病毒疫苗的制备方法及药物组合物与流程

文档序号：26309947发布日期：2021-08-17 13:49阅读：777来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及病毒疫苗的制备方法及药物组合物。

背景技术：

2020年1月10日，新型冠状病毒的第一个基因组序列数据公布。研究者将新型冠状病毒与已知明确感染人的两种冠状病毒，即重症急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndromes，sars)冠状病毒以及中东呼吸综合征(middleeastrespiratorysyndromes，mers)冠状病毒进行了全基因组比对，发现新型冠状病毒与sars冠状病毒和mers冠状病毒相比，分别有平均70％和40％的序列相似性，其中不同冠状病毒与宿主细胞作用的关键基因，即刺突蛋白(spikeprotein)编码基因具有更大的差异性。

目前尚无针对新型冠状病毒的疫苗或特异性治疗方法，确诊为新型冠状病毒感染的患者仅根据个人症状和临床情况接受支持性治疗，病死率约1-4％。因此，迫切需要安全有效能拮抗新型冠状病毒感染的疫苗及其药物组合物。

sars是进入二十一世纪以来发现的第一种新的传染病，2003年4月发现其病原体是一种新型冠状病毒，命名为sars冠状病毒。截止2003年9月，在五大洲29个国家，共确诊8098病例，774例死亡，病死率约10％。sars冠状病毒刺突蛋白由两个亚单位组成，s1亚单位含有与宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2(ace2)相结合的受体结合域，共有666个氨基酸残基。而s2亚单位介导病毒与宿主细胞膜的融合，由583个氨基酸残基组成。在sars冠状病毒感染时刺突蛋白在诱导中和抗体，t细胞免疫反应及提供保护性免疫方面起关键作用。

mers冠状病毒也是一种新发现的人畜共患病原体，从2012年沙特阿拉伯的一个致命的人类病例开始，在25个国家中有近1800人陆续受到感染。病人致死率约30-40％。但60％以上的病人能康复、清除病毒和发展免疫表明，mers冠状病毒的刺突蛋白等成分可能是一种合适的候选疫苗。这进一步得到了动物实验的证明。在这些实验中，从病人血清分离的几种抗mers冠状病毒刺突蛋白中和抗体能中和及阻止低浓度病毒进入细胞和传播，有时能提供有效保护。虽然这些实验性疫苗能诱导动物产生保护性反应，但与新型冠状病毒类似的sars冠状病毒和mers冠状病毒的疫苗研发进展表明，使用全长刺突蛋白和其他病毒蛋白作为候选疫苗可能存在严重的安全问题，包括免疫病理学和促进疾病发展，可能由于诱导了th2-偏态免疫反应和/或抗刺突蛋白非中和抗体。

因此有必要制备新型的病毒疫苗及药物组合物，以避免现有技术中存在的上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种病毒疫苗的制备方法，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒s蛋白发生突变而作快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。本发明还提供了经所述制备方法得到的病毒疫苗及其应用。本发明能准确、快速、高效地捕获能够激发人体或其他病毒宿主免疫反应的病毒抗原肽或蛋白并快速制备病毒核酸疫苗，在感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病领域具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明的所述病毒疫苗的制备方法包括：

s1：提供至少一种病毒的全长或部分抗原肽或蛋白的编码核酸序列；

s2：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由60-150个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码20-50个氨基酸残基，每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使5-15个氨基酸残基编码序列重叠，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段；

s3：从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接连接元件，以形成核酸序列；

s4：将所述核酸序列通过分子生物学方法经基因合成和亚克隆至常规质粒序列，在洁净环境下制备核酸疫苗。

本发明的所述病毒疫苗的制备方法的有益效果在于：将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成至少一个所述部分重叠核酸序列，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒s蛋白发生突变而作快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。

优选的，所述连接元件包括5’端的非翻译片段、kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、poly(a)信号序列和3’端的非翻译片段，所述步骤s3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’端的非翻译片段、所述kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述poly(a)信号序列和所述3’端的非翻译片段，以通过所述步骤s4制备dna疫苗。

进一步优选的，在所述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间连接mhci类分子的信号肽和转运区域编码序列。

优选的，所述连接元件包括5’帽结构、5’端的非翻译片段、kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、3’端的非翻译片段和poly(a)序列，所述步骤s3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’帽结构、所述5’端的非翻译片段、所述kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述3’端的非翻译片段和所述poly(a)序列，以通过所述步骤s4并经体外转录制备mrna疫苗。

进一步优选的，在所述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间连接mhci类分子的信号肽和转运区域编码序列。

优选的，所述poly(a)序列包含20-400个腺嘌呤核苷酸。

进一步优选的，所述poly(a)序列包含60-250个腺嘌呤核苷酸。

优选的，所述部分重叠核酸序列来源于人工修饰后的核酸，以增强所述核酸序列的稳定性。

进一步优选的，所述核酸序列的编码区域的密码子适应指数为0.5-1，以适合人密码子使用。

优选的，所述病毒的抗原肽或蛋白包含刺突蛋白、所述刺突蛋白的s1亚单位和s2亚单位、病毒结构蛋白，或所述刺突蛋白、所述刺突蛋白的s1亚单位和s2亚单位、以及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物，所述刺突蛋白的s1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。

进一步优选的，所述病毒抗原肽或蛋白包含所述刺突蛋白，或所述刺突蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种。

进一步优选的，所述病毒抗原肽或蛋白包含所述刺突蛋白的s1亚单位和s2亚单位，或其变体或衍生物中的任意一种或多种。其有益效果在于能识别宿主细胞受体，提供特异抗原。

进一步优选的，所述抗原肽或蛋白还包含所述血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白或核衣壳蛋白，或这些病毒结构蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种，所述血凝素为ha蛋白，所述神经氨酸酶为na蛋白。其有益效果在于，对识别宿主细胞受体，病毒的有效装配和出细胞起重要作用，可能提供特异抗原。

优选的，所述病毒的抗原肽或蛋白来源于呼吸道感染病毒、消化道感染病毒、肝炎病毒、乙脑病毒、神经病毒和性传播病毒中的任意一种或多种，所述呼吸道感染病毒包括新型冠状病毒、sars病毒、mers病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒中的任意一种或多种。

本发明的所述药物组合物包含由所述病毒疫苗的制备方法得到的核酸疫苗。

本发明的所述药物组合物的有益效果在于：所述药物组合物来源于通过所述病毒疫苗的制备方法得到的核酸疫苗，而所述病毒疫苗的制备方法中，将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成至少一个所述部分重叠核酸序列，再以串联形式将多个所述部分重叠核酸序列连接成为核酸疫苗片段，可有效避免药物组合物可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。

优选的，所述药物组合物还具有由所述核酸疫苗与一种或多种脂质体复合形成的物质。

优选的，所述药物组合物还具有佐剂，所述佐剂包括poly-iclc、tlr、1018iss、铝盐、免疫调节寡核苷酸、as15、bcg、cp-870、cp-893、cpg7909、cyaa、dslim、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、imufactimp321、ispatch、iss、iscomatrix、juvlmmune、lipovac、mf59、单磷酰脂质a、蒙塔尼德ims1312、蒙塔尼德isa206、蒙塔尼德isa50v、蒙塔尼德isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、plga微颗粒、瑞喹莫德、srl172、病毒微体、病毒样颗粒、yf-17d、vegf陷阱、r848、β-葡聚糖、pam3cys、阿奎拉qs21刺激子、vadimezan和asa404中的任意一种或多种，有利于诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，并降低生产成本。

附图说明

图1为本发明的小鼠疫苗注射免疫实验过程中编码新型冠状病毒刺突蛋白s1亚单位包括受体结合域的部分重叠核酸序列结构所组成的质粒dna示意图；

附图标记说明：11.起始密码子；12.mhci类分子信号肽(sp)编码核酸序列；13.部分重叠36个氨基酸残基编码核酸序列；14.7个氨基酸残基重叠编码核酸序列；15.弗林蛋白酶切位点编码核酸序列；16.mhci类分子转运区域氨基酸(mitd)编码核酸序列；17.终止密码子；

图2为本发明实施例的pjm908的质粒图谱；

图3为本发明实施例的pjm909的质粒图谱；

图4为本发明实施例1中pjm908和pjm909dna疫苗质粒转染293t细胞上清液蛋白印迹实验结果图；

图5为本发明一些实施例的各组实验小鼠接种后血清中新冠病毒s蛋白rbd抗体的elisa滴度水平对比图；

图6为本发明一些实施例的对不同实验组样品进行新冠病毒s蛋白rbd中和抗体检测后得到的竞争性抑制百分比的对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”和“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种病毒疫苗的制备方法。

所述病毒疫苗的制备方法包括：提供至少一种病毒的全长或部分的抗原肽或蛋白的编码核酸序列；将所述全长或部分抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由60-150个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码20-50个氨基酸残基，每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使5-15个氨基酸残基重叠；再以串联形式将多个部分重叠核酸连接成为核酸疫苗片段。

本发明一些实施例中，将所述全长或部分的抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由90-120个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码30-40个氨基酸残基；每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使6-14个氨基酸残基编码序列重叠；再以串联形式将多个部分重叠核酸连接成为核酸疫苗片段。

本发明一些实施例中，将所述全长或部分的抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个由99-108个核苷酸组成的部分重叠核酸序列，以编码33-36个氨基酸残基；每个所述部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列或非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列分离，使7-9个氨基酸残基编码序列重叠；再以串联形式将多个部分重叠核酸连接成为核酸疫苗片段。

具体的，所述非免疫原性甘氨酸或丝氨酸连接子编码序列为非免疫原性甘氨酸连接子编码序列和非免疫原性丝氨酸连接子编码序列中的任意一种。

具体的，弗林蛋白酶是一种类似枯草杆菌蛋白酶的蛋白质前体转化酶。它是分泌途径中的主要加工酶，定位于高尔基体反面的网状结构部位。其底物包括凝血因子，血清蛋白和生长因子受体等，最短的切割识别位点是：arg-x-x-arg。

所述病毒疫苗的制备方法还包括：从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接连接元件，以形成核酸序列；将所述核酸序列通过分子生物学方法亚克隆至常规质粒序列，在洁净环境下制备核酸疫苗。

本发明一些实施例中，所述连接元件包括5’端的非翻译片段、kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、poly(a)信号序列和3’端的非翻译片段，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’端的非翻译片段、所述kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述poly(a)信号序列和所述3’端的非翻译片段，以形成所述核酸序列；将所述核酸序列通过分子生物学方法亚克隆至常规质粒序列，在洁净环境下制备dna疫苗。

具体的，在上述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间，还可加上mhci类分子的信号肽和转运区域编码序列。

本发明一些实施例中，所述连接元件包括5’帽结构、5’端的非翻译片段、kozak序列、起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、终止密码子序列、3’端的非翻译片段和poly(a)序列，所述步骤s3中，从5’端至3’端方向依次或随机操作性连接所述5’帽结构、所述5’端的非翻译片段、所述kozak序列、所述起始密码子序列、所述核酸疫苗片段、所述终止密码子序列、所述3’端的非翻译片段和所述poly(a)序列，以形成所述核酸序列；将所述核酸序列通过分子生物学方法亚克隆至常规质粒序列，在洁净环境下将所述核酸序列经体外转录成为mrna序列，制备mrna疫苗。

具体的，在上述起始密码子序列和所述核酸疫苗片段之间，还可加上mhci类分子的信号肽和转运区域编码序列。

本发明一些实施例中，所述mhci类分子的信号肽和转运区域氨基酸序列如下：信号肽,mrvtaprtlilllsgalaltetwags；转运区域,ivgivaglavlavvvigavvatvmcrrkssggkggsysqaassdsaqgsdvslta；所述mhci类分子的信号肽和转运区域氨基酸序列用于优化mhcⅰ、ⅱ类通路和提高rna稳定性及蛋白翻译效率。

将全长抗原肽或蛋白的编码区域分成一个或多个部分重叠核酸序列，以串联形式连接成为核酸疫苗片段。所制备的核酸疫苗进行动物和人体注射后，经体内细胞处理形成小片段抗原肽疫苗，可有效避免全长蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。

本发明一些实施例中，基于新型冠状病毒刺突蛋白s1亚单位编码的核酸序列而设计的多个部分重叠核酸序列以串联形式连接成为核酸疫苗片段的序列，请分别参见图1-3和seqidno:1-2。

具体的，所述poly(a)序列包含25-400个腺嘌呤核苷酸。

更加具体的，所述poly(a)序列包含60-250个腺嘌呤核苷酸。

本发明一些实施例中，所述5’帽结构(capping)是一种修饰核苷酸，即代谢基因激活蛋白(catabolitegeneactivatorprotein，cap)类似物。

本发明一些具体的实施例中，将鸟嘌呤核苷酸添加到mrna分子的5’端形成所述5’帽结构。

本发明一些具体的实施例中，所述5’帽结构为甲基鸟苷帽子，即将m7gpppn添加到5’端。

本发明一些具体的实施例中，所述5’帽结构还包括甘油或4’，5’-亚甲基核苷酸等。

本发明实施例所述的各类核酸序列的片段属于对应的全长核酸序列中的连续或不连续核苷酸片段。各类核酸序列的变体或衍生物中所述的核酸序列通过至少一个核苷酸的缺失、插入、添加或取代形成。

本发明一些实施例中，所述部分重叠核酸序列来源于人工修饰后的核酸，以增强所述核酸序列的稳定性。所述核酸序列的编码区域的密码子适应指数为0.5-1，以适合人密码子使用。经过这样修饰的密码子，能优化抗原肽或蛋白表达和减低与内源性病毒重组而发生突变的可能性。

本发明实施例所述的抗原肽或蛋白指可由哺乳动物的免疫系统识别并且能够触发抗原特异性免疫应答的物质。

本发明一些实施例中，所述的抗原肽或蛋白是具体为本发明的所述核酸序列的翻译产物。在这种情况下，所述抗原肽或蛋白为包含至少一个表位的肽和蛋白的片段、变体或衍生物。

具体的，所述表位也称为抗原决定簇，本发明一些实施例的t细胞表位或蛋白部分具有8-11个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与mhci类分子有效结合。其中这些片段可选自抗原肽或蛋白全长氨基酸序列的任何部分，这些片段通常由t细胞以肽片段和mhci类分子组成的复合物的形式识别。

本发明一些实施例的t细胞表位或蛋白质部分具有10-25个氨基酸残基，或者13-18个氨基酸残基，其中某些位点含相同或性质类似的氨基酸残基，而其他位点则含任意氨基酸残基，或更长或更短，但仍能与mhcii类分子有效结合。其中这些片段可选自抗原肽或蛋白全长氨基酸序列的任何部分，这些片段通常由t细胞以肽片段和mhcii类分子组成的复合物的形式识别。

本发明一些实施例中，所述抗原肽或蛋白通过形成抗体或抗原特异性t细胞中的任意一种或多种作为自适应免疫应答的一部分。

本发明一些实施例中，所述抗原肽或蛋白由mhc呈现给t细胞。

本发明一些实施例中，所述病毒的抗原肽或蛋白包含刺突蛋白，或所述刺突蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种。

具体的，所述刺突蛋白呈长杆状包膜凸起，以突出在冠状病毒粒子的表面，作为病毒的保护性抗原负责与宿主的特异蛋白受体相互作用，介导病毒与蛋白膜的融合，从而使病毒的基因组进入细胞。

本发明一些实施例中，所述病毒的抗原肽或蛋白还包含衍生于病毒的刺突片段，或所述刺突片段的变体或衍生物中的任意一种或多种，所述刺突片段包括受体结合域，或所述受体结合域的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种。

具体的，所述刺突片段为所述刺突蛋白的s1亚单位，所述s1亚单位包含有所述受体结合域及受体结合结构，以负责识别细胞的受体。

本发明一些实施例中，所述病毒的抗原肽或蛋白还包含血凝素(ha蛋白)，神经氨酸酶(na蛋白)，包膜蛋白，膜蛋白，核衣壳蛋白，及其他病毒结构蛋白，或这些病毒结构蛋白的片段、变体或衍生物中的任意一种或多种。其有益效果在于，对识别宿主细胞受体，病毒的有效装配和出细胞起重要作用，可能提供特异抗原。

本发明一些实施例中，所述病毒的抗原肽或蛋白来源于呼吸道感染病毒、消化道感染病毒、肝炎病毒、乙脑病毒、神经病毒和性传播病毒中的任意一种或多种，所述呼吸道感染病毒包括新型冠状病毒，sars病毒，mers病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒中的任意一种或多种。

本发明一些实施例中，所述药物组合物包含通过所述病毒疫苗的制备方法所得到的核酸疫苗，以应用于拮抗病毒感染。

具体的，所述药物组合物能够作为提供至少一种抗原或抗原功能的疫苗使用，抗原或抗原功能可刺激机体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。具体的，所述核酸序列激发哺乳动物的免疫系统产生针对病毒的特异免疫反应。

所述免疫系统是指可保护生物体免受感染的系统。如果病原体突破生物体的物理屏障进入生物体，先天免疫系统会提供即时但非特异性的反应。如果病原体逃避这种先天反应，脊椎动物就拥有第二层保护，即适应性免疫系统。

所述适应性免疫系统是由高度专门化的、系统性的细胞和过程组成，这些细胞和过程可以消除或阻止致病性生长。适应性免疫反应为脊椎动物免疫系统提供了识别和记忆特定病原体，即产生免疫反应的能力，并在每次遇到病原体时发起更强的攻击。由于体细胞突变和mhc基因v(d)j重组，该系统具有很强的适应性。这种机制允许少数基因产生大量不同的抗原受体，然后在每个淋巴细胞上唯一表达。由于基因重组导致每个细胞的dna发生不可逆转的变化，该细胞的所有后代都将继承编码相同受体特异性的基因，包括记忆b细胞和记忆t细胞，它们是长期特异性免疫的关键。

所述免疫反应通常可以是适应性免疫系统对特定抗原的特定反应或先天性免疫系统的非特异性反应。

适应性免疫反应通常被理解为抗原特异性。抗原特异性允许产生针对特定抗原、病原体或病原体感染细胞的反应。通过“记忆细胞”在体内维持这些定制反应的能力。如果病原体不止一次感染人体，这些特定的记忆细胞就会被用来迅速消除它。

细胞免疫或细胞免疫应答通常与巨噬细胞、自然杀伤细胞(nk)、抗原特异细胞毒性t淋巴细胞的活化、以及各种细胞因子在抗原反应中的释放有关。一般来说，细胞免疫与抗体无关，而是与免疫系统细胞的激活有关。细胞免疫应答的特征在于，通过激活抗原特异细胞毒性t淋巴细胞，能够诱导在其表面显示抗原表位的某些细胞的凋亡，例如病毒感染的细胞、具有胞内细菌的细胞和显示肿瘤抗原的癌细胞；激活巨噬细胞和自然杀伤细胞，使它们能够消灭病原体；还能刺激细胞分泌多种细胞因子，影响其他参与适应性免疫反应和先天性免疫反应的细胞功能。

体液免疫通常是指抗体的产生及其伴随的辅助过程。体液免疫反应的典型特征是th2的活化和细胞因子的产生，生发中心的形成和同型转换，亲和力成熟和记忆细胞的产生。

本发明一些实施例中，所述药物组合物还具有由所述核酸疫苗与一种或多种脂质体复合形成的物质。具体的，所述物质为新的脂质体、脂质纳米粒或脂质体-疫苗药物组合物中的任意一种或多种，具有靶向性、长效性、细胞亲和性及组织相容性、提高疫苗成分稳定性及降低疫苗副作用等特点。

本发明一些实施例中，所述药物组合物中还含有佐剂，以诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。

具体的，所述佐剂包括由poly-iclc，tlr，1018iss，铝盐，免疫调节寡核苷酸，as15，bcg，cp-870、893，cpg7909，cyaa，dslim，gm-csf，ic30，ic31，咪喹莫特，imufactimp321，ispatch，iss，iscomatrix，juvlmmune，lipovac，mf59，单磷酰脂质a，蒙塔尼德ims1312，蒙塔尼德isa206，蒙塔尼德isa50v，蒙塔尼德isa-51，ok-432，om-174，om-197-mp-ec，ontak，plga微颗粒，瑞喹莫德，srl172，病毒微体和其他病毒样颗粒，yf-17d，vegf陷阱，r848，β-葡聚糖，pam3cys，阿奎拉qs21刺激子，vadimezan或asa404(dmxaa)中的任意一种或多种。具体的，所述免疫调节寡核苷酸为amplivax。

本发明实施例的药物组合物能够在无冷链的情况下储存和运输，并且能够快速和可扩展地生产。

以下以实施例1dna疫苗质粒体外转染293t细胞实验、实施例2小鼠疫苗注射免疫实验和实施例3恒河猴疫苗注射实验来说明本发明的有益效果。

图1为所述一些实施例实验过程中编码新型冠状病毒刺突蛋白s1亚单位片段包括受体结合域的部分重叠核酸序列结构示意图。虽然s1亚单位具有良好的免疫原性，但它含多于650个氨基酸残基，进入人体后可能引发较严重的副反应。参照图1，pjm908环状dna质粒具有s1亚单位ntd编码核酸片段，含11个部分重叠核酸序列，每个序列编码36个氨基酸，形成部分重叠36个氨基酸残基编码核酸序列13，其下游与相邻的部分重叠区域重复编码7个氨基酸，形成7个氨基酸残基重叠编码核酸序列14。5’端的第1个序列含起始密码子11和mhci类分子信号肽编码核酸序列12，每个序列末端均含弗林蛋白酶切位点编码核酸序列15，3’端的序列含mhci类分子转运区域氨基酸编码序列16和终止密码子17，以串联形式将多个序列连接形成一个完整的核酸疫苗片段，经基因合成和亚克隆形成环状dna质粒。pjm909环状dna质粒具有s1亚单位rbd编码核酸片段以及小部分s2亚单位编码核酸片段，含13个部分重叠核酸序列，其他结构与pjm908相同，经基因合成和亚克隆形成环状dna质粒。在洁净环境下制备两个候选dna疫苗。所制备的候选dna疫苗注射加电导入进入动物和人体后，多个部分重叠核酸序列及其下游的弗林蛋白酶切位点编码核酸片段能够经体内细胞处理被识别和翻译，使所述核酸疫苗片段经弗林蛋白酶处理，进一步形成若干小片段抗原肽，直接与组织相容性复合物mhci或ii类分子结合，可有效避免s1亚单位大片段或全长s蛋白疫苗可能引起的严重副作用，但又保持所述抗原肽或蛋白的免疫原性，从而能有效拮抗病毒感染。同时，小片段抗原肽成分可根据新冠病毒s蛋白发生突变而作出快速相应调整，因此核酸疫苗对新冠病毒突变株也能有效。

本发明实施例1-3提供了编号为pjm908和pjm909的dna疫苗，具体的：

所述步骤s1使用新型冠状病毒的刺突蛋白s1亚单位的dna编码序列作为编码核酸序列；

所述步骤s2中，数十个部分重叠核酸序列中的每个部分重叠核酸序列由108个核苷酸组成，以编码36个氨基酸残基，每个部分重叠核酸序列用弗林蛋白酶切位点编码序列分离，使7个氨基酸残基编码序列重叠，再以串联形式连接成为核酸疫苗片段。

所述步骤s4中使用的质粒为pjm908和pjm909，其质粒图谱请分别参见图2-3，其序列分别如seqidno:1-2所示。

本发明实施例1中，所述dna疫苗质粒体外转染293t细胞实验的具体步骤包括：复苏冻存的293t细胞，离心取上清，并接种在培养皿中，放置培养箱中培养。观察293t细胞生长至80％左右进行电转。收集细胞，按照计数用电转液r稀释细胞沉淀，使细胞密度为1×10⁶-5×10⁶。每孔细胞中分别加入5ug的pjm908和pjm909质粒，最终转染体积120ul。用neon电转仪(invitrogen)进行电转。将电击过的细胞注入新的培养皿中，加入无血清培养基培养4小时，换成完全培养基，24h小时和48小时分别换液，细胞上清液体收集备用。

图4显示了pjm908和pjm909dna疫苗质粒转染293t细胞后收集细胞上清液蛋白印迹实验结果图。其中使用的一抗为来源于欣博盛生物科技有限公司的鼠抗新冠s蛋白rbd单抗；二抗为羊抗鼠-hrp；覆盖rbd区域的jp-396多肽作为阳性对照。该实验结果显示s蛋白片段，尤其是pjm909质粒小片段抗原肽，在转染细胞已有表达。

本发明实施例2中，所述小鼠疫苗注射免疫实验的具体步骤包括：

将6-8周大的雌性balb/c小鼠分为若干个实验组，每组24只，以进行肌肉注射处理，具体为：第1组使用pjm909疫苗进行注射，注射量为30微克/只，第2组使用pjm909疫苗进行单独注射，注射量为100微克/只，第3组使用含量相同的pjm908和pjm909疫苗进行混合注射，注射量为60微克/只，第4组使用含量相同的pjm908和pjm909疫苗进行混合注射，注射量为200微克/只；第5组使用空载pvax1质粒进行注射，注射量为100微克/只。

具体的，注射完毕后立即用塔瑞莎电转装置(来源于上海塔瑞莎健康科技有限公司)电穿孔肌肉细胞。

具体的，观察balb/c小鼠重复肌肉注射pjm909和混合质粒9周(每2周给药1次，共5次)后，机体无明显毒性反应，对给药部位无明显的刺激作用。

所有实验小鼠均存活至计划解剖时间，经观察和解剖，与对照组小鼠相比，未见出现肉眼病变，未见脏器重量和病理组织学未观察到改变，可见疫苗安全可靠。所述改变指轻微程度以上的炎症、矿化和变性现象。

本发明实施例2于完成第3次肌肉注射后5-7天检测了各组实验小鼠接种后血清中新冠病毒s蛋白rbd抗体的elisa滴度水平，每组检测动物的数目为10，除第5组的空白组外，其余各组的待检测样本进行了1：100的稀释，具体滴度水平以450纳米波长下的吸光度表征。具体的检测方法为本领域技术人员的常规技术手段。

具体的，图5为各组实验小鼠接种后血清中新冠病毒s蛋白rbd抗体的elisa滴度水平对比图。参见图5，和第5组相比，第1组的滴度水平明显高于第5组，第2组至第4组的滴度水平与第5组相当，但由于除第5组的空白组外，其余各组的待检测样本进行了1：100的稀释，可以认定本申请的疫苗能够有效诱导小鼠的新冠病毒s蛋白rbd抗体产生。

本发明实施例3参照前述小鼠疫苗注射免疫实验对3-6岁，体重3.5-8公斤的雄性恒河猴进行了肌肉注射，形成了以下实验组：

第6组和第7组：对2只恒河猴使用空载pvax1质粒进行注射，注射量均为2毫克/只；

第8组和第9组：对2只恒河猴使用pjm909疫苗进行单独注射，注射量均为2毫克/只；

第10组和第11组：对2只恒河猴使用含量相同的pjm908疫苗和pjm909疫苗进行混合注射，注射量均为4毫克/只。

具体的，注射完毕后立即用塔瑞莎电转装置(来源于上海塔瑞莎健康科技有限公司)电穿孔肌肉细胞。

具体的，观察恒河猴重复肌肉注射pjm909和混合质粒8周(每4周给药1次，共4次)后，机体无明显毒性反应，对给药部位无明显刺激作用。

第3次注射结束后的5-7天，将上述实验组的每只动物的血清样本进行1：100的稀释后作为受试品，将对应未注射动物的血清样本进行1：100的稀释后作为对照品，进行新冠病毒s蛋白rbd中和抗体检测。具体过程如下：

将受试品和对照品分别与hrp-rbd复合物按1：1容积形成的混合物室温孵育20-30分钟，以允许结合抗hrp-rbd的循环中和抗体。

然后将所述混合物分别添加到预先包被人ace2多肽的捕获板中，室温孵育10-15分钟，然后对捕获板清洗2-4次。在清洗的过程中，未绑定hrp-rbd及任何与非中和抗体结合的hrp-rbd将被捕获在捕获板表面，而循环中和抗体与hrp-rbd结合的物质会随清洗过程被从捕获板中去除。

具体的，使用0.15摩尔/升，ph值为7.4的pbs透析液作为洗涤液进行清洗。

向捕获板顺次加入底物tmb溶液作为显色溶液，以及加入停止溶液使反应淬火，得到黄色的终溶液。

最后使用与分光光度计联用的微量滴定板读取器于450纳米波长下测量所述终溶液的吸光度，以考察受试样本中的病毒中和抗体滴度，即od值。样品的吸光度与滴度成反比。

通过以下公式计算竞争性抑制百分比：

竞争性抑制百分比＝100％×(1-受试品样本在450纳米下的od值)/对照品样本在450纳米下的od值。

图6为对不同实验组样品进行新冠病毒s蛋白rbd中和抗体检测后得到的竞争性抑制百分比的对比图。

参照图6，以第6组和第7组的平均竞争性抑制百分比为基准，第11组和实施例2中第1组和第3组的血清样本中的抗体水平明显高于基准，说明本申请的疫苗不仅能够有效诱导小鼠的新冠病毒s蛋白rbd抗体产生，也能有效诱导恒河猴的新冠病毒s蛋白rbd抗体产生。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

序列表

<110>上海桀蒙生物技术有限公司

<120>病毒疫苗的制备方法及药物组合物

<130>2021.01.28

<150>hrcn20l31002-yx

<151>2021-01-28

<160>2

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