肠道菌群在神经损伤检测中的应用

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及肠道菌群在神经损伤检测中的应用。


背景技术：

2.中枢神经系统损伤(包括脑中风或称脑血管意外导致的脑损伤、创伤性脑损伤和脊髓损伤)是威胁人类健康的主要疾病。其导致严重的残疾失能和超乎寻常的高死亡率，以及巨额的医疗康复花费。对于中枢神经系统损伤的诊断，通常依靠x线头颅片、颅底断层摄片、ct扫描通过骨折线走向推断脑神经损伤；也可以通过mri颅底薄层扫描偶可见神经根肿胀、出血、断裂情况。总体而言，该检测方法存在操作难度大、花费高的缺陷，通常需要专业人员进行操作才能进行。
3.中枢神经系统损伤，特别是继发性神经损伤是一个复杂的病理生理变化过程，它不会仅由单个生物分子的改变所引起也不会仅导致单个生物分子的改变，其至少涉及到已证实的人类基因总数(2
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2.5万个基因)的1
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2％(即200
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500个基因)。创伤后因大量生物分子异常改变所引起整个细胞内生物网络的平衡失调才是导致神经细胞不可逆死亡的真正原因。因此，中枢神经系统损伤的发展过程应该是细胞内生物分子调节网络的失衡过程。这个调节网络由成千上万个生物分子(蛋白或基因)所构成，这些生物分子如同我们居住的大大小小城镇，通过类似于公路和铁路的生物信号传递通路相互连接在一起，形成一个完整的细胞内生物分子调节网络。在正常情况下，所有生物分子维持著相对稳定的状态(即不增高又不降低)，因而保持整个网络的相对平衡，这种相对平衡是人体细胞和组织发挥正常生理功能的重要基础。当中枢神经系统损伤后，数十个甚至数百个生物分子因此发生相应的改变(有的增高，有的降低)，从而破坏了整个网络系统的相对平衡，虽然人体自身的抵抗机制也不断试图恢复网络的平衡，若损伤造成的网络失衡的范围过大，强度过强，超自身的修复能力，则网络失衡将朝不可逆方向发展，最终导致体内肠道细菌失衡、细胞死亡和组织坏死等。
4.肠道细菌是指人肠道正常微生物，能够促进一些人体必需矿物质元素的吸收，生成多种人体生命活动所需要的维生素，利用现有的物质合成蛋白质等其他物质。对人体消化功能、抵抗疾病，以及神经调节之类意想不到的多种方面具有紧密的影响。根据不同细菌在总体中占有的比重，它们可以被分为主要与次要菌群。就人体肠道而言，细菌是其中的主要成分。其数目达到一百兆个，大约有五百至一千种不同的菌种。这些大量细菌大约可以分为三大类：有益细菌、中性细菌以及有害细菌。这个微型生态系统并非一直处于完全平衡的状态，它具有动态性，并且与人体状态有着密切关联.而一旦菌群失调，就很有可能会引起疾病，一些病情的加剧也是由于菌群引起的。从多种方面而言，肠道菌群的研究都是十分重要的。肠道菌群的检测主要是针对肠道内菌群的多少和类别进行测定。常见的方法有最基本的细菌培养，目前较为广泛的聚合酶链式反应技术、基于pcr基础上的16srdna指纹图谱技术。还有荧光原位杂交，基因芯片，宏基因组测序技术等一些新兴技术。
5.人体肠道中的微生物群落与宿主之间的关系极为密切，据研究，肠道菌群失调与
多种临床疾病密切相关。中国授权专利cn107586862b公开了肠道菌群在儿童反复呼吸道感染诊断中的应用，本发明通过对儿童反复呼吸道感染患者进行16srrna测序，首次发现了在患者中存在丰度差异的菌群。对差异菌群进一步分析，发现其用于疾病的诊断具有较高的敏感性和特异性，提示可以通过检测菌群的丰度实现儿童反复呼吸道感染的早期精确诊断。
6.目前，尚未有文献公开肠道菌群与神经损伤的关系。除免疫功能和营养状况的原因，肠道菌群在神经损伤过程中的作用并不明确，探究肠道菌群在神经损伤过程中的作用机制，寻找可用来进行神经损伤早期诊断的微生物标志物具有重要的意义。


技术实现要素：

7.基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于一种通过检测肠道菌群进行神经损伤检测的方案。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
8.本发明一方面涉及神经损伤检测试剂盒，其特征在于包括：检测铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌丰度的试剂中的至少一种、两种或者三种。
9.在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌丰度的试剂独立地选自所述菌的特异性引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
10.在本发明的一个优选实施方式中，所述的检测铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌丰度的试剂包括能够检测所述菌的16srrna引物。
11.本发明另一方面还涉及检测微生物丰度的试剂在制备诊断神经损伤的产品中的应用，其特征在于所述微生物选自绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌丰度的试剂中的至少一种、两种或者三种。
12.在本发明的一个优选实施方式中，所述神经损伤是指中枢神经损伤。
13.在本发明的另一个优选实施方式中，所述中枢神经神经为脑中风或称脑血管意外导致的脑损伤、创伤性脑损伤和脊髓损伤中的一种或者多种。
14.发明效果
15.本发明首次发现了特定菌群在神经损伤中的水平变化，通过检测特定菌群的变化，可以实现神经损伤的诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断，操作简单、特异性高、敏感性强。
附图说明
16.图1为示出铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌联合诊断的roc曲线的图。
具体实施方式
17.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
19.1、研究对象和样本收集
20.研究在温州医科大学附属第三医院治疗中心收集的45例中枢神经损伤患者(脑中风或称脑血管意外导致的脑损伤25例、创伤性脑损伤12例和脊髓损伤8例)和30例年龄、性别无显著性差别的健康对照组。
21.分别收集实验对象的粪便样本，将样本冰冻并保存在
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80℃冰箱内。详细记录患者的临床信息，包括性别、年龄等。本研究经本院伦理委员会审核与批准，并获得患者的知情同意。
22.2、dna抽提和测序
23.使用dna提取试剂盒自样本中提取dna，操作步骤按说明书进行。
24.采用transgen ap221
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02(transstart fastpfu dna polymerase)进行pcr扩增反应，全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，同一样本的pcr产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物，tris_hcl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
25.将pcr产物用quantifluortm
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st蓝色荧光定量系统(promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
26.使用truseqtm dna sample prep kit进行文库的构建，具体步骤按照说明书进行。
27.以dna片段为模板，pcr合成目标待测dna片段，cbot上进行桥式pcr扩增，生成dna簇，hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。
28.3、数据分析
29.3.1数据预处理
30.使用flash、trimmomatic等软件对miseq测序得到的pereads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用usearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多out，采用rdpclassifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的otu进行生物信息统计分析，并使用silva数据库进行比对。
31.3.2肠道菌群物种差异分析
32.使用wilcox秩和检验对两组的不同水平上的物种水平进行检验，估算每个物种丰度对差异效果影响的大小。
33.3.3肠道菌群的随机森林分析
34.使用r包randomforest(随机森林)，输入各样本的分组信息，以及每个样本的属的丰度，设置决策树为500，分析属在疾病中的重要性。
35.4、结果
36.结果显示，与健康人群相比，中枢神经损伤患者在铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌的水平呈现显著性差异(p＜0.05)。
37.实施例2荧光定量pcr验证相关菌群
38.1、对上述菌群进行大样本qpcr验证，按照实施例1中的样本收集方式收集健康人群和中枢神经损伤患者的粪便样本各30例。
39.2、粪便细菌dna的提取与定量
40.使用粪便基因组dna提取试剂盒自粪便标本中提取细菌dna，操作步骤按说明书进
行；
41.利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna测定所提粪便细菌总dna浓度与纯度，并将所有样品dna的质量浓度统一至100mg/l。
42.3、实时荧光定量pcr
43.1)引物设计与合成
44.根据细菌16srrna基因的v3
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v4区序列，对。设计特异性引物，并以16srrna通用引物作为参考基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
45.2)qpcr扩增检验
46.配置20μl反应体系：模板dna2μl，fast start universal sybr green master(rox)10μl，ddh2o7μl，浓度为10μm待检测细菌的上下游引物各0.5μl；反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃2min，共35个循环。
47.以sybr green作为荧光标记物，在light cycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。
48.3)roc曲线分析
49.使用r语言中的proc包分析铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，通过roc曲线确定auc值，结果如下表1所示。其中，铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌联合诊断的roc曲线如图1所示。
50.表1：诊断auc值
51.菌群auc值铜绿假单胞菌0.611韦荣球菌0.628消化链球菌0.631铜绿假单胞菌+韦荣球菌0.672铜绿假单胞菌+消化链球菌0.694韦荣球菌+消化链球菌0.677铜绿假单胞菌+韦荣球菌+消化链球菌0.758
52.结果显示，与健康人相比，神经损伤患者中的铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌呈现显著性差异(p<0.05)，同16srrna测序结果一致。铜绿假单胞菌、韦荣球菌和消化链球菌联合诊断的auc值为0.758，应用于神经损伤疾病具有较高的准确性。
53.以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。