培养的温度优选为28～30℃；更优选为30℃。
18.所述的培养的时间为18～48h；优选为20～48h。
19.所述的培养为在摇床中进行培养，其转速为125～150rpm。
20.所述的产气克雷伯氏菌在去除土壤和/或水体中的镉离子(降低环境中的镉含量)方面的应用。
21.所述的产气克雷伯氏菌在去除土壤和/或水体中的镉离子方面的应用，为将所述的产气克雷伯氏菌加入到含有镉离子的土壤和/或水体环境中，该菌株可以耐受重金属镉生长，能够对土壤或水体中的镉离子进行消除，以去除或者降低镉离子在环境中的有效浓度。
22.所述的含有镉离子的水体中的镉离子的浓度为10～80mg
·
l
‑1。
23.所述的镉离子为二价镉离子(cd
2+
)。
24.所述的去除的时间为6d(天)以上。
25.所述的产气克雷伯氏菌在制备镉离子钝化剂中的应用。
26.所述的镉离子为二价镉离子(cd
2+
)。
27.所述的产气克雷伯氏菌在溶解不可溶性磷和/或钾化合物方面的应用。
28.所述的产气克雷伯氏菌在溶解不可溶性磷和/或钾化合物方面的应用，为将所述的产气克雷伯氏菌接种到含有不可溶性磷和/或钾化合物的培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养，该产气克雷伯氏菌能够降低体系ph使不可溶性磷和/或钾化合物溶解。
29.所述的不可溶性的磷化合物优选为磷酸三钙(ca3(po4)2)。
30.所述的不可溶性的钾化合物包括含钾矿物；优选为钾长石(k2o
·
al2o3·
6sio2)。
31.所述的含有不可溶性磷化合物的培养基优选为pko培养基，其配方如下：葡萄糖10g
·
l
‑1，(nh4)2so
4 0.5g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.1g
·
l
‑1，kcl 0.3g
·
l
‑1，mnso4·
4h2o 0.03g
·
l
‑1，feso
4 0.003g
·
l
‑1，ca3(po4)
2 5.0g
·
l
‑1，酵母粉0.5g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph 6.8～7.0。
32.所述的含有不可溶性钾化合物的培养基优选为钾细菌培养基，其配方如下：钾长石2.5g
·
l
‑1，na2hpo
4 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.02g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，caco
3 5.0g
·
l
‑1，caso4·
2h2o 0.1g
·
l
‑1，葡萄糖10g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph调至6.8～7.0。
33.所述的产气克雷伯氏菌的接种量为体积百分比1～5％；优选为体积百分比2％。
34.所述的培养的温度优选为28～30℃。
35.所述的培养的时间为18h以上；优选为18h～6d。
36.所述的产气克雷伯氏菌在增加土壤中有效磷和/或有效钾方面的应用。
37.所述的产气克雷伯氏菌在增加土壤中有效磷和/或有效钾方面的应用，为将产气
克雷伯氏菌加入到土壤中，该产气克雷伯氏菌能够降低体系ph，从而溶解土壤中不可溶性的磷和/或钾化合物，以提高土壤中有效磷和/或有效钾含量，进而促进植物生长。
38.所述的不可溶性的磷化合物优选为磷酸三钙(ca3(po4)2)。
39.所述的不可溶性的钾化合物包括含钾矿物；优选为钾长石(k2o
·
al2o3·
6sio2)。
40.一种用于去除环境中镉离子(镉离子钝化剂)的生物菌剂，含有所述的产气克雷伯氏菌。
41.所述的镉离子为二价镉离子(cd
2+
)。
42.所述的环境包括土壤环境和水体环境。
43.一种用于溶解不可溶性磷和/或钾化合物的生物菌剂，含有所述的产气克雷伯氏菌。
44.本发明中的产气克雷伯氏菌s1在lb平板上生长18～20h后，菌斑呈米白色、圆形凸起、光滑湿润且有光泽，在37℃培养24h后，菌落直径约2～2.5mm。可在镉离子浓度为10～80mg
·
l
‑1的含有10g
·
l
‑1蛋白胨的无机盐液体培养基中生长良好。
45.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
46.(1)本发明中的产气克雷伯氏菌s1可通过共代谢方式对镉离子进行去除，将菌株s1接种于镉离子浓度为10～80mg
·
l
‑1的含有10g
·
l
‑1蛋白胨的无机盐液体培养基中，30℃，150rpm震荡培养6d，镉离子6d后去除效率分别为43.15％，42.77％，30.93％和40.95％，说明该菌株s1具有耐受重金属镉生长和去除镉离子的性能，可应用于土壤和水体中高浓度镉离子的去除。
47.(2)本发明中的产气克雷伯氏菌s1可以降低体系中ph(可能是分泌了有机酸类物如草酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等使体系中ph低体)，从而溶解不可溶性磷和钾类物质，将菌株s1接种在pko或钾细菌培养基中，30℃恒温培养48h，进行溶磷解钾定性验试：将菌株s1点接于pko或钾细菌培养基上6d后，在菌体周围都出现透明圈，说明该菌株s1可应用于液体和土壤中的镉去除且具备提高土壤有效磷和钾含量的潜能，可用在促植物生长方面。
附图说明
48.图1是菌株s1的菌落形态图(培养皿直径9cm)。
49.图2是菌株s1的系统发育树图。
50.图3是菌株s1在含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中对镉离子的去除效果图。
51.图4是菌株s1的溶磷解钾定性试验图(透明圈显示菌株具有溶磷解钾功能)其中，a为菌株c273溶磷定性试验；b为菌株c273解钾定性试验。
具体实施方式
52.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
53.实施例1菌株s1的筛选、分离纯化以及鉴定
54.一、一株耐镉及去除镉离子菌株s1筛选方法
55.1.材料准备
56.菌株筛选土壤来源：取自广东省韶关市大宝山周围水稻田的污染土壤，土样用采样袋密封，4℃带回实验室保存并备用。
57.lb培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，nacl 10.0g，ph 7.0～7.2，蒸馏水定容至1l；固体培养基另加18.0g琼脂粉。121℃灭菌15min。
58.无机盐培养基(msm培养基)：将5ml磷酸缓冲溶液(kh2po
4 8.5g
·
l
‑1、k2hpo4·
h2o 21.75g
·
l
‑1、na2hpo4·
12h2o 33.4g
·
l
‑1、nh4cl 5.0g
·
l
‑1)，3.0ml22.5g
·
l
‑1的mgso4溶液(mgso4·
7h2o 46.125g
·
l
‑1)，1.0ml 0.25g
·
l
‑1的fecl3溶液(fecl3·
6h2o 0.42g
·
l
‑1)，1.0ml 36.4g
·
l
‑1的cacl2溶液(cacl2·
2h2o 48.22g
·
l
‑1)，1.0ml微量元素溶液(mnso4·
h2o 39.9mg
·
l
‑1，znso4·
h2o 42.8mg
·
l
‑1，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 34.7mg
·
l
‑1)混匀，ph 7.0～7.2，再用纯水定容至1l，121℃灭菌15min。
59.含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基：胰蛋白胨10.0g加入到1l的msm培养基中，ph7.0～7.2，121℃灭菌15min。
60.2.实验仪器与设备
61.立式压力蒸汽灭菌锅(bl
‑
50a，上海静科实业有限公司)、便携式ph计(phb
‑
4，上海精密科学有限公司)、离心机(centrifuge 5810r)、电热烘箱(dgg
‑
9070a，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(hh系列，常州国宇仪器制造有限公司)、冰箱(rcd
‑
205ag7，海信电器)、生化培养箱(pyx
‑
208s
‑
a，科力仪器)、超净工作台(sw
‑
cj
‑
1f，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(xw
‑
80a，上海精科实业有限公司)、mycycler pcr(美国bio
‑
rad公司)、电泳仪(dyy
‑
6c，北京六一仪器厂)、nano drop核酸蛋白定量检测仪(德国thermo)、凝胶成像系统(美国bio
‑
rad公司)、落地恒温振荡器(hzq
‑
211c)。
62.3.菌株富集筛选及分离纯化
63.(1)菌株的分离与纯化
64.称取采集的污染土壤1g，加至50ml含0.5mg
·
l
‑
1 cd
2+
和10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中驯化培养(即将cdcl2加入到含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中，使cd
2+
的终浓度为0.5mg
·
l
‑1)加入到含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中，使cd
2+
的终浓度为0.5mg
·
l
‑1)，驯化两天后以2％(v/v)的接种量转接至含1mg
·
l
‑
1 cd
2+
和10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基驯化，然后按2％(v/v)的接种量分别转接至cd
2+
浓度为2.5、5和10mg
·
l
‑
1 cd
2+
的含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中驯化。驯化筛选后，将菌液用培养基稀释至106、107、108和109倍，分别取稀释液0.2ml涂布于lb固体培养基，30℃培养至菌落形成；后将长出来的单菌落挑选出来，分离并纯化。
65.(2)菌株筛选
66.将步骤(1)分离纯化得到的纯化菌株接种到lb液体培养基中进行扩大培养20～24h。活化后按2％(v/v)的比例加至含有10mg
·
l
‑
1 cd
2+
的10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中，150rpm、30℃培养，6天后收集菌液。菌液以8000rpm离心10min，收集上清过0.22μm滤膜，滤液参考郑堃等
1.研究方法用火焰原子吸收光谱法(aas)进行测定(具体参考文献：郑堃，任宗玲，覃小泉，等.韶关工矿区水稻土和稻米中重金属污染状况及风险评价[j].农业环境科学学报.2018,37(5):915
‑
925.)，计算菌株对cd
2+
的去除速率(终浓度/初始浓度
×
100％)。筛选得到一株cd
2+
去除效率高于30％的菌株，将其命名为菌株s1。
[0067]
二、菌落形态特征观察
[0068]
菌株s1在lb培养基上生长较快，可在30～37℃生长。菌斑呈米白色、圆形凸起、光滑湿润且有光泽，在37℃培养24h后，菌落直径约2～2.5mm(图1)。可在cd
2+
浓度为10～80mg
·
l
‑1的含有10g
·
l
‑1蛋白胨的msm培养基中生长良好。
[0069]
2. 16s rdna扩增
[0070]
以提取的细菌总dna为模板，采用细菌16s rdna通用引物扩增，正向引物为27f：5'
‑
agagtttgatcctggctcag
‑
3'，反向引物为1492r：5'
‑
ggttaccttgttacgactt
‑
3'扩增16s rdna基因序列。
[0071]
pcr反应总体系为25μl：上、下游引物各2μl，模板dna 0.5μl，2
×
taq pcr master mix 12.5μl，无菌超纯至总体积25μl。
[0072]
pcr反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃补充延伸5min。pcr结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，选择dl 2000marker。凝胶成像系统下观察，其中在marker 1000bp与2000bp条带中间范围出现明显的亮带。
[0073]
3.16s rdna序列的测定
[0074]
pcr扩增后产物送北京睿博兴科生物技术有限公司(广州分公司)测序。得到菌株的16s rdna基因序列如下(seq id no.1)：
[0075]
ttagctacctacttcttttgcacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtagcattctgatctacgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgacatactttatgaggtccgcttgctctcgcgaggtcgcttctctttgtatatgccattgtagcacgtgtgtagccctactcgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccagtttatcactggcagtctcctttgagttcccggccggaccgctggcaacaaaggataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatttcacaacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcagagttcccgaaggcaccaaagcatctctgctaagttctctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgacttaacgcgttagctccggaagccacgcctcaagggcacaacctccaagtcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctgagcgtcagtctttgtccagggggccgccttcgccaccggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctacccccctctacaagactctagcctgccagtttcgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccgacttgacagaccgcctgcgtgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggtgcttcttctgcgagtaacgtcaatcgctaaggttattaaccttaacgccttcctcctcgctgaaagtactttacaacccgaaggccttcttcatacacgcggcatggctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtggctggtcatcctctcagaccagctagggatcgtcgcctaggtgagccattaccccacctactagctaatcccatctgggcacatctgatggcatgaggcccgaaggtcccccactttggtcttgcgacgttatgcggtattagctaccgtttccagtagttatccccctccatcaggcagtttcccagacattactcacccgtccgccgctcgtcacccgagagcaagctctctggctaccgctcga。
[0076]
上述序列由1381碱基(bp)组成。
[0077]
将获得的16s rdna基因序列提交至美国国立生物信息中心(ncbi)网页进行blast对比，与lpsn数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16s rdna
基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在美国国立生物信息中心(ncbi)网站上对扩增产物序列进行blast比对和同源性分析，采用mega 6.0软件，以neighbour
‑
joining法构建系统发育树。经16s rdna序列进行比较发现，菌株s1与产气克雷伯氏菌(klebsiella aerogenes)kctc 2190有99.86％的同源性(图2)。
[0078]
四、菌株s1鉴定为一种新功能菌株
[0079]
根据菌株s1菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株s1命名为产气克雷伯氏菌(klebsiella aerogenes)s1。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为gdmcc no：61041，该菌株于2020年6月3日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0080]
目前，国内外尚无文献报道产气克雷伯氏菌(klebsiella aerogenes)具有耐受重金属镉生长和去除镉的功能。因此，产气克雷伯氏菌s1为一株具有降低溶液中cd
2+
功能的新菌株。
[0081]
实施例2菌株s1在含有cd
2+
和蛋白胨的无机盐培养基中对cd
2+
的去除
[0082]
将菌株s1划线于lb平板上，30℃培养20h，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，30℃、150r
·
min
‑1的摇床中培养20h后按2％(v/v)的比例分别接种至cd
2+
浓度为10，20，40和80mg
·
l
‑1的含10g
·
l
‑1胰蛋白胨的msm培养基中培养，并于6d(天)后取样；以不添加菌株s1为对照(ck)，设3个重复试验。样液以80000r
·
min
‑1离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，过滤后用火焰原子吸收光谱法(aas)测定其cd
2+
的残留量(方法同实施例1)。
[0083]
培养6天后的cd
2+
去除效率如图3所示：结果表明，加入菌株s1后，cd
2+
浓度显著降低(空白对照的去除率为0，因此并未在图中标注)。cd
2+
的初始浓度为10，20，40和80mg
·
l
‑1时，cd
2+
去除效率分别为43.15％，42.77％，30.93％和40.95％。
[0084]
实施例3菌株s1的溶磷和解钾定性试验
[0085]
菌株s1的溶磷和解钾(溶磷解钾细菌(phosphate solubilizing bacteria)，意为将不可溶的磷元素和钾元素转变为可溶性的磷和钾元素)(具体参考文献：rawat,p.,das,s.,shankhdhar,d.,et al.,phosphate
‑
solubilizing microorganisms:mechanism and their role in phosphate solubilization and uptake[j].journal of soil science and plant nutrition.2020,https://doi.org/10.1007/s42729
‑
020
‑
00342
‑
7.)的功能定性试验：将画线于lb固体培养基菌株s1接种于lb液体培养基，于125～150rpm，28～30℃摇床振荡培养18～24h，然后分别点接于pko固体培养基和钾细菌固体培养基上，以及2％接种于pko液体培养基和钾细菌液体培养基上，设3个重复试验，置于30℃培养箱或者摇床(125～150rpm)中6d，观察培养基中菌落周围有难溶性磷化合物和钾矿物水解形成的透明圈，并观察其透明圈大小并拍照，以及测定溶液ph。根据水解圈来判断菌株是否有难溶性磷化合物和钾矿物的作用。其中，
[0086]
pko培养基配方：葡萄糖10g
·
l
‑1，(nh4)2so
4 0.5g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.1g
·
l
‑1，kcl 0.3g
·
l
‑1，mnso4·
4h2o 0.03g
·
l
‑1，feso
4 0.003g
·
l
‑1，ca3(po4)
2 5.0g
·
l
‑1，酵母粉0.5g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph 6.8～7.0(液体培养基不加琼脂粉)；
[0087]
钾细菌培养基配方：钾长石2.5g
·
l
‑1，na2hpo
4 0.2g
·
l
‑1，mgso4·
7h2o 0.02g
·
l
‑1，nacl 0.2g
·
l
‑1，caco
3 5.0g
·
l
‑1，caso4·
2h2o 0.1g
·
l
‑1，葡萄糖10g
·
l
‑1，琼脂粉20.0g
·
l
‑1，ph调至6.8～7.0(液体培养基不加琼脂粉)。
[0088]
结果如图4所示：菌株在pko培养基和解钾细菌固体培养基上出现水解圈，显示其具有溶解难溶性磷化合物(ca3(po4)2)或钾矿物(钾长石)，且溶液ph都下降至4.3左右。
[0089]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。