黑色素瘤标志物PRRT2及其应用的制作方法

黑色素瘤标志物prrt2及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种黑色素瘤标志物prrt2及其应用。


背景技术：

2.黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，多发生于皮肤，居皮肤恶性肿瘤第3位。黑色素瘤的发病率在过去的几十年中正逐步升高，最新诊断为黑色素瘤的患者遍及世界各地并以发病率每年3
‑
8％的比例增多。恶性黑色素瘤的早期表现是在正常皮肤上出现黑色损害，或原有的黑痣于近期内扩大，色素加深。随着增大，损害隆起呈斑块或结节状，也可呈蕈状或菜花状，表面易破溃、出血。周围可有不规则的色素晕或色素脱失晕。
3.尽管技术在不断进步，但是，黑色素瘤的治疗仍然很难，尽可能在早期发现并积极治疗是唯一能治愈的途径，而早期发现，需要检测手段的不断进步，已有多项报道黑色素瘤检测的标志物。然而，公开的黑色素瘤检测的标志物仍然很少，需要进一步开发，以进行更有效的验证，或者进行多方验证。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种黑色素瘤标志物prrt2及其应用。
5.一种黑色素瘤标志物，所述标志物为prrt2蛋白或其rna。
6.所述prrt2蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no:1所示。
7.prrt2基因在黑色素瘤细胞中表达下调。
8.prrt2在制备检测黑色素瘤的试剂中的应用，所述试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测prrt2基因表达水平的试剂。
9.所述试剂包含特异性扩增prrt2基因的引物；或特异性识别prrt2基因的探针；或特异性结合prrt2蛋白的抗体。
10.一种产品，包括制剂、芯片或试剂盒，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测prrt2基因表达水平的试剂。
11.所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测prrt2基因转录水平的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的prrt2蛋白的特异性抗体。
12.所述药物包括增强prrt2基因表达的试剂。
13.本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
14.本发明的有益效果：本发明发现了一种诊断和治疗黑色素瘤的分子标志物prrt2蛋白，该标志物在黑色素瘤中表达量上升，使用该分子标志物可以判断患者肿瘤是否发生转移或发生肿瘤的风险，以期实现精准化治疗，提高患者的生存率。
附图说明
15.图1为小鼠正常表皮细胞和黑色素瘤细胞中prrt2的mrna表达量。
16.图2为人正常表皮细胞和黑色素瘤细胞中prrt2的mrna表达量。
17.图3为小鼠正常表皮细胞和黑色素瘤细胞中prrt2的蛋白水平含量。
18.图4为人正常表皮细胞和黑色素瘤细胞中prrt2的蛋白水平含量。
19.图5为分析tcga数据库中黑色素瘤患者的基因表达数据图，根据prrt2表达量的高低分为两类患者，比较这两类患者的生存期。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，为常规实验方法或按照试剂说明书规定的方法操作。
21.实施例1筛选黑色素瘤组织中差异表达基因
22.黑色素瘤为肿瘤原发病灶组织，对照为正常皮肤组织，利用tiangen公司的组织rna提取试剂盒进行总rna的提取。利用nanodrop2000对所提取的rna浓度和纯度进行检测，agilent2100测定rin值，rna完整，浓度≥20ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间，进行文库构建。应用illumina hiseq x
‑
ten第二代高通量测序技术对样品进行测序。使用软件cuffquant、cuffdiff进行mrna表达定量与差异表达分析。
23.rna
‑
seq结果显示，与对照组相比，黑色素瘤组中的prrt2表达水平显著下调。
24.实施例2 q
‑
pcr验证小鼠和人黑色素瘤prrt2表达
25.实验材料：小鼠黑色素瘤高转移细胞b16
‑
f10，小鼠黑色素瘤低转移细胞b16
‑
f1，小鼠表皮细胞jb6(购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；人黑色素瘤细胞sk
‑
mel
‑
24，人黑色素瘤细胞sk
‑
mel
‑
28，人表皮细胞hacat(购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。
26.采用tiangen公司的培养细胞总rna提取试剂盒，提取各组细胞的总rna，利用tiangen公司的逆转录试剂盒进行rna的逆转录，具体反应操作步骤如下：
27.(1)将1.0μg的总rna模板与2.0μl的5
×
gdna buffer和rnase free水混合，终体积为10μl，42℃孵育3min；
28.(2)将2.0μl的10
×
fast rt buffer、1.0μl的primerscript rt enzyme mix i与2.0μl的fq
‑
rt primer mix混合，加入10μl的去除基因组dna的反应体系和5.0μl的rnase free水，共20μl，42℃反应15min，之后95℃反应3min。
29.q
‑
pcr反应过程如下：
30.(1)引物设计
31.mouse prrt2 q
‑
pcr引物：
32.forward primer cacccaagaggaccctacca；
33.reverse primer gggaaccactgctccgttt。
34.human prrt2 q
‑
pcr引物：
35.forward primer ttctgtctgagagtgtagggg；
36.reverse primer caggctacctcggggagat。
37.利用tiangen公司的superreal premix plus试剂盒。2
×
superreal premix plus10μl，上下游引物各0.6μl，cdna模板2μl，50
×
rox reference dye 2μl，ddh
2 o 4.8μl。
38.pcr反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以sybr green作为荧光标志物，在abi 7300型荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2
‑
δδct
法进行相对定量。
39.结果如图1
‑
2所示，图1显示小鼠黑色素瘤高转移细胞b16
‑
f10和小鼠黑色素瘤低转移细胞b16
‑
f1中prrt2的mrna表达量均显著低于小鼠表皮细胞jb6；图2显示人黑色素瘤细胞sk
‑
mel
‑
24，sk
‑
mel
‑
28中prrt2的mrna表达量均显著低于人表皮细胞hacat。
40.实施例3 western blotting验证小鼠和人黑色素瘤prrt2蛋白表达
41.(1)细胞蛋白提取
42.离心收集培养的各组小鼠和人黑色素瘤细胞，每个ep管加入裂解液200μl，使用移液枪反复吸取打出溶液至裂解液中无明显沉淀后，放置冰上静置裂解30min，然后在4℃下12000r/min离心8min，吸取上清即为细胞总蛋白提取液；测定蛋白浓度；蛋白浓度<1000μg/ml时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000μg/ml时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性。
43.将蛋白标准品稀释为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1mg/ml，待测蛋白样品稀释3倍进行浓度测定。向蛋白中加入1/4的上样缓冲液，煮沸5min变性。
44.(2)western blotting
45.将得到的变性蛋白样品以10μl直接上样到电泳胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，设置初始电泳电压为80v，待上样缓冲液中的示踪染料至浓缩胶与分离胶交界处，将电压调至90v。示踪染料到达胶的底端停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用pvdf膜进行转膜，转膜电压为100v，转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液中，于摇床上常温封闭3.5h，然后用洗膜液洗膜3次，加入待测蛋白的一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，4℃孵育3h后洗膜，然后进行显影。
46.结果如图3
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4所示，图3显示小鼠黑色素瘤高转移细胞b16
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f10和小鼠黑色素瘤低转移细胞b16
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f1中prrt2蛋白的表达量均显著低于小鼠表皮细胞jb6；图4显示人黑色素瘤细胞sk
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mel
‑
24，sk
‑
mel
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28中prrt2蛋白的表达量均显著低于人表皮细胞hacat。
47.实施例4 prrt2表达量与黑色素瘤患者的生存期关联分析
48.从tcga数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载肿瘤患者的mrna数据和每位患者的临床信息，选择黑色素瘤患者的数据做后续分析，共有451个黑色素瘤样本。
49.使用r程序包中的edger package(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edger.html)进行基因表达分析，根据prrt2的表达水平将451名黑色素瘤患者分为低表达组和高表达组。再进行kaplan
‑
meier生存分析，根据two
‑
sided long
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rank test计算p值，p值小于0.05说明两组之间的生存曲线具有统计学差异。
50.分析tcga数据库中黑色素瘤患者的基因表达数据，根据prrt2表达量的高低分为两类患者，比较这两类患者的生存期。结果如图5所示，发现prrt2表达量高的患者，生存期明显优于prrt2表达量低的患者。
51.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。