一种灭活型病毒保存液及其制备方法与流程

本发明涉及一种灭活型病毒保存液及其制备方法，属于应用于体外诊断技术领域。

背景技术：

病毒是非细胞生命形态，必须在活细胞内寄生增殖，结构简单，一般由核酸(dna或rna)和包裹核酸的蛋白质外壳组成。大部分病毒是一种病原体微生物，能够使宿主发病并可以在生物体内传播而具备传染性。目前可以通过采集病人的咽拭子、鼻拭子、血液等样本进行体外诊断，检测是否感染某种病毒，常见的检测方法为对病人的样本进行抗原抗体检测或核酸检测，但是病毒一般离开宿主细胞会很快失活，病毒完整性会被破坏，病毒外壳崩解，核酸发生降解，因而为了保证体外诊断的准确性，病毒的样本运输和保存，需要采用特定的器械或保存液。

目前市面上主要的病毒保存液一般为生理盐水、pbs缓冲液或者utm运送培养基，此类病毒保存液能够应用于核酸检测，但是由于没有添加灭活成分，或者灭活效果不佳，使得采集的生物样本具备二次传播感染的风险。

目前大部分在售灭活病毒保存液均采用高浓度胍盐进行灭活，高浓度胍盐虽然对病毒的灭活效果较好，但是高浓度胍盐低温下容易结晶析出(如采集的样本在冬天北方低温地区运输)，析出后可能会降低病毒的灭活效果，增加了运输过程中传播感染的风险；另一方面高浓度胍盐在核酸提取过程中加大了洗涤去除的难度，容易导致核酸中胍盐残留，胍盐残留会抑制核酸扩增，进而导致漏检，假阴性样本比例上升。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种灭活型病毒保存液，在保证病毒核酸的完整性的基础上，添加了使病毒灭活的组分，使得采集的生物样本能够应用于核酸检测，又降低了病毒传播感染的风险。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种灭活型病毒保存液，其包括异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、亚氨基二琥珀酸四钠、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和二硫苏糖醇。

如上所述的灭活型病毒保存液，优选地，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠或月桂酰基氨酸钠，所述阳离子表面活性剂为苯扎氯铵。

进一步，所述阴离子表面活性剂优选为十二烷基磺酸钠。

如上所述的灭活型病毒保存液，优选地，在保存液中各组分按终浓度计为：所述异硫氰酸胍为0.1～1mol/l，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～300mmol/l，亚氨基二琥珀酸四钠为1～50mmol/l，按重量体积比计，阴离子表面活性剂为0.1～2％、阳离子表面活性剂为0.01～0.2％，二硫苏糖醇为0.01～0.2％。

如上所述的灭活型病毒保存液，优选地，在保存液中各组分按终浓度计为：所述异硫氰酸胍为0.1mol/l，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐100mmol/l，所述亚氨基二琥珀酸四钠为30mmol/l，按重量体积比计，阴离子表面活性剂为0.5％、阳离子表面活性剂为0.05％，二硫苏糖醇为0.1％。

如上所述的灭活型病毒保存液，优选地，所述保存液的ph值为5.0～8.0，进一步优选为6.0。

如上所述灭活型病毒保存液的制备方法：称取异硫氰酸胍，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，亚氨基二琥珀酸四钠，十二烷基磺酸钠，苯扎氯铵，二硫苏糖醇，加入纯化水800ml搅拌溶解，用naoh调节ph值到5.0～8.0，加入纯化水定容至1l，使得异硫氰酸胍的浓度为0.1～1mol/l，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～300mmol/l，亚氨基二琥珀酸四钠1～50mmol/l，十二烷基磺酸钠按重量体积比为0.1～2％％(w/v，g/ml)，苯扎氯铵按重量体积比为0.01～0.2％(w/v，g/ml)，二硫苏糖醇按重量体积比为0.01～0.2％(w/v，g/ml)，配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明提供的灭活型病毒保存液，不仅有效保证病毒核酸的完整性，还添加了使病毒灭活的组分，使得采集的生物样本能够应用于核酸检测，降低了病毒传播感染的风险，并能有效避免核酸的降解，保证检测结果的准确性。

本发明提供的灭活型病毒保存液保证了病毒的灭活性能，为后续荧光检测或测序提供有质量保证的核酸，亦不影响后续的核酸提取和扩增检测结果，稳定性较好。同时，使用生物可降解型的亚氨基二琥珀酸四钠，减少了环境污染。

附图说明

图1为实验组在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达结果；

图2为对照组在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达结果；

图3为10³copies/ml假病毒室温条件下保存效果；

图4为10⁴copies/ml假病毒室温条件下保存效果；

图5为10⁵copies/ml假病毒室温条件下保存效果。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明在大量实验研究的基础上，发现采用异硫氰酸胍能使蛋白变性，具有灭活病毒的作用，但是用量不易过多，过多会导致溶液不稳定，易出现结晶，过少不能起到灭活病毒的效果，所以优选浓度为0.1～1mol/l。采用的亚氨基二琥珀酸四钠，具有抑制核酸酶活性，防止核酸降解，并可自行生物降解，没有毒害作用，减少环境污染。阴离子表面活性剂，蛋白变性，利于病毒外壳崩解，阳离子表面活性剂，杀菌消毒，杀灭致病微生物，采用二硫苏糖醇具有保护rna作用。本发明中采用较低浓度的胍盐，使核酸洗涤过程中容易去除，同时添加了多种具有灭活性能的表面活性剂，利用多种灭活试剂的组合，在降低胍盐浓度的同时，保证了病毒的灭活性能，亦不影响后续的核酸提取和扩增检测。

实施例1

灭活病毒保存液的制备：称取异硫氰酸胍59.08g，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15.76g，亚氨基二琥珀酸四钠6.74g，十二烷基磺酸钠5g，苯扎氯铵0.5g，二硫苏糖醇1g，加入纯化水800ml，用naoh调节ph值到6.0，加入纯化水定容至1l，使得异硫氰酸胍的终浓度为0.1mol/l，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100mmol/l，亚氨基二琥珀酸四钠为30mmol/l，十二烷基磺酸钠按重量体积比为0.50％(w/v)，苯扎氯铵按重量体积比为0.05％(w/v)，二硫苏糖醇按重量体积比为0.10％(w/v)。配制完成后，将溶液通过0.25μm的滤膜除菌。

1、病毒灭活性能验证

实验组采用高亮度绿色荧光蛋白的慢病毒与上述制备的病毒保存液按照体积比1：1混合保存，使得病毒最终滴度为10⁸tu/ml，混合后10分钟后，取混合物去感染vero细胞，感染后的细胞进行细胞培养3天，然后荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达，验证病毒的活性。对照组：采用高亮度绿色荧光蛋白的慢病毒(病毒滴度10⁸tu/ml)直接感染vero细胞，感染后的细胞进行细胞培养3天，然后荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达，验证病毒的活性。结果如图1所示，为实验组在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达结果，可看出在荧光显微镜下，没有绿色，这表明该病毒已被病毒保存液灭活，没有感染细胞能力。图2为对照组在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达结果在荧光显微镜下产生明显的绿色荧光，这表明该病毒具有很强的感染能力。

实验结果显示慢病毒在本发明的病毒保存液中保存10分钟即全部失活，表明本发明的病毒保存液病毒灭活效果较好。

实施例2病毒核酸保存效果及核酸检测验证

1样本处理：取每个实验批次按实施例1中制备的病毒保存液，标记为cellpro3管(2ml/管)和按现有技术配制的病毒保存液(其中，柠檬酸钠的终浓度为25mmol/l，蛋白酶k的终浓度为200μg/ml，浓硫酸的终浓度为2.5％(v/v)，乙二胺四乙酸的终浓度为30mmol/l，硫酸铵的终浓度为60％(w/v))标记为compa3管(2ml/管)，加入梯度稀释的rna假病毒样本(金唯智生物技术有限公司)，使得浓度依次为10³copies/ml、10⁴copies/ml、10⁵copies/ml，将加入假病毒样本的保存液置于室温(20-25℃，湿度50％-60％)保存。

2病毒rna提取：将上述在室温保存的样本，分别在保存1、2、3、5、7天后取出进行rna提取及检测。取各保存液样本200μl，按照病毒核酸提取试剂盒说明书(南京诺维赞生物科技有限公司，cat.rc311-c1)流程进行核酸提取。最终假病毒rna纯化产物洗脱体积为50μl。

3rt-pcr荧光定量检测：按照invitrogen反转录试剂盒实验流程，反应总体积为21μl，假病毒rna纯化产物加入7μl。反转录后，按照荧光定量检测试剂盒实验流程，反应总体积为20μl，反转录产物加入5μl，使用abi-7500fast荧光定量pcr仪，程序设置参考试剂盒说明书。

4荧光定量pcr检测数据结果

添加三种浓度样本的cellpro和compa保存液在室温条件保存1天、2天、3天、5天、7天的检测数据结果见图3、图4、图5，从图中可看出，同种浓度的假病毒在两种病毒保存液中核酸扩增ct值比较可以看出，本发明病毒保存液ct值更低，表明本发明病毒保存液病毒保存效果更好，提取的病毒核酸浓度更高。

此外，按上述操作同时与市售的病毒保存液进行病毒样本保存、病毒rna提取及rt-pcr完整流程，检测样本为不同浓度梯度的rna假病毒样本，室温(20-25℃，湿度50％-60％)条件下分别保存1天、2天、3天、5天、7天，并进行检测。检测结果表明：本发明提供的病毒保存液在室温条件下保存7天，与现有的产品相比，本发明提供的灭活型病毒保存液的ct值变化幅度较小，说明本发明提供的灭活型病毒保存液具备较高的核酸提取量，稳定性较好。

对比例1

称取异硫氰酸胍59.08g，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15.76g，亚氨基二琥珀酸四钠6.74g，十二烷基磺酸钠5g，二硫苏糖醇1g，加入纯化水800ml，用naoh调节ph值到6.0，加入纯化水定容至1l，使得异硫氰酸胍的浓度为0.1mol/l，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐100mmol/l，亚氨基二琥珀酸四钠30mmol/l，十二烷基磺酸钠按重量体积比为0.50％(w/v)，二硫苏糖醇按重量体积比为0.10％(w/v)；本对比例去除了苯扎氯氨组分，发现慢病毒的灭活时间需要达到5个小时，才能彻底灭活，这导致有感染的风险。

对比例2

本例中异硫氰酸胍浓度为2mol/l，其余组分及浓度与实施例1相同，4℃放置于24h(模拟室外低温运输环境)，出现结晶析出，稳定性差，而实施例1在4℃放置24h或更长时间如6个月，未发现结晶析出，稳定性较好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。