一种氨氧化细菌的接合转移方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种氨氧化细菌的接合转移方法。

背景技术：

耐药基因作为新型环境污染物，已有的研究表明，耐药基因进入污水生物处理系统后，对生物污水处理效率尤其是脱氮效率产生影响。亚硝化反应是污水系统生物脱氮的关键反应，是由氨氧化菌(aob)完成的，这个过程包括氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase,amo)催化氨成为羟胺，以及羟胺由羟胺氧化酶(hydroxylamineoxidoreductase,hao)催化生成亚硝酸盐。氨氧化菌是革兰氏阴性菌，归属于proteobacteria门的β-proteobacteria纲或γ-proteobacteria纲，被认为是污水生物处理系统中最为敏感、脆弱的代谢途径，是系统稳定运行的关键环节。目前仍未见到构建载带有耐药质粒的氨氧化菌的方法，本方法提供了一种氨氧化细菌atcc19718的接合转移方法，可用于构建载带有耐药质粒的氨氧化菌模型，用于研究耐药基因对氨氧化过程的影响及机制。

目前主要建立的接合转移方法主要针对异养菌如e.coli，氨氧化细菌是一种化能自养菌，目前尚没有见到关于氨氧化细菌接合转移方法的相关报道。

因此，如何提供一种氨氧化细菌接合转移方法是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明公开了一种氨氧化细菌的接合转移方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种氨氧化细菌的接合转移方法，步骤包括：

(1)供体菌富集培养

将目的质粒导入供体菌中，得目的供体菌，而后将供体菌富集培养，得活化目的供体菌；

(2)氨氧化细菌富集培养

将氨氧化细菌富集培养，得活化氨氧化细菌；

(3)氨氧化细菌接合转移

将活化目的供体菌和活化氨氧化细菌混合并加入缓冲液，调至活化目的供体细菌终浓度为2×10⁸cfu/ml，活化氨氧化细菌终浓度为10⁸cfu/ml；培养4h以上，得接合转移菌液；

优选的，供体菌为大肠杆菌；

更优选的，供体菌为hb101；

优选的，目的质粒为rp4；

优选的，氨氧化细菌为atcc19718；

步骤(1)中，活化目的供体菌的浓度为10⁹cfu/ml；

优选的，所述供体菌富集培养基为lb培养基；

优选的，所述供体菌富集培养时间为8h；

步骤(2)中，活化氨氧化细菌的浓度为10⁹cfu/ml；

优选的，所述氨氧化细菌富集培养基成分包括：0.25g/l硫酸铵、1.0g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁、2.0g/l氯化钠、0.4g/l七水合硫酸亚铁和5.0g/l碳酸钙，溶液为水；

步骤(3)中，所述缓冲液成分包括：0.5g/l硫酸铵、2.0g/l磷酸氢二钾、1.5g/l七水硫酸镁、20g/l胰化蛋白胨、10g/l酵母提取物，1.0g/l七水合硫酸亚铁和10.0g/l氯化钠，溶液为水；

步骤(3)中，培养温度为26℃；

步骤(3)中，转速为100rpm；

还包括：(4)氨氧化细菌接合转移的鉴定方法，具体步骤为：将权利要求1步骤(3)的接合转移菌液置于选择培养基中筛选，长出的红色菌落，即为成功转入目的质粒的氨氧化细菌；

选择培养基包括：2.0g/l硫酸铵、0.75g/l磷酸氢二钾、0.25g/l磷酸二氢钠、0.01g/l七水硫酸镁、0.03g/l硫酸锰、0.1g/l碳酸钠和15g/l琼脂粉、80mg/l氨苄青霉素、60mg/l卡那霉素和40mg/l盐酸四环素，溶液为水；

培养温度为26℃，培养时间为5-7天。

综上所述，本发明公开了一种氨氧化细菌的接合转移方法，包括：(1)供体菌富集培养、(2)氨氧化细菌富集培养和(3)氨氧化细菌接合转移步骤，可以将目的质粒有效转化进入氨氧化细菌中，转化率高达0.001％，为自养型氨氧化细菌的接合转移打下基础。

附图说明

图1为atcc19718菌株在选择培养基上的菌落形态；

图2为接合转移后在选择培养基平板中生长5-7天后的菌落形态；

图3为阳性氨氧化细菌的pcr验证图片；m为marker，p为阳性对照，s为阳性菌落。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

atcc19718菌株购于美国americantypeculturecollection；rp4质粒来自riceuniversity；大肠杆菌hb101购自试剂公司；

氨氧化细菌富集培养基的配置：以水为溶液，将各物质成分调至以下浓度：0.25g/l硫酸铵、1.0g/l磷酸氢二钾、0.5g/l七水硫酸镁、2.0g/l氯化钠、0.4g/l七水合硫酸亚铁和5.0g/l碳酸钙，得氨氧化细菌富集培养基，高温灭菌后备用；

供体菌富集培养：为lb液体培养基；

接合转移缓冲液的配置：以水为溶液，将各物质成分调至以下浓度：0.5g/l硫酸铵、2.0g/l磷酸氢二钾、1.5g/l七水硫酸镁、20g/l胰化蛋白胨、10g/l酵母提取物，1.0g/l七水合硫酸亚铁和10.0g/l氯化钠，得接合转移缓冲液，高温灭菌后备用；

结合转移选择培养基的配置：以水为溶液，将各物质成分调至以下浓度：2.0g/l硫酸铵、0.75g/l磷酸氢二钾、0.25g/l磷酸二氢钠、0.01g/l七水硫酸镁、0.03g/l硫酸锰、0.1g/l碳酸钠和15g/l琼脂粉，高压灭菌后，待培养基温度降至50℃以下，加入抗生素并调至以下浓度：氨苄青霉素80mg/l、卡那霉素60mg/l和盐酸四环素40mg/l，得选择培养基，并将倒入平皿中制成结合转移选择培养基平板。

实施例1

一种氨氧化细菌的接合转移方法，其特征在于，步骤包括：

(1)供体菌富集培养

将带耐药质粒rp4质粒采用热激转化导入大肠杆菌hb101中，用含有80mg/l氨苄青霉素、60mg/l卡那霉素和40mg/l盐酸四环素的lb培养基纯化5次后得hb101-rp4目的供体菌，将hb101-rp4目的供体菌通过含有80mg/l氨苄青霉素、60mg/l卡那霉素和40mg/l盐酸四环素的lb培养基培养8h以上，浓度达到10⁹cfu/ml备用，得活化目的供体菌。

(2)氨氧化细菌富集培养

将atcc19718菌在富集固体培养基上活化，结果如图1所示，再接种至富集液体培养基中，培养20天以上，浓度达到10⁹cfu/ml备用，得活化氨氧化细菌。

(3)氨氧化细菌的接合转移

取活化目的供体菌10ml，活化氨氧化细菌5ml，8000rpm离心5min，弃上清，分别以3ml磷酸盐缓冲液重悬备用，得活化目的供体菌重悬液和活化氨氧化细菌重悬液；

活化目的供体菌重悬液和活化氨氧化细菌重悬液加入50ml接合转移缓冲液中，混匀，置于26℃环境下，摇床转速为100rpm，4小时，得接合转移菌液。

(4)氨氧化细菌接合转移的鉴定

取接合转移菌液500μl，加入结合转移选择培养平板涂抹均匀，置于26℃培养箱中培养5-7天，平板上长出的红色菌落即为成功得到的载带有耐药质粒rp4的氨氧化细菌(成功接合转移的氨氧化细菌)，结果如图2所示。

成功接合转移的氨氧化细菌进行pcr验证：以rp4质粒特征的trag片段作为目的序列进行pcr验证，产物大小约104bp，引物序列和反应条件如表格1所示，结果如图3所示。

通过公式计算结合率，结合率＝抗性平板筛选到的抗性菌落数/受体菌数目；经计算接合转移方法的结合率约为0.001％。

表1

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。