一种甘蓝型油菜抗旱基因BnaTZF1A的多克隆抗体及其制备方法

一种甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体及其制备方法。


背景技术：

2.中国发明专利名称为“甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a及其引物、表达载体、应用和提高抗旱性的方法”(公开号为：cn110804614a)，公开了甘蓝型油菜中的bnatzf1a基因，然后构建bnatzf1a基因的过表达载体camv35s::bnatzf1a并转化甘蓝型油菜xy15(湘油15)，在甘蓝型油菜中过表达bnatzf1a基因，导致甘蓝型油菜抗旱性增强，但是现阶段缺少甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a蛋白相关的抗体。


技术实现要素：

3.本发明目的是为了提供一种与甘蓝型油菜抗旱相关因子bnatzf1a蛋白特异性结合反应的兔抗bnatzf1a多克隆抗体及其制备方法。
4.本发明的技术方案如下：
5.一种甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)选择甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a中抗原性强的蛋白片段的核酸序列，设计引物对bntzf1a
‑
rrf和bntzf1a
‑
tzfr进行克隆，构建重组原核表达载体；
7.(2)将步骤(1)中的重组原核表达载体转化表达细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物；
8.(3)将步骤(2)蛋白表达培养物进行纯化，将纯化得到的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体。
9.优选地，所述步骤(1)中编码核酸序列如seq id no:1所示。
10.优选地，所述步骤(1)中bntzf1a
‑
rrf序列如seq id no:2所示，bntzf1a
‑
tzfr序列如seq id no:3所示。
11.优选地，所述步骤(1)重组原核表达载体为pet28a
‑
sumo
‑
jt载体。
12.优选地，所述步骤(2)表达细胞为rosetta(de3)。
13.优选地，所述步骤(3)蛋白表达培养物的纯化步骤为：用60ml预冷的nta
‑
0缓冲液重悬蛋白表达培养物，超声破碎蛋白表达培养物，控制功率为300w，超声4s，暂停4s，超声99次；20000g4℃离心30min，分别收集上清和沉淀，用40μl 1x sds
‑
page上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测，剩余上清和沉淀于0
‑
7℃备用，电泳检测，用亲和层析树脂进行纯化。
14.一种甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体。
15.本发明选择甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a中抗原性强的蛋白片段的编码核酸序列，设计引物对bntzf1a
‑
rrf和bntzf1a
‑
tzfr进行克隆，构建重组原核表达载体，转化表达
细胞进行蛋白表达，得蛋白表达培养物，用蛋白表达培养物纯化后的目标产物进行动物免疫诱导抗体产生，最后对抗体纯化即得甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体，所得的甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的多克隆抗体特异性高，通过wb质控。
附图说明
16.图1为蛋白小量表达结果图。
17.图2为蛋白大量表达后进行蛋白电泳检测图。
18.图3为抗体sds
‑
page电泳图。
19.图4为抗体验证wb图。
具体实施方式
20.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的克隆及其原核表达载体构建
22.通过生物信息学软件dnastar分析获得的bnatzf1a蛋白中抗原性强的蛋白片段的核酸序列seq id no:1，采用primer 5.0软件设计上游引物对，构建原核表达载体，具体操作为：
23.a、以甘蓝型油菜抗旱基因bnatzf1a的抗原性强的蛋白片段的核酸序列，设计引物对bntzf1a
‑
rrf和bntzf1a
‑
tzfr；其中bnatzf1a的dna片段如seq id no:1所示；bntzf1a
‑
rrf序列如seq id no:2所示，bntzf1a
‑
tzfr序列如seq id no:3所示；
24.b、pcr扩增，200ul体系，pcr扩增目的片段，产物回收。
25.200ul体系pcr扩大：按照以下体系配置
[0026][0027][0028]
加完混匀后，按照以下pcr条件扩增：
[0029][0030]
c、连接、转化
[0031]
pcr产物和pet28a
‑
sumo
‑
jt载体在连接酶的作用下连接2h；
[0032]
转化至top10宿主细胞；
[0033]
倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16小时后可出现菌落；
[0034]
d、重组子筛选鉴定
[0035]
分装40ul不加抗生素的lb培养基至pcr管，每种克隆挑取8个单菌落至pcr管混匀，放置于37℃摇床中220r/2小时；每管取2ul作为模板进行菌液pcr，结果呈阳性的则可以送去测序鉴定；
[0036]
e、测序鉴定。
[0037]
实施例2蛋白表达纯化
[0038]
1、小量表达与鉴定
[0039]
a、将得到的正确的重组表达质粒转化表达感受态细胞rosetta(de3)；
[0040]
b、于37℃培养箱中倒置培养过夜；
[0041]
c、挑取阳性单菌落转入至含有抗生素的3ml lb培养基中，37℃200rpm过夜培养。取30ul过夜培养的菌液加入到3mllb培养基中，37℃200rpm；
[0042]
d、培养至od值为0.6；剩余的菌液加甘油于
‑
80℃保存备用；
[0043]
e、加入iptg至终浓度1mmol/l进行诱导，并设置对照组，37℃200rpm诱导3h；
[0044]
取200ul菌液，12000g离心30s，弃上清，菌体用40μl 1x sds
‑
page上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测。
[0045]
结果如图1所示，泳道1：对照；泳道2：marker(从上往下116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kda)泳道3：诱导后。(注：图中箭头所指为目的蛋白表达大小)
[0046]
2、蛋白大量表达与纯化
[0047]
a、取保存于
‑
80℃的菌种20ul接种于20ml含有抗生素的lb培养基，37℃200rpm过夜培养；取2ml过夜培养的菌液加入到2000ml lb培养基中，37℃200rpm培养至od值为0.6，加入iptg至终浓度1mmol/l，37℃200rpm培养3h。
[0048]
b、收集大量培养的菌液进行分装，于6000g离心10min，弃上清；用60ml预冷的nta
‑
0缓冲液重悬菌体，超声破碎菌体，控制功率为300w，超声4s，暂停4s，超声99次；20000g4℃离心30min，分别收集上清和沉淀，用40μl 1x sds
‑
page上样缓冲液重悬，沸水浴5min后，取10ul进行蛋白电泳检测，剩余上清和沉淀于0
‑
7℃备用，电泳检测；
[0049]
c、用亲和层析树脂进行纯化。
[0050]
结果如图2所示：3177
‑
f1
‑1‑
pet28a
‑
ksi(目的片段50
‑
290aa)，大小：预测理论大小42kda，观察大小42kda左右。
[0051]
实施例3动物免疫
[0052]
a、抗原乳化，弗氏完全佐剂一免，弗氏不完全佐剂加强免疫(二至五免)，每次免疫0.5mg；
[0053]
b、新西兰大耳白兔，皮下多点免疫，每次免疫间隔2周；
[0054]
c、第四次免疫一周后采血检测；
[0055]
d、第五次免疫一周后大量采血。
[0056]
实施例4效价检测
[0057]
elisa间接法步骤：
[0058]
a、抗原2ug/ml，每孔100ul包被，4度过夜；
[0059]
b、5％脱脂奶粉封闭，37度2个小时；
[0060]
c、用样稀将血清按1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000进行倍比稀释(以空白血清做阴性对照)，每孔100ul；
[0061]
d、37度孵育一个小时；
[0062]
e、二抗:hrp标记羊抗兔igg(1:50000)，37℃孵育30分钟；
[0063]
f、加tmb显色20分钟；
[0064]
g、终止，读数。
[0065]
效价数据：
[0066]
抗血清效价
[0067][0068][0069]
实施例5抗体纯化及纯度检测
[0070]
1、亲和层析进行纯化
[0071]
a、取prog亲和层析柱，水洗10倍柱床体积，乙酸钠缓冲冲洗10倍柱床体积；
[0072]
b、取血清/腹水样品，4℃12000rpm离心10min，收集上清，过滤；
[0073]
c、取1份血清与4份乙酸钠缓冲液混合，以0.5ml/min的速度上样，收集穿透；
[0074]
d、上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至g250检测无色(一滴滴入100ulg250)；
[0075]
e、用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰ph至中性；
[0076]
f、水洗10倍柱床体积，用10mlnacl
‑
叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；
[0077]
g、将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋；
[0078]
h、取出样品，4℃，12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃暂存，进行sds
‑
page检测；
[0079]
i、根据电泳结果估算纯度和浓度，贴标签，将纯化后抗体置于
‑
20℃保存。
[0080]
检测结果如图3所示：抗体sds
‑
page图(纯度98％)
[0081]
实施例6抗体wb检测
[0082]
wb步骤、实验条件：
[0083]
a、蛋白上样，12％电泳80v～30min，120v～60min；
[0084]
b、半干转转膜60ma，80min；
[0085]
c、封闭5％pbst脱脂牛奶25℃封闭2h；
[0086]
d、孵育一抗1:2000(5％pbst脱脂奶粉)稀释，25℃孵育1h；
[0087]
e、洗涤pbst4次*10min；
[0088]
f、二抗1:500005％pbst脱脂奶粉，25℃孵育1h；
[0089]
g、洗涤pbst4次*10min；
[0090]
h、ecl化学发光x光片显影成像；
[0091]
抗体结果如图4所示：
[0092]
结论：用大肠杆菌表达的抗原进行免疫两只兔子；wb验证样本大肠表达系统表达对应表达区域是50
‑
290aa，连接pet28a
‑
sumo
‑
jt载体，其融合蛋白理论大小为42kda左右，抗原wb结果为42kda左右，从结果条带特异性来看，wb质控通过。