人源化CD40基因改造动物模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用。
背景技术：
：近些年来，随着针对pd-1、ctla4等免疫检查点靶点药物的上市，肿瘤治疗正处于“免疫变革”的风口浪尖，肿瘤免疫治疗已经成为继放疗、化疗和靶向治疗后新的治疗方式。目前的肿瘤免疫治疗中最成功的是针对免疫检查点开发的药物，可以概括为两种主要类型：一种是利用靶向分子，解除免疫抑制性检查点分子对免疫系统杀伤肿瘤细胞的抑制作用，从而杀伤肿瘤；ctla-4抗体、pd-1抗体、pd-l1抗体等药物都属于这一类。另一种是利用靶向分子，激活有助于免疫系统杀伤肿瘤的免疫检查点激活性分子，使该类分子的肿瘤杀伤作用更有效，更持久；免疫激动剂就属于这类药物，是目前全球肿瘤免疫研发的新热点。cd40是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员，和ox40、4-1bb等均属于免疫刺激分子，是一个关键的免疫共刺激受体，其在各种免疫和非免疫细胞(包括b细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dc)、小胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞和角质形成细胞)表面组成型或诱导性表达。它的配体cd40l(cd154)在活化的cd4+t细胞表面瞬时表达，在自身免疫性疾病中也在其他类型细胞中表达。cd40和cd154在细胞表面相互作用后，通过在细胞内膜中募集tnfr相关因子(traf)促进细胞内信号传导，激活不同的信号通路，例如经典和非经典核因子κb通路、丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)和磷脂酶cγ通路等，参与机体的体液免疫和细胞免疫反应：在b细胞的活化、增殖与分化、抗体产生及ig类别转换中起关键作用，在t细胞活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起到重要调节作用。cd40-cd154之间的相互作用，可以通过活化先天免疫和适应性免疫，从而产生抗肿瘤免疫效果：树突状细胞上的cd40与t细胞上的cd154之间相互作用，导致t细胞活化；同时，cd40也会导致b细胞和巨噬细胞活化，进而导致中性粒细胞、nk细胞活化，最终激活t细胞，进而产生抗肿瘤效果。另外，cd40-cd154的相互作用，除了肿瘤免疫治疗外，也是其他免疫相关疾病的靶点，据报道，通过基因或抗体介入手段调节cd40-cd154的相互作用，对动脉硬化ra、克罗恩病、脑脊髓炎(eae)等在小鼠模型上都具有一定疗效作用。鉴于cd40靶点在先天性免疫和适应性免疫中的重要作用，据不完全统计，目前已有超过25种针对cd40靶点的药物进入临床，其中诺华、百时美施贵宝、艾伯维等药企的15种药物已经处于临床ii期阶段，涉及的适应症除了神经胶质瘤、非小细胞肺癌、胃癌、黑色素瘤等肿瘤外，还有银屑病、关节炎、克罗恩氏病等自身免疫系统疾病。因此，cd40靶点已经成为肿瘤免疫治疗和自身免疫疾病治疗的热门靶点。人类cd40基因在小鼠中的同源基因为cd40，两者具有相似的基因结构，但在氨基酸一致性方面，人源和鼠源cd40蛋白的氨基酸一致性只有61％，胞外区氨基酸序列的一致性只有59％，这种氨基酸序列一致性方面的差异很可能导致针对人的cd40靶点的药物无法识别小鼠的cd40靶点，无法利用野生型小鼠对药物进行体内药效评价。另外，免疫疗法治疗癌症虽有一定成效，但若免疫应答程度过强，会对健康组织造成很大的伤害，造成免疫毒副反应，因此在进行药效评价的同时也需要对受试药物的毒性安全性等方面进行严格的筛选。但常用的野生型小鼠，因为人鼠靶点差异，药物无法识别小鼠体内的靶点，也不适合于毒性和安全性评价。为了减少人鼠之间的这种差异，对野生型小鼠进行人源化改造可以很好的‘再现’人体的微环境，在用于药效评价的同时，也可以应用于对药物的毒性和安全性评价。目前，人源化小鼠模型已经广泛应用于肿瘤、病毒感染等疾病研究领域。技术实现要素：利用基因修饰的手段对靶点分子进行人源化改造，建立人源化动物模型研究人类疾病可以很好的解决人类和动物之间的靶点差异问题：经过基因修饰以后，人源化模式动物体内可以全部或部分的表达相应的人类蛋白，模仿人体疾病发生时各种分子之间的相互作用，重现人体疾病的特征，大大缩小临床前动物模型和人体之间的差异，使药物筛选在动物整体水平的筛选研究成为可能；同时，该类模型使我们可以在免疫系统正常的模型上，对药物的毒性和药物代谢进行评价，可以更好的贴合临床药物功效，提高药物筛选成功的概率。本发明的目的在于提供一种人源化cd40基因改造动物细胞的构建方法、人源化cd40基因改造动物细胞、人源化cd40基因改造动物模型的构建方法以及由该方法制得的人源化cd40基因改造动物模型的应用、来源于人源化cd40基因改造动物模型或其子代的细胞或细胞系或细胞培养物的细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官及其应用、嵌合cd40蛋白、编码所述嵌合cd40蛋白的嵌合cd40基因、包含所述嵌合cd40蛋白的重组载体、包含所述重组载体的细胞、包含所述细胞的组织，以加速与人cd40基因或蛋白相关的领域的研究进展。为实现以上目的，本发明首先提供一种人源化cd40基因改造动物细胞的构建方法，包括：将非人动物细胞内的非人源cd40基因的第2号到第5号外显子的序列替换为人cd40基因的第2号到第5号外显子的序列，形成人源化cd40基因，得到人源化cd40基因改造动物细胞；优选的，所述非人动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠；优选的，所述细胞为受精卵。具体的，鼠cd40蛋白的第2号到第5号外显子的序列为胞外区。进一步优选的，所述小鼠为c57bl/6小鼠。在一些实施例中，所述人源化cd40基因改造动物细胞的构建方法包括：提供人cd40基因同源重组载体、sgrna以及cas9的混合物，所述cas9包括cas9mrna和/或cas9蛋白，将所述混合物导入所述非人动物细胞中。具体的，可以通过显微注射的方法来将所述混合物导入所述非人动物细胞中。在一些实施例中，所述sgrna的5’端靶位点位于小鼠cd40基因的1号内含子中，所述sgrna的3’端靶位点位于小鼠cd40基因的5号内含子中。优选的，所述sgrna靶向的5’端靶位点的序列如seqidno：18-27任一项所示，所述sgrna靶向的3’端靶位点的序列如seqidno：28-37任一项所示；更优选的，所述sgrna靶向的5’端靶位点的序列如seqidno：22所示，所述sgrna靶向的3’端靶位点的序列如seqidno：36所示。在一些实施例中，所述人cd40基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人cd40基因片段及3’同源臂；优选的，所述人cd40基因片段的序列如seqidno：11所示；优选的，所述5’同源臂的序列如seqidno：9所示，所述3’同源臂的序列如seqidno：10所示。在一些实施例中，所述人源化cd40基因选自下列组中的至少一种：(a)所述人源化cd40基因的cds编码序列如seqidno：6所示；(b)所述人源化cd40基因转录的mrna序列如seqidno：7所示；(c)所述人源化cd40基因编码的蛋白序列如seqidno：8所示。本发明还提供一种人源化cd40基因改造动物细胞，所述人源化cd40基因改造动物细胞由上述人源化cd40基因改造动物细胞的构建方法获得。本发明还提供一种人源化cd40基因改造动物模型的构建方法，将上述人源化cd40基因改造动物细胞或者由所述人源化cd40基因改造动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到f0代动物；对f0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的f0代阳性动物。在一些实施例中，所述人源化cd40基因改造动物模型的构建方法还包括：将所述f0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子动物自交获得纯合子动物，建立稳定的人源化cd40基因改造动物品系。本发明还提供一种细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官，所述细胞、细胞系或细胞培养物、组织或器官来源于人源化cd40基因改造动物模型或其子代，所述人源化cd40基因改造动物模型由上述人源化cd40基因改造动物模型的构建方法获得。具体的，所述组织或器官可以为脾脏、肿瘤或其培养物。本发明还提供上述人源化cd40基因改造动物模型的构建方法获得的人源化cd40基因改造动物模型、来源于所述人源化cd40基因改造动物模型的细胞、细胞系或细胞培养物、组织、器官在与人cd40基因或蛋白相关的领域中的应用；可选的，所述应用包括人cd40基因功能研究、人cd40抗体研究、针对人cd40靶位点的药物制备和药效研究中的至少一种。优选的，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人cd40信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究cd40基因功能研究、人cd40抗体、针对人cd40靶位点的药物、药效研究、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。本发明还提供一种嵌合cd40蛋白，所述嵌合cd40蛋白选自下列组中的一种：a)所述嵌合cd40蛋白的序列为seqidno：8所示的氨基酸序列；b)所述嵌合cd40蛋白的序列与seqidno：8所示的氨基酸序列的同一性程度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；c)所述嵌合cd40蛋白的序列与seqidno：8所示的序列的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸；d)所述嵌合cd40蛋白的序列为将seqidno：8所示的序列经过取代和/或缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基且具有相同功能的氨基酸序列。具体的，取代和/或缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入。本发明还提供一种编码上述嵌合cd40蛋白的嵌合cd40基因，所述嵌合cd40基因选自下列组中的一种：a)所述嵌合cd40基因的cds序列为seqidno：6所示的核苷酸序列；b)所述嵌合cd40基因的mrna序列为seqidno：7所示的核苷酸序列；c)所述嵌合cd40基因的cds序列与seqidno：6所示的核苷酸序列的同一性程度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；d)所述嵌合cd40基因的cds序列与seqidno：6所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸；e)所述嵌合cd40基因的cds序列具有将seqidno：6所示的序列经过取代和/或缺失和/或插入一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列；f)所述嵌合cd40基因中来源于人cd40基因的部分为seqidno：11所示的核苷酸序列；g)所述嵌合cd40基因中来源于人cd40基因的部分与seqidno：11所示的核苷酸序列的同一性程度至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；h)所述嵌合cd40基因中来源于人cd40基因的部分与seqidno：11所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸；i)所述嵌合cd40基因中来源于人cd40基因的部分为将seqidno：11所示的系列经过取代和/或缺失和/或插入一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列。具体的，取代和/或缺失和/或插入一个或多个核苷酸是指不多于十个核苷酸的取代和/或缺失和/或插入。本发明还提供一种含有上述嵌合cd40基因的重组载体。具体的，所述重组载体可以为克隆载体或者表达载体。本发明还提供一种包含上述重组载体的细胞。本发明还提供一种包含上述细胞的组织。本发明的有益效果：本发明成功制备cd40基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达人源化cd40蛋白，可用于cd40基因功能研究、人源cd40抗体的筛选和评价。利用本发明制备的动物模型可用于针对人cd40靶位点的药物筛选、药效研究、免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究cd40蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。进一步的，本发明构建的人源化cd40小鼠，将小鼠cd40基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠拥有人源胞外区，可筛选人源cd40靶点药物，而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。图1为鼠cd40与人cd40基因的对比示意图。图2为改造后的人源化小鼠cd40基因示意图。图3为对小鼠cd40基因进行人源化改造的打靶方案示意图。图4为本发明实施例4的酶切结果示意图；1：xbai酶切鉴定结果，理论条带大小应为6.3kb、4.2kb、3.3kb、2.3kb；m：1kbdnaladder。图5a为本发明实施例5中一部分sgrna的活性检测结果，其中1-10表示sgrna1～sgrna10，con表示未经sgrna处理的样品，m为dnamarker。图5b为本发明实施例5中另一部分sgrna的活性检测结果，其中11-20表示sgrna11～sgrna20，con表示未经sgrna处理的样品，m为dnamarker。图6为本发明实施例6中sgrna体外转录产物的电泳结果示意图。图7为本发明实施例8中f0代小鼠的pcr鉴定结果示意图。a图为f0代小鼠5’同源臂的pcr鉴定结果；b图为f0代小鼠3’同源臂的pcr鉴定结果；数字表示f0代小鼠编号；m为1kbdnamarker。图8为本发明实施例8中f1代小鼠的pcr鉴定结果示意图。a图为f1代小鼠5’同源臂的pcr鉴定结果；b图为f1代小鼠3’同源臂的pcr鉴定结果；数字表示f0代小鼠编号；m为1kbdnamarker。图9为本发明实施例9中的rna水平验证野生型和人源化小鼠中鼠源、人源cd40蛋白表达结果。图10为本发明实施例10中的流式细胞术检测野生型小鼠和cd40人源化纯合子小鼠的外周血b细胞中cd40蛋白的表达。hcd40为针对人源cd40流式抗体；mcd40为针对鼠源cd40流式抗体。wildtype：野生型小鼠；homozygous：人源化纯合子小鼠。图11为本发明实施例10中的流式细胞术检测cd40人源化纯合子小鼠骨髓b细胞、t细胞、巨噬细胞和树突细胞中鼠源、人源cd40表达结果。hcd40为针对人源cd40流式抗体；mcd40为针对鼠源cd40流式抗体。图12为本发明实施例11中针对人源cd40抗体抗肿瘤药效肿瘤体积抑制结果和小鼠体重变化结果。图13为本发明实施例11中针对人源cd40抗体抗肿瘤药效肿瘤重量抑制结果和肿瘤照片。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器包括：引物合成和测序服务购自生工生物工程(上海)股份有限公司；in-fusionhdcloningkits购自takara，货号为639650；xbai限制性内切酶购自neb，货号为r0145v；sgrna体外转录试剂盒购自ambion，货号为am1354；大肠杆菌dh5α感受态细胞购自takara公司，货号为9057；cas9mrna来源sigmaaldrich，货号为cas9mrna-1ea；c57bl/6、icr小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司；t7核酸内切酶i检测试剂盒，购自neb公司，货号为m0302s；pcr产物凝胶回收试剂盒为qiaquickgelextractionkit，购自qiagen，货号为28706。流式抗体信息如下：抗体名称货号供应商fitcanti-mousecd45103108biolegendpe/cyanine7anti-mousecd11b101216biolegendbv421anti-mousef4/80565411bdbiosciencesbv711anti-humancd40563397bdbiosciencesapcanti-mousecd40130-110-547miltenyibiotec实施例1序列设计小鼠的cd40基因和人的cd40基因均含有多个转录本，本实施例的序列设计主要以其中一个转录本为例进行阐述。即，将小鼠cd40基因(ncbigeneid：21939)第2到第5号外显子(基于ncbi登录号为nm_011611.2→np_035741.2的转录本，其mrna序列如seqidno：1所示，对应的蛋白序列如seqidno：2所示)用人cd40基因(geneid：958)的第2到第5号外显子替换(基于ncbi登录号为nm_001250.6→np_001241.1的转录本，其mrna序列如seqidno：3所示，对应的蛋白序列如seqidno：4所示)，其中，鼠cd40与人cd40基因对比示意图见图1，最终得到的改造后的人源化小鼠cd40基因示意图见图2，人源化后小鼠cd40基因的基因组dna序列(嵌合cd40基因dna)如seqidno：5所示：seqidno：5仅列出涉及改造部分的dna序列，其中斜体下划线区域为插入的人cd40基因序列，正常斜体为小鼠cd40基因内含子5的部分序列，加粗斜体是为了引入人源cd40基因序列引入的其他序列，两侧的正常序列为未改造的小鼠基因组序列。改造后的人源化小鼠cd40的cds区、mrna序列及其编码的蛋白序列分别如seqidno：6、seqidno：7和seqidno：8所示。鉴于人cd40基因和小鼠cd40基因有多个转录本，本实施例中的人源化序列设计的方法同样适用于其它转录本的人源化改造。可将上述小鼠cd40基因的转录本替换为其他转录本。实施例2重组载体pbr322-cd40的设计及构建根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、人cd40基因片段、3’同源臂的载体。其中5’同源臂(seqidno：9)为ncbi登录号为nc_000068.8的第164899679-164904205位核苷酸，3’同源臂(seqidno：10)为ncbi登录号为nc_000068.8的第164905758-164909778位核苷酸，人cd40(seqidno：11)基因片段为ncbi登录号为nc_000020.11的第46121820-46123219位核苷酸。载体的构建过程如下：设计扩增3段同源重组片段(la、ki、ra)的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应la片段，人cd40基因片段等插入序列对应ki片段，3’同源臂对应ra片段，引物序列如下：la(4542bp)：f：5’-cgcggtcgacaagctaagaacaaagtctgcccttg-3’(seqidno：12)；r：5’-ctaaaaacagaagtggacag-3’(seqidno：13)。ki(1710bp)：f：5’-cacttctgtttttaggtccatccagaaccacccac-3’(seqidno：14)；r：5’-ctcttgcttactgtcccttctcgagtaaagcaactgtctcgcttctgagtacgagtgtcatg-3’(seqidno：15)。ra(4051bp)：f：5’-gacagtaagcaagagtatgtgtatgtgtgcatgtg-3’(seqidno：16)；r：5’-cgactctagaggatcccccagctatcttcttactt-3’(seqidno：17)。以c57bl/6小鼠基因组dna或bac文库为模板pcr扩增获得la、ra片段，以全基因的人cd40基因片段等敲入片段为模板，pcr扩增获得ki片段。通过in-fusion试剂盒将片段连接到pbr322-mcs质粒上，最终获得载体pbr322-cd40。实施例3载体pbr322-cd40的验证随机挑选5个pbr322-cd40克隆，使用限制性内切酶xbai进行酶切验证，酶切产物电泳应出现6.3kb、4.2kb、3.3kb、2.3kb大小片段。酶切结果见图4。质粒酶切结果均符合预期，表明质粒酶切验证结果正确。质粒经测序公司测序验证正确，进行后续实验。实施例4cd40基因sgrna设计sgrna靶序列决定了其靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。根据打靶方案，设计并合成识别5’端靶位点(sgrna1-sgrna10)、3’端靶位点(sgrna11-sgrna20)的sgrna序列。以小鼠为例，根据cd40基因的功能和序列特征，5’端靶位点位于小鼠cd40基因内含子1中，3’端靶位点位于小鼠cd40基因内含子5中，各sgrna在cd40基因上的靶位点序列如下：sgrna-1靶位点序列(seqidno：18)：5’-acctctccctaaccaatgacagg-3’；sgrna-2靶位点序列(seqidno：19)：5’-cctctccctaaccaatgacaggg-3’；sgrna-3靶位点序列(seqidno：20)：5’-cctgactttccccacccccatgg-3’；sgrna-4靶位点序列(seqidno：21)：5’-gactttccccacccccatggtgg-3’；sgrna-5靶位点序列(seqidno：22)：5’-ctcccaaagacgcagcaggtagg-3’；sgrna-6靶位点序列(seqidno：23)：5’-ggtgaatgtgaccttgtggctgg-3’；sgrna-7靶位点序列(seqidno：24)：5’-accttgtggctggcttaagg-3’；sgrna-8靶位点序列(seqidno：25)：5’-tgaccttgtggctggcttaaggg-3’；sgrna-9靶位点序列(seqidno：26)：5’-cttagttaatagaagcctgttgg-3’；sgrna-10靶位点序列(seqidno：27)：5’-cccttttcagttcactttcttgg-3’；sgrna-11靶位点序列(seqidno：28)：5’-ttttcagttcactttcttggtgg-3’；sgrna-12靶位点序列(seqidno：29)：5’-tttcagttcactttcttggtggg-3’；sgrna-13靶位点序列(seqidno：30)：5’-ctccctacctgctgcgtctttgg-3’；sgrna-14靶位点序列(seqidno：31)：5’-ccaagaaagtgaactgaaaaggg-3’；sgrna-15靶位点序列(seqidno：32)：5’-gtgcatctgttcggattagaggg-3’；sgrna-16靶位点序列(seqidno：33)：5’-ctttaagaagagacttcaagagg-3’；sgrna-17靶位点序列(seqidno：34)：5’-gaagagacttcaagaggatatgg-3’；sgrna-18靶位点序列(seqidno：35)：5’-aagaggatatggagaccaacagg-3’；sgrna-19靶位点序列(seqidno：36)：5’-tgtcccttaagccagccacaagg-3’；sgrna-20靶位点序列(seqidno：37)：5’-caccagtaagtgacccaccatgg-3’。实施例5针对不同靶位点sgrna筛选利用试剂盒检测多个sgrna的活性。使用t7核酸内切酶i检测试剂盒检测，检测结果参见图5a和图5b，从结果可见sgrna具有不同活性，从中优先选择sgrna-5和sgrna-19为后续实验的sgrna。实施例6sgrna体外转录sgrna的合成通过体外pcr扩增sgrna模板，以该模板为底物，利用hiscribetmt7highyieldrnasynthesiskit试剂盒进行体外转录。sgrna-5和sgrna-19的体外转录模板dna的pcr引物分别为：sgrna-f4(seqidno：38)：5’-gctaatacgactcactatagctcccaaagacgcagcaggtgttttagagctagaaatagcaag-3’；sgrna-f18(seqidno：39)：5’-gctaatacgactcactatagccaagaaagtgaactgaaaagttttagagctagaaatagcaag-3’。下游pcr通用引物为：sgrna-r(seqidno：40)：5’-aaaagcaccgactcggtgcc-3’。由dna合成公司合成含有sgrnascaffold的片段dna，序列信息为：sgrnascaffold(seqidno：41)：5’-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt-3’。使用含有sgrnascaffold的片段dna作为模板，四条引物(sgrna-f4和sgrna-r、sgrna-f18和sgrna-r)分别扩增出产物，利用凝胶回收试剂盒，回收pcr产物作为转录模板。根据体外转录试剂盒操作说明体外转录sgrna-5和sgrna-19。体外转录产物电泳结果见图6。实施例7受精卵显微注射及胚胎移植取c57bl/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的sgrna-5、sgrna-19(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书提供方法进行转录)、cas9mrna和pbr322-cd40质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体icr母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，f0代)。将获得的f0代小鼠通过与野生型小鼠杂交，扩大种群数量，然后自交获得纯合子小鼠，建立稳定的hcd40人源化小鼠品系。实施例8cd40人源化小鼠的鉴定1、f0代同源重组阳性小鼠基因型鉴定：分别使用两对引物对得到的f0代hcd40小鼠的鼠尾基因组dna进行pcr鉴定，引物i位于5’同源臂左侧，引物iv位于3’同源臂右侧，引物ii和引物iii均位于插入的片段上，具体序列如下：5’同源臂重组鉴定引物：引物i：5’-ttcctttcgcagaggtggtct-3’(seqidno：42)；引物ii：5’-ctcttgcttactgtcccttctcg-3’(seqidno：43)。pcr反应体系(20μl)如表1所示：表1pcr反应体系(20μl)反应组分体积(μl)ddh2o11.45×primestargxlpcrbuffer42.5mmdntp2primeri(10pmol/μl)0.4primerii(10pmol/μl)0.4primestargxldnapolymerase*0.8genomicdna1总计20pcr扩增反应条件如表2所示：表2pcr扩增反应条件步骤#温度(℃)时间备注1943min-29815sec-36415sec-4682min重复步骤2-435个循环5685min-612-保温3’同源臂重组鉴定引物：引物iii：5’-cagaagcgagacagttgctttact-3’(seqidno：44)；引物iv：5’-ttactttgtggcactggtctaacc-3’(seqidno：45)。pcr反应体系(20μl)如表3所示：表3pcr反应体系(20μl)反应组分体积(μl)ddh2o11.45×primestargxlpcrbuffer42.5mmdntp2primeriii(10pmol/μl)0.4primeriv(10pmol/μl)0.4primestargxldnapolymerase*0.8genomicdna1总计20pcr扩增反应条件如表4所示：表4pcr扩增反应条件如果重组载体插入位置正确，5’同源臂鉴定引物对i和ii，应只有1条6.5kb长度的pcr条带，3'同源臂鉴定引物对iii和iv，应有1条4.3kb长度的pcr条带；阴性小鼠应均无条带。f0代小鼠pcr鉴定结果见图7，其中编号为5、7、9的3只小鼠为阳性小鼠。2、f1代小鼠基因型鉴定：将f0代阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到f1代小鼠。对f1代鼠尾基因组dna进行pcr鉴定。pcr条件及引物同f0代小鼠基因型鉴定。f1代小鼠pcr实验结果见图8，显示有11只f1代小鼠为阳性，具体编号为2、3、6、7、10、11、15、16、19、20、23。将获得的f1代小鼠分别与野生型小鼠交配，扩繁种群。同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠。实施例9人源化小鼠cd40rna表达分析选取两只野生型小鼠和一只hcd40纯合子小鼠(6周龄)抽提脾脏和胸腺总rna，利用反转录试剂盒，反转录为cdna后进行pcr，主要验证两方面内容：1)验证人源片段插入的人源化改造是否影响cd40基因的正常剪切；2)验证人源化小鼠中人源插入片段是否表达。针对实验目的，分别设计了3对pcr引物，引物大体位置如图9，a所示，p1/p2引物对和p3/p4引物对针对人源化的cd40mrna，引物p1和p4位于未人源化的外显子上，引物p2和p3位于人源化的外显子上，p1/p2引物对可以对人源化改造后外显子1和外显子2是否发生正确剪切进行判断，p3/p4引物对可以对人源化改造后外显子5和外显子6是否发生正确剪切进行验证，同时引物对p1/p2和p3/p4也可以反映人源化小鼠中的人源cd40序列是否表达。引物对p5/p6位于小鼠cd40基因上对应的被人源化替换的区域，该引物对可以用于鉴定cd40人源化纯合子小鼠中是否有鼠源未人源化的mrna表达。引物对p1/p2序列为：p1：5’-ccctgtgatttggctcttct-3’(seqidno：46)；p2：5’-ggtgtctaggaattcgctttca-3’(seqidno：47)。引物对p3/p4序列为：p3：5’-gaaggctggcactgtacg-3’(seqidno：48)；p4：5’-cattagtctgactcgttcctttct-3’(seqidno：49)。引物对p5/p6序列为：p5：5’-acaaacagtacctccacgatg-3’(seqidno：50)；p6：5’-ttcttaacccgaagcccttg-3’(seqidno：51)。引物对p1/p2、p3/p4、p5/p6的pcr反应条件如下：pcr反应体系为20μl，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，55sec，35个循环)；72℃，5min；12℃保温。引物对p1/p2、p3/p4、p5/p6的pcr反应结果如图9，b所示：p1/p2引物对和p3/p4引物对在野生型小鼠样品中无pcr产物扩增出，在人源化纯合子小鼠样品中分别可以扩增出244bp和232bp的pcr产物，这说明野生型小鼠中检测不到人源cd40mrna的表达，而在人源化纯合子小鼠中可以检测到人源cd40mrna的活跃表达；p5/p6引物对在野生型小鼠样品中可以扩增出196bp的pcr产物，而在人源化纯合子小鼠中无pcr产物扩增出，说明在人源化纯合子小鼠中检测不到针对人源化区域鼠源rna的表达，人源化策略是成功的。实施例10人源化小鼠cd40蛋白水平表达分析正常情况下，cd40表达于b细胞、巨噬细胞、树突状细胞、血管内皮细胞等，为了验证人源化小鼠cd40蛋白的表达，我们分别对野生型小鼠和人源化纯合子小鼠外周血b细胞上鼠源和人源cd40的表达，以及人源化纯合子小鼠骨髓b细胞、t细胞、巨噬细胞和树突状细胞上鼠源和人源cd40的表达进行了检测，简要过程及结果如下：1)杂合子小鼠自交获得cd40人源化纯合子小鼠和野生型小鼠，选取一只hcd40纯合子小鼠，一只同窝野生型小鼠(6-7周龄)，眼内眦取外周血，经裂解红细胞后，加入抗体孵育后，进行流式细胞术检测。流式细胞术圈选活细胞后，利用针对鼠源cd45和cd19的抗体，分选出b细胞，然后分别利用针对鼠源cd40(mcd40)和人源cd40(hcd40)的抗体检测b细胞上cd40蛋白的表达，结果如图10所示，结果显示：在野生型小鼠b细胞上只能检测到鼠源cd40蛋白的表达，检测不到人源cd40蛋白的表达；在cd40人源化纯合子小鼠的b细胞上，只能检测到人源cd40蛋白的表达，检测不到鼠源cd40蛋白的表达。2)杂合子小鼠自交获得cd40人源化纯合子小鼠，纯合子小鼠取骨髓细胞，经裂解红细胞后，加入抗体孵育后，进行流式细胞术检测。流式细胞术圈选活细胞后，利用针对鼠源cd45的抗体圈选出cd45阳性细胞，然后分别用针对cd19的抗体和针对cd3的抗体圈选出b细胞和t细胞；在cd3/cd19阴性的细胞中，利用针对f4/80抗体和针对cd11b抗体圈选出巨噬细胞；利用针对cd11c和针对ia-ie的抗体圈选出树突状细胞。在上述细胞类型中，分别用针对鼠源和人源cd40的抗体，检测cd40蛋白的表达，结果如图11所示，正常情况下，人源化纯合子小鼠的b细胞、巨噬细胞和树突状细胞上均能检测到人源cd40蛋白的活跃表达，检测不到鼠源cd40蛋白的表达，在t细胞上无cd40蛋白的表达。实施例11cd40人源化动物模型体内药效验证通过杂合子小鼠交配获得cd40人源化纯合子小鼠和野生型小鼠，进行体内药效验证实验，实验分组和给药情况如下表所示：6-8周龄cd40人源化小鼠和c57bl/6野生型小鼠皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38(1×106/100μlpbs)，待肿瘤生长至体积约100立方毫米时，cd40人源化小鼠随机分为组1、3、4、5。组1为对照组；组2、3、4、5为给药组，分别给予针对人源cd40靶点的抗体药物(selicrelumab类似物)。每周分别在第三天和第七天共测量肿瘤体积和小鼠体重2次，3周结束试验。以肿瘤体积为指标的肿瘤生长抑制结果如图12，a所示：6次给药后，到21天实验结束时，相对于组1(对照组-生理盐水组)，在同样给药剂量(10mg/kg)情况下，针对人源cd40靶点的抗体药物在组2c57bl/6野生型小鼠上未见到明显的肿瘤抑制效果：肿瘤抑制率(tgi)为7.98％；而在cd40人源化纯合子小鼠上可以观察到非常显著的肿瘤抑制效果：肿瘤抑制率(tgi)为86.23％，差异显著性p值为0.00135；人源化小鼠给药组：组3、组4和组5对肿瘤显示出明显的肿瘤抑制效果；同时，针对人源cd40靶点的抗体药物在组3、4、5之间，呈现出一定的剂量效应，组4和组5(两个低剂量给药组)的肿瘤抑制效果明显低于组3(高剂量给药组)。给药过程中各组的体重检测结果(图12，b)和肿瘤体积为指标的肿瘤生长抑制结果类似，组2和组1之间无显著性的差异，组3相对于组1呈现出显著性的体重抑制；体重检测结果在组3、4、5之间，呈现出一定的剂量效应，组4和组5(两个低剂量给药组)对体重的影响明显低于组3(高剂量给药组)。为了对以肿瘤体积为指标的肿瘤生长抑制结果进一步确认，在实验最后一天，解剖各荷瘤组小鼠肿瘤，对各组小鼠的肿瘤重量进行了比较，数据如下表所示，分析结果如图13，a所示。各组小鼠的肿瘤重量比较结果，和各组肿瘤体积大小比较结果类似：相对于组1(对照组-生理盐水组)，在同样给药剂量(10mg/kg)情况下，针对人源cd40靶点的抗体药物在组2的c57bl/6野生型小鼠上未见到明显的肿瘤抑制效果：肿瘤抑制率为11.70％，p值为0.572，无显著性差异；而在cd40人源化纯合子小鼠上可以观察到非常显著的肿瘤抑制效果：肿瘤抑制率为85.48％，差异显著性p值为0.00173；组3、组4和组5对肿瘤显示出明显的肿瘤抑制效果；同时，针对人源cd40靶点的抗体药物在组3、4、5之间，呈现出一定的剂量效应，组4和组5(两个低剂量给药组)的肿瘤抑制效果明显低于组3(高剂量给药组)。以上结果显示，对小鼠体内cd40基因人源化后，可以为针对人源cd40靶点的抗体药物(selicrelumab类似物)所识别，并且在高中低剂量均显示出明显的抗肿瘤效果，并且表现出剂量依赖性；而在野生型小鼠上，因为鼠源cd40靶点不能为selicrelumab类似物所识别，因此无抗肿瘤效果。因此，cd40人源化小鼠模型可以作为针对人源cd40靶点的抗体药物抗肿瘤药效评价模型进行应用。本发明实施例提供了一个制备cd40人源化小鼠模型的方法，并对其的应用进行了验证。该方法建立的cd40人源化小鼠提供了一个可转化的模型，其具有人源化的cd40受体和具有功能性的小鼠免疫系统，具有如下优势：1)可用于在体内测试特异性针对人cd40靶点的激动性抗体或者其他分子的药物效果；2)可以在体内评估针对cd40靶点药物的毒性和安全性；3)相较于非人灵长类等模型，该模型提供了一个更加经济高效的体内研究模型选择。序列表<110>上海南方模式生物科技股份有限公司上海砥石生物科技有限公司广东南模生物科技有限公司<120>人源化cd40基因改造动物模型的构建方法及应用<130>pa20036832<160>51<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1683<212>rna<213>小鼠(mouse)<400>1agcagggacuuuggagugacuuguggcuucagcaggagcccugugauuuggcucuucuga60ucucgcccugcgauggugucuuugccucggcugugcgcgcuauggggcugcuuguugaca120gcgguccaucuagggcaguguguuacgugcagugacaaacaguaccuccacgauggccag180ugcugugauuugugccagccaggaagccgacugacaagccacugcacagcucuugagaag240acccaaugccacccaugugacucaggcgaauucucagcccaguggaacagggagauucgc300ugucaccagcacagacacugugaacccaaucaagggcuucggguuaagaaggagggcacc360gcagaaucagacacugucuguaccuguaaggaaggacaacacugcaccagcaaggauugc420gaggcaugugcucagcacacgcccuguaucccuggcuuuggaguuauggagauggccacu480gagaccacugauaccgucugucaucccugcccagucggcuucuucuccaaucagucauca540cuuuucgaaaaguguuaucccuggacaagcugugaggauaagaacuuggagguccuacag600aaaggaacgagucagacuaaugucaucugugguuuaaagucccggaugcgagcccugcug660gucauuccugucgugaugggcauccucaucaccauuuucgggguguuucucuauaucaaa720aagguggucaagaaaccaaaggauaaugagaucuuacccccugcggcucgacggcaagau780ccccaggagauggaagauuaucccggucauaacaccgcugcuccagugcaggagacgcug840cacgggugucagccugucacacaggaggaugguaaagagagucgcaucucagugcaggag900cggcaggugacagacagcauagccuugaggccccuggucugaacccuggaacugcuuugg960aggcgauggcucggcucgggagcaggggccuggcucugaggacugcuugcugaccuuuga1020aguuugagaugagccaagacagagcccagugcagcuaacucucaugccugcccccuauca1080uuucucaacuugcuuuuuaaggauggagggagagcucgggcaucggggguccacagugau1140accuaccaagugcagcagugcaggacccagagucgucuugcugcggcguucacuguaagg1200agucauggacacaggaguccguggcccacagcuugugcugcuagagggcaccugguugcc1260caucagcaggguacuggcuaaauaaaucuguaauuauuuauacaaugacaucucagaaac1320ucuagcagguggggcagaaaacagguaguagaaugauggguagagaaauagcuuuuaaaa1380cacauuccaaggcagguaagauggcuuuugugaguaaaggagcuugcugcccaaacccgg1440uuaccugauuuugaucccugggacuucaugguaaaagggagagaaccaaauccagagggu1500ugucauuugaccuccaugugugcucugugguaauguaccccgugugugcacaugugcaca1560uauccuaaaauggauguggugguguauuguagaaauuauuuaaucccgcccugggguuuc1620uaccuguguguuaccauuuaguucuugaauaaaagacacacucaaccuuuauauuuacaa1680uaa1739<210>2<211>289<212>prt<213>小鼠(mouse)<400>2metvalserleuproargleucysalaleutrpglycysleuleuthr151015alavalhisleuglyglncysvalthrcysserasplysglntyrleu202530hisaspglyglncyscysaspleucysglnproglyserargleuthr354045serhiscysthralaleuglulysthrglncyshisprocysaspser505560glyglupheseralaglntrpasnarggluileargcyshisglnhis65707580arghiscysgluproasnglnglyleuargvallyslysgluglythr859095alagluseraspthrvalcysthrcyslysgluglyglnhiscysthr100105110serlysaspcysglualacysalaglnhisthrprocysileprogly115120125pheglyvalmetglumetalathrgluthrthraspthrvalcyshis130135140procysprovalglyphepheserasnglnserserleupheglulys145150155160cystyrprotrpthrsercysgluasplysasnleugluvalleugln165170175lysglythrserglnthrasnvalilecysglyleulysserargmet180185190argalaleuleuvalileprovalvalmetglyileleuilethrile195200205pheglyvalpheleutyrilelyslysvalvallyslysprolysasp210215220asngluileleuproproalaalaargargglnaspproglnglumet225230235240gluasptyrproglyhisasnthralaalaprovalglngluthrleu245250255hisglycysglnprovalthrglngluaspglylysgluserargile260265270servalglngluargglnvalthraspserilealaleuargproleu275280285val<210>3<211>1682<212>rna<213>人(human)<400>3agugguccugccgccuggucucaccucgcuaugguucgucugccucugcagugcguccuc60uggggcugcuugcugaccgcuguccauccagaaccacccacugcaugcagagaaaaacag120uaccuaauaaacagucagugcuguucuuugugccagccaggacagaaacuggugagugac180ugcacagaguucacugaaacggaaugccuuccuugcggugaaagcgaauuccuagacacc240uggaacagagagacacacugccaccagcacaaauacugcgaccccaaccuagggcuucgg300guccagcagaagggcaccucagaaacagacaccaucugcaccugugaagaaggcuggcac360uguacgagugaggccugugagagcuguguccugcaccgcucaugcucgcccggcuuuggg420gucaagcagauugcuacagggguuucugauaccaucugcgagcccugcccagucggcuuc480uucuccaaugugucaucugcuuucgaaaaaugucacccuuggacaagcugugagaccaaa540gaccugguugugcaacaggcaggcacaaacaagacugauguugucugugguccccaggau600cggcugagagcccugguggugauccccaucaucuucgggauccuguuugccauccucuug660gugcuggucuuuaucaaaaagguggccaagaagccaaccaauaaggccccccaccccaag720caggaaccccaggagaucaauuuucccgacgaucuuccuggcuccaacacugcugcucca780gugcaggagacuuuacauggaugccaaccggucacccaggaggauggcaaagagagucgc840aucucagugcaggagagacagugaggcugcacccacccaggaguguggccacgugggcaa900acaggcaguuggccagagagccuggugcugcugcugcuguggcgugagggugaggggcug960gcacugacugggcauagcuccccgcuucugccugcaccccugcaguuugagacaggagac1020cuggcacuggaugcagaaacaguucaccuugaagaaccucucacuucacccuggagccca1080uccagucucccaacuuguauuaaagacagaggcagaaguuuggugguggugguguugggg1140uaugguuuaguaauauccaccagaccuuccgauccagcaguuuggugcccagagaggcau1200caugguggcuucccugcgcccaggaagccauauacacagaugcccauugcagcauuguuu1260gugauagugaacaacuggaagcugcuuaacuguccaucagcaggagacuggcuaaauaaa1320auuagaauauauuuauacaacagaaucucaaaaacacuguugaguaaggaaaaaaaggca1380ugcugcugaaugaug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