超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法与流程

1.本发明属于植物有效成分提取纯化技术领域，尤其涉及一种超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法。


背景技术：

2.目前，南瓜的种子成熟后就是所谓的南瓜子，其含有多种营养成分如脂肪、蛋白质、及钙、镁、铁、钾、钠、硒等多种矿元素，是一种药食两用的中药，具有下乳、驱虫、利水、健脾、润肺的药用功效，中医史书《滇南本草》中记载：“南瓜性温”、味甘无毒，入脾、味二经，能驱虫解读、化痰排脓、润肺益气，治便秘、哮喘、咳嗽等症。因此，南瓜子被公认为一种能特效的具有保健功能的食品，尤其具有特别高的研发价值。
3.现阶段市面的南瓜子蛋白含量多为60％，且通过机械压榨或者有机溶剂萃取等方式大生产，存在溶剂残留、脂肪残留高和蛋白变性风味不佳等缺点，高含量南瓜子蛋白市面少见，要不通过碱提酸沉工艺得到纯化后的南瓜子蛋白，但通过有化学处理后的南瓜子蛋白失去了南瓜子蛋白的浓香、独特风味，如果能通过现代设备代替传统工艺，无化学试剂残留，又能突破市面南瓜子蛋白的含量低，提升南瓜子油的收率和品质，且回收利用南瓜子氨酸的方法，产生更多有价值的产品将值得期待。
4.例如：申请公布号cn105132143a，申请公布日2015年12月9日的中国专利公开的一种南瓜籽油超临界萃取工艺，其制备方法是通过超临界通过co2超临界萃取和超微过滤的步骤，得到高品质南瓜籽油；申请公布号cn106831941a，申请公布日2017年6月13日的中国专利公开了一种南瓜籽饼粕的资源化利用方法，其通过超声提取脱脂，后用碱溶酸沉法得到大于70％的分离南瓜子蛋白，达南瓜子饼粕资源化综合利用的途径，另外申请公布号cn200510115180.9，申请公布日2006年5月3日的中国专利公开了一种提取南瓜籽油及南瓜籽蛋白的方法，其发明提供一种提取富含亚油酸南瓜籽油和富含精氨酸南瓜籽蛋白的方法，采用发芽的南瓜籽作为原料，提高了南瓜籽的有效成分，有效去除南瓜籽中的抗营养因子，较好地保持了南瓜籽蛋白和南瓜籽油的功能成份的稳定性。该方案是得到一种富含亚油酸南瓜籽油和富含精氨酸南瓜籽蛋白的发明，是采用发芽的南瓜子为原料进行磨浆，酶解；再将酶解得到的油水混合物进行分离，油相为南瓜籽油，水相为南瓜籽蛋白溶液，对南瓜子中有效成分南瓜子氨酸未做分离；专利申请公布号cn106831941a，申请公布日2017年6月13日的中国专利公开了一种南瓜籽饼粕的资源化利用方法，其通过超声提取脱脂，后用碱溶酸沉法得到大于70％的分离南瓜子蛋白，为南瓜子饼粕资源化综合利用的途径，该技术要用超声提取设备，主要产品为南瓜籽蛋白；申请公布号cn105132143a，申请公布日2015年12月9日的中国专利公开的一种南瓜籽油超临界萃取工艺，其制备方法是通过超临界通过co2超临界萃取和超微过滤的步骤，得到高品质南瓜籽油；获得得是保留了南瓜籽特有的黄酮类物质、植物甾醇和维生素e等活性物质，无溶剂残留、无污染、安全性好、油品品质高的南瓜籽油，目前未见南瓜子氨酸的生产发明。
5.医学研究表明，南瓜子中的有效化学成分为南瓜子氨酸，可以驱除涤虫、蛔虫等多
种常见的寄生虫，因其驱虫的特点为无毒性，不产生任何副作用，已经被称为驱虫的“爽口良药”，适用于临床治疗老人和儿童腹痛腹胀及寄生虫等病症；另外南瓜子氨酸能缓解天然过敏源引起的过敏等的功效，适用于天然过敏源或滥用美容药物引起的各种过敏,是目前治疗变态反应所形成的过敏症最安全和最简便的方法。南瓜子氨酸可以抑制组氨酸脱羧酸活性，从而降低血清和组织中组胺的浓度。众所周知，组胺是过敏反应的介质。现代医学对肺炎和皮肤的变态反应的有效治疗办法并不多，常用抗过敏药物，并要限量小心使用。如对支气管哮喘、肌肉用力剧痛、痉挛性鼻炎、气管炎、枯草热、因变态反应引起的茸麻疹、湿疹、皮肤红斑、痉挛、昆克氏水肿、结膜炎及医源性药物过敏等，常给医生们带来颇为头痛的间题。南瓜子氨酸及其盐或脂组成的药剂，则能对上述多种变态反应有预防和治疗作用。用南瓜子氨酸作为抗过敏、减轻和治疗过敏反应是一种最简便而安全的方法。因此上，它也是解决皮肤过敏和美容的好帮手。
6.目前国内对高纯度南瓜子氨酸制备的报道比较少，主要是针对低含量南瓜子氨酸的应用和提取进行研究。其授权公告号cn1065009，授权公告日19921007的中国专利公开的南瓜子氨酸制备美容或药用，特别是皮肤病和抗变态反应用组合物方法，另外1998年南瓜子氨酸的提取及用途，作者范镇基对南瓜子进行己烷萃取，用0.1％硫酸水溶液在室温下对南瓜子粉进行提取得粗提物，然后用粗提物上离子交换树脂分离纯化，冷冻干燥得到南瓜子氨酸纯品；南瓜子中营养成分的分析研究(论文作者：马勤超)，采用超声对南瓜子氨酸进行提取，筛选了最佳提取条件。现在人们对健康保健意识的提高，对植物蛋白的需求增大，同时对资源的综合利用提出了更高的要求，面对被公认具有特效保健食品功能的南瓜子要更深入的体现其综合药食两用的价值。综上分析，现有南瓜子氨酸的分离工艺在大生产中未见应用，且产品纯度低，南瓜子氨酸的提取分离多见学术报告和实验室小试分离。现有技术对南瓜子产品未综合利用，其生产所得产品主要是高品质南瓜子油和南瓜子蛋白，对南瓜子中的有效化学成分—南瓜子氨酸未做分离研究。市面应用的南瓜子氨酸含量低，且以南瓜子氨酸盐的形式存在，应用范围和功效研究有局限。
7.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中超临界生产的南瓜子蛋白含量低，同时在制备南瓜子氨酸过程中，水浸泡工序导致南瓜子中有效成分南瓜子氨酸大量损失，需要处理大量废水。
8.解决以上问题及缺陷的难度为：南瓜子蛋白浸泡直接上阳离子交换树脂难吸附，上样吸附量非常低，并且上样过程存在有效成分一直泄露的情况，另外南瓜子蛋白浸泡液容易变质发酸发霉，本发明采用酶解和膜处理两种方式相结合，去除不利于阳离子吸附的杂质，便于树脂吸附，另外本发明南瓜子氨酸结晶条件的选择难度很大，由于产品收率低，操作难度大，本发明经过大量实验验证，筛选出有利于南瓜子氨酸结晶的条件，为南瓜子氨酸工业化生产奠定一定经验基础。
9.解决以上问题及缺陷的意义为：南瓜子氨酸又名(3r)
‑3‑
氨基吡咯烷
‑3‑
羧酸，天然南瓜子氨酸是左旋3
‑
氨基
‑3‑
羧基氮戊环，目前市面南瓜子氨酸多为30％规格，更高纯度的南瓜子氨酸产品很少，并且该产品可以通过合成的方式制备，但合成产品采用大量有机溶剂，工艺繁琐，产品的安全性值得考量，本发明通过反复实验，摸索出了一种天然南瓜子氨酸的制备方法，整过实验过程不使用有毒有害的溶剂，且每个工艺步骤都可以转化率工业生产模式，本发明为工业生产南瓜子氨酸奠定了基础，并且本发明制备的南瓜子氨酸产
品纯度高，为南瓜子氨酸的应用提供了更多的验证可能，目前南瓜子氨酸制备美容或药用，特别是皮肤病和抗变态反应用组合物方面效果显著，且根据报道研究表明南瓜籽氨酸对全身过敏性反应者，皮肤湿疹、红肿、痉挛、发炎等有很好的疗效。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法。本发明提供了一种南瓜子氨酸的工业生产工艺，从处理南瓜籽蛋白的废液中分离纯化得到高含量南瓜子氨酸产品，提高南瓜子系列产品的附加值。旨在解决水浸泡工序导致南瓜子中有效成分南瓜子氨酸大量损失，同时需要处理大量废水的问题。
11.本发明是这样实现的，一种超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法，所述超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法，包括：
12.步骤一，将超临界南瓜子蛋白用纯化水温浸1
‑
2次，采用匀浆泵分散南瓜子蛋白，采用卧式离心机分离南瓜子蛋白和浸出液，收集浸出液得到南瓜子蛋白南瓜子氨酸水溶液；
13.步骤二，将收集浸出液进行酶解，有机膜过滤、过滤液通过阳离子交换树脂柱吸附洗脱、浓缩、结晶，粗品再通过弱碱阴离子交换树脂处理得到南瓜子氨酸处理液；
14.步骤三，将步骤二得到南瓜子氨酸处理液再经过浓缩、结晶、重结晶以及干燥，得到南瓜子氨酸产品。
15.进一步，所述步骤一中，南瓜子浸出液是超临界生产的南瓜籽蛋白，蛋白含量为60
‑
65％，残油4
‑
8％；
16.浸出液为南瓜子蛋白用适量水温浸，除去水溶性多糖、盐分、有机酸、氨基酸提高南瓜籽蛋白风味和品质的过程产生的，其南瓜子蛋白含量达70％以上。
17.进一步，所述步骤一中，收集浸出液得到南瓜子蛋白南瓜子氨酸水溶液具体过程为：
18.将超临界生产的南瓜子蛋白用5
‑
8倍量的水50℃在不锈钢反应中搅拌分散，之后用匀浆泵分散南瓜子蛋白，再用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白或浸出液，充分1
‑
2次，得到处理后的南瓜子蛋白和含南瓜子氨酸的浸出液。该步骤通过水浸泡南瓜子蛋白，去除水溶性多糖、盐分、有机酸，氨基酸使南瓜子粗蛋白含量增高，风味更独特。
19.进一步，所述步骤二中，将收集浸出液进行酶解中向含南瓜子氨酸的浸出液中加入果胶酶、纤维素酶木瓜蛋白酶、淀粉酶中的至少一种；
20.所述酶解所需的生物酶用量为浸出液的千分之一到千分之五，酶解温度为45
‑
55℃，所述酶解时间为2
‑
4小时。
21.进一步，所述步骤二中，有机膜过滤使用截留量为500—2000分子量的有机膜，过滤压力为0.45
‑
2.0mpa，得预纯化液。该步骤的目的是通过酶解、膜过滤等方式去除杂质，避免南瓜子氨酸水溶液上样变质，发酸，便于南瓜子氨酸在阳离子交换树脂的吸附，如果不经过本步骤处理，南瓜子蛋白浸出液溶液变质，发霉，发酸，液体不澄清，另外在上阳离子交换树脂时有效成分一致泄露，无法充分有效的交换南瓜子氨酸到阳离子树脂上，便于南瓜籽氨酸产品纯化。
22.进一步，所述步骤二中，阳离子交换树脂柱吸附洗脱中阳离子交换树脂为001*7、
d001等树脂中的一种；
23.预处理阳离子交换树脂通过以下方法制得：将阳离子交换树脂用3
‑
6倍体积的乙醇浸泡4
‑
8h，滤除乙醇后用纯化水洗涤树脂后装柱，再用5
‑
10倍树脂体积的1mol/l的盐酸纯化水溶液进行淋洗交换，放置3
‑
5h后用纯化水淋洗至中性，接着用5
‑
10倍柱体积的0.5mol/l的氢氧化钠溶液进行淋洗交换，最后用8
‑
12倍树脂体积的1mol/l盐酸进行淋洗交换后，用纯化水洗至中性，即得预处理的强酸性阳离子交换树脂层析柱。
24.进一步，所述预处理的预纯化液通过预处理的强酸性阳离子交换树脂，其流速为0.5
‑
1bv/h；纯化水洗涤阳离子交换树脂倍量为2
‑
4bv，流速1
‑
3bv/h；所洗脱用碱液为0.8％
‑
1.2％氨水或者0.8
‑
1.2％的氢氧化铵的水溶液进行淋洗交换，碱洗脱液用量为5
‑
8bv；流速为0.8
‑
2bv；
25.所得碱洗脱液减压浓缩至干，再加水溶解，再浓缩至无氨味，再加适量水溶解，之后用适量的乙醇处理后加入过氯酸至ph＝4.5—6.3，放置析晶，滤过，所得结晶用稀乙醇反复重结晶2
‑
3次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐；
26.所得的南瓜子氨酸过氯酸盐加适量水溶解，通过弱碱型阴离子交换树脂柱，并用纯化水洗涤，得到脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸水溶液。
27.进一步，所述步骤二中，弱碱阴离子交换树脂型号为d750、d311、d363及d315中的一种，按阴离子离子树脂常规方法预处理后，最后用无机酸盐酸、甲酸、乙酸配成0.1
‑
1.5mol/l的溶液淋洗交换，用量为3
‑
5bv，流速1
‑
2bv/h，最后用纯化水洗至中性，加待纯化的南瓜子氨酸过氯酸盐溶液，通过阴离子交换树脂，流速为0.5
‑
1bv/h，最后用1
‑
2bv纯化水洗涤，流速0.5
‑
1.5bv/h。
28.进一步，所述步骤三中，将得到南瓜子氨酸处理液再经过浓缩、结晶具体过程为：
29.将得到的脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸水溶液减压浓缩，析晶，结晶温度0
‑
4℃，结晶时间大于4h，离心得到南瓜子氨酸初品。
30.进一步，所述步骤三中，重结晶条件为初结晶用40
‑
80％乙醇3
‑
6倍量溶解，溶解温度为60
‑
80℃，之后过滤，适量浓缩至1
‑
3倍粗品的重量后，室温静置24h以上析晶，离心过滤得南瓜子氨酸，该步骤通过实验反复优化的条件，对南瓜子氨酸进行重结晶，使南瓜子氨酸产品含量得到大幅提升。
31.本发明的另一目的在于提供一种由所述超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法制备的南瓜子氨酸。
32.本发明的另一目的在于提供一种驱除寄生虫的药物，所述驱除寄生虫的药物包含有所述的南瓜子氨酸。
33.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：与目前现有的技术南瓜子氨酸高含量产品很难实现量产，低纯度的南瓜子氨酸功效研究收局限，现有的技术主要是针对南瓜籽分离蛋白和高品质南瓜子油进行研究和创新，对南瓜子氨酸分离纯化的大生产技术较少，分离纯化南瓜子中主要药效成分南瓜子氨酸，对南瓜子蛋白、南瓜籽油及南瓜子氨酸综合利用，寻找一种制备高纯度南瓜子氨酸的生产方法。
34.本发明中南瓜子蛋白浸出液富含水溶性多糖、单糖、蛋白质、氨基酸、有机酸和无机盐等，直接采用阳离子交换树脂分离南瓜子氨酸树脂吸附量低，所得产品含量低，无法进一步纯化，并且溶液ph对阳离子交换树脂的吸附影响较大，所以本发明采用生物酶对南瓜
子蛋白浸出液先进行酶解处理，对大分子蛋白质、多糖进行分解，再后续处理。
35.本发明中采用膜过滤技术，对大分子和无机盐进行截留，同时除掉水溶性色素，也是对待分离的南瓜籽蛋白液进行纯化分离，该技术方式连续性强，温度低，操作简便，效率高，所得的膜过滤液澄清，便于后续溶液离子交换树脂对南瓜子氨酸的纯化。经过阳离子交换树脂纯化的南瓜子氨酸含有氨水，所以需要在浓缩后采用水溶解，乙醇结晶，得到南瓜子氯氨酸盐，该步骤乙醇浓度及溶液ph值的选择对结晶影响较大，所以本发明中采用的过氯酸调ph＝4.5
‑
6.2和相应的乙醇浓度是经过实验优化的条件。为得到高含量南瓜子氨酸产品，必须除掉过氯酸根离子，本发明中采用的阴离子交换树脂交换过氯酸根离子，得到高纯度南瓜子氨酸水溶液，所采用的无机酸溶液的浓度是经过实验优化的最佳条件。
36.同时本发明超临界二氧化碳生产的南瓜子蛋白含量由原来的60
‑
65％提高到70％以上，且口感、特有南瓜子浓香气味依然保持；采用酶解、有机膜过滤、阳离子交换树脂和阴离子树脂连续纯化，对粗品采用乙醇加热溶解等多种分离除杂手段相结合，得到高纯度南瓜子氨酸。整体方式适合工业化生产，操作简便，可操作性强，且无污染。
附图说明
37.为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1是本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法流程图。
39.图2是本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸工艺过程示意图。
40.图3是本发明实施例提供的南瓜子氨酸对照图谱示意图。
41.图4是本发明实施例提供的南瓜子氨酸样品图谱示意图。
具体实施方式
42.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。该发明阐述了一中提高南瓜子粗蛋白含量的生产方案和结合现代酶解、膜分离技术、离子交换等多种分离纯化技术相结合的方式纯化南瓜子氨酸产品，使南瓜子氨酸产品纯度相对高，且整个工艺过程绿色环保，工艺操作性强，凡是通过本发明者的纯化方式进行组合分离南瓜子氨酸均在该发明保护范围内，为了生产操作快捷简便，也可以采用更适合和先进的设备进行组合，只要能满足该工艺背景的要求即可，也可对整个生产过程采用电器自动化监测，对产品成分的跟踪可以薄层鉴别和液相检测相结合的方式进行。
43.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
44.如图1所示，本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
45.s101：将超临界南瓜子蛋白用纯化水温浸1
‑
2次，采用匀浆泵分散南瓜子蛋白，采用卧式离心机分离南瓜子蛋白和浸出液，收集浸出液得到南瓜子蛋白南瓜子氨酸水溶液。
46.s102：将收集浸出液进行酶解，有机膜过滤、过滤液通过阳离子交换树脂柱吸附洗脱、浓缩、结晶，粗品再通过弱碱阴离子交换树脂处理得到南瓜子氨酸处理液。
47.s103：将s102得到南瓜子氨酸处理液再经过浓缩、结晶、重结晶以及干燥，得到南瓜子氨酸产品。
48.本发明提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法仅仅是一个具体实施例而已。
49.其中，本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法，具体过程为：在不锈钢反应釜中加入5
‑
8倍纯化水，升温至50℃，开启搅拌，将超临界二氧化碳生产的南瓜子蛋粉缓慢加入不锈钢反应釜中，持续搅拌4h，保温45
‑
55℃之间，待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1
‑
2小时后取样手感无颗粒状态即可，之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，重复上述步骤1
‑
2次，南瓜子蛋白进行灭菌干燥处理，合并南瓜子蛋白浸出液备制备南瓜子氨酸使用。
50.将南瓜子浸出液适量浓缩，保温，对南瓜子浸出液酶解处理，所述的酶解过程中使用的生物酶选自果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶或者淀粉酶中的至少一种。
51.优选的酶解温度45
‑
55℃，所述酶解时间为2
‑
4小时，所述的酶的加入量为待酶解的南瓜子浸出液体积的千分之一到千分之五。
52.将上述酶解液利用有机膜进行过滤除杂，除去大分子物质并脱色，使南瓜子氨酸终产品颜色更纯正。该步骤优选的膜孔径为500—2000分子量的有机膜，过滤压力为0.45
‑
2.0mpa，得预纯化液。
53.将上述预处理的液体进行阳离子树脂交换，阳离子交换树脂为001*7(732型)、d001等树脂中的一种，预处理阳离子交换树脂通过以下方法制得：将阳离子交换树脂用3
‑
6倍体积的乙醇浸泡4
‑
8h，滤除乙醇后用纯化水洗涤树脂后装柱，再用5
‑
10倍树脂体积的1mol/l的盐酸纯化水溶液进行淋洗交换，放置3
‑
5h后用纯化水淋洗至中性，接着用5
‑
10倍柱体积的0.5mol/l的氢氧化钠溶液进行淋洗交换，最后用8
‑
12倍树脂体积的1mol/l盐酸进行淋洗交换后，用纯化水洗至中性，随后采用预纯化的南瓜子氨酸水液通过该阳离子交换树脂柱。
54.优选的是预纯化的南瓜子氨酸水液速为0.5
‑
1bv/h；纯化水洗涤阳离子交换树脂倍量为2
‑
4bv，流速1
‑
3bv/h；所洗脱用碱液为0.8％
‑
1.2％氨水或者0.8
‑
1.2％的氢氧化铵的水溶液进行淋洗交换，碱洗脱液用量为5
‑
8bv；流速为0.8
‑
2bv，合并碱洗液。
55.将碱洗液真空减压浓缩至干，再加水溶解，再浓缩至无氨味，再加适量水溶解，之后用适量的乙醇处理后加入过氯酸至ph＝4.5
‑
6.2,放置析晶，滤过，所得结晶用稀乙醇反复重结晶2
‑
3次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
56.将纯品南瓜子氨酸过氯酸盐加5
‑
10倍纯化水溶溶解，通过弱碱型阴离子交换树脂柱，并用纯化水洗涤，得到脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸水溶液。
57.优选的弱碱阴离子交换树脂型号为d750、d311、d363及d315中的一种，按阴离子离子树脂常规方法预处理后，最后用无机酸盐酸、甲酸、乙酸配成0.1
‑
1.5mol/l的溶液淋洗交换，用量为3
‑
5bv，流速1
‑
2bv/h，最后用纯化水洗至中性，加待纯化的南瓜子氨酸过氯酸盐溶液，通过阴离子交换树脂，流速为0.5
‑
1bv/h，最后用1
‑
2bv纯化水洗涤，流速0.5
‑
1.5bv/h，得到脱色过氯酸根离子的南瓜子氨酸水液。
58.将南瓜子氨酸水液真空减压浓缩，析晶，离心得到南瓜子氨酸初品。优选的析晶条件温度0
‑
4℃，结晶时间大于4h。将粗晶采用稀乙醇重结晶，优选的重结晶条件：乙醇浓度40％
‑
80％，倍量：3
‑
6倍，温度：60
‑
80℃，之后过滤，适量浓缩至1
‑
3倍粗品的重量后，室温静置24h以上析晶。
59.本发明实施例提供的s101中，南瓜子浸出液是超临界生产的南瓜籽蛋白(蛋白含量为60
‑
65％，残油4
‑
8％)；浸出液为南瓜子蛋白用适量水温浸，除去水溶性多糖、盐分等提高南瓜籽蛋白风味和品质的过程产生的，其南瓜子蛋白含量达70％以上。
60.本发明实施例提供的s101中，收集浸出液得到南瓜子蛋白南瓜子氨酸水溶液具体过程为：
61.将超临界生产的南瓜子蛋白用5
‑
8倍量的水50℃在不锈钢反应中搅拌分散，之后用匀浆泵分散南瓜子蛋白，再用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白或浸出液，充分1
‑
2次，得到处理后的南瓜子蛋白和含南瓜子氨酸的浸出液。
62.本发明实施例提供的s102中，将收集浸出液进行酶解中向含南瓜子氨酸的浸出液中加入果胶酶、纤维素酶木瓜蛋白酶、淀粉酶中的至少一种。
63.所述酶解所需的生物酶用量为浸出液的千分之一到千分之五，酶解温度为45
‑
55℃，所述酶解时间为2
‑
4小时。
64.本发明实施例提供的s102中，有机膜过滤使用截留量为500—2000分子量的有机膜，过滤压力为0.45
‑
2.0mpa，得预纯化液。
65.本发明实施例提供的s102中，阳离子交换树脂柱吸附洗脱中阳离子交换树脂为001*7(732型)、d001等树脂中的一种；
66.预处理阳离子交换树脂通过以下方法制得：将阳离子交换树脂用3
‑
6倍体积的乙醇浸泡4
‑
8h，滤除乙醇后用纯化水洗涤树脂后装柱，再用5
‑
10倍树脂体积的1mol/l的盐酸纯化水溶液进行淋洗交换，放置3
‑
5h后用纯化水淋洗至中性，接着用5
‑
10倍柱体积的0.5mol/l的氢氧化钠溶液进行淋洗交换，最后用8
‑
12倍树脂体积的1mol/l盐酸进行淋洗交换后，用纯化水洗至中性，即得预处理的强酸性阳离子交换树脂层析柱。
67.其中，预处理的预纯化液通过预处理的强酸性阳离子交换树脂，其流速为0.5
‑
1bv/h；纯化水洗涤阳离子交换树脂倍量为2
‑
4bv，流速1
‑
3bv/h；所洗脱用碱液为0.8％
‑
1.2％氨水或者0.8
‑
1.2％的氢氧化铵的水溶液进行淋洗交换，碱洗脱液用量为5
‑
8bv；流速为0.8
‑
2bv。
68.所得碱洗脱液减压浓缩至干，再加水溶解，再浓缩至无氨味，再加适量水溶解，之后用适量的乙醇处理后加入过氯酸至ph＝4.5—6.3，放置析晶，滤过，所得结晶用稀乙醇反复重结晶2
‑
3次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
69.所得的南瓜子氨酸过氯酸盐加适量水溶解，通过弱碱型阴离子交换树脂柱，并用纯化水洗涤，得到脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸水溶液。
70.本发明实施例提供的s102中，弱碱阴离子交换树脂型号为d750、d311、d363及d315中的一种，按阴离子离子树脂常规方法预处理后，最后用无机酸盐酸、甲酸、乙酸配成0.1
‑
1.5mol/l的溶液淋洗交换，用量为3
‑
5bv，流速1
‑
2bv/h，最后用纯化水洗至中性，加待纯化的南瓜子氨酸过氯酸盐溶液，通过阴离子交换树脂，流速为0.5
‑
1bv/h，最后用1
‑
2bv纯化水洗涤，流速0.5
‑
1.5bv/h。
71.本发明实施例提供的s103中，将得到南瓜子氨酸处理液再经过浓缩、结晶具体过程为：
72.将得到的脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸水溶液减压浓缩，析晶，结晶温度0
‑
4℃，结晶时间大于4h，离心得到南瓜子氨酸初品。
73.本发明实施例提供的s103中，重结晶条件为初结晶用40
‑
80％乙醇3
‑
6倍量溶解，溶解温度为60
‑
80℃，之后过滤，适量浓缩至1
‑
3倍粗品的重量后，室温静置24h以上析晶，离心过滤得南瓜子氨酸。
74.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
75.实施例1
76.本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
77.(1)称取临界生产的南瓜子蛋白500kg，蛋白含量为61.44％，南瓜子氨酸含量2.76％(hplc)；不锈钢反应釜中加入纯化水3000l，升温至50℃，之后开启搅拌，投入南瓜子蛋白，边加边搅拌，投完料后升温至50℃，持续搅拌3h,待待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1h,之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，之后南瓜子蛋白灭菌，喷雾干燥，所得产品为423kg，蛋白含量为71.4％，所得南瓜子蛋白浸出液2130l，之后将南瓜子蛋白浸出液浓缩至1500l，待酶解。
78.(2)待酶解的南瓜子浸出液保温至48℃，添加果胶酶1kg，淀粉酶2kg，酶解4h，得到酶解后的南瓜子蛋白浸出液，冷却至室温。酶解液800分子量的有机膜，进膜压力1.2mpa，过膜液直接进预处理好的阳离子交换树脂，进完后用2.5倍柱体积的纯化水洗涤，再用1％的氨水7倍量洗脱，得到纯化后的南瓜子氨酸水溶液，碱洗液用球形浓缩器浓缩至稠膏，加60kg纯化水再次浓缩，直至无氨味，之后放出浸膏，加入25kg纯化水，再入8倍量95％乙醇，放置过滤，滤液加入过氯酸至ph＝4.8，放置冷库过夜析晶，粗结晶用50％乙醇反复结晶两次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
79.(3)南瓜子氨酸过氯酸盐加6倍纯化水溶解，通过已处理好的阴离子交换树脂，流速为0.8bv柱体积，之后水洗1.5bv柱体积，合并脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸溶液，真空减压浓缩，温度65℃，浓缩至浸膏18kg后室温放置6h，析晶，之后离心过滤。
80.(4)南瓜子氨酸粗晶，用4倍量80％乙醇加热至60℃搅拌溶解，之后过滤，浓缩至12kg，加入20g南瓜子氨酸晶种，放置室温24h，析晶，过滤，得到7.3kg南瓜子氨酸产品，产品南瓜子氨酸经hplc检测含量为93.6％。
81.实施例2
82.本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
83.(1)超临界生产的南瓜子蛋白500kg，蛋白含量为62.47％，南瓜子氨酸含量2.68％
(hplc)；不锈钢反应釜中加入纯化水3000l，升温至50℃，之后开启搅拌，投入南瓜子蛋白，边加边搅拌，投完料后升温至50℃，持续搅拌3h，待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1h，之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，离心后的南瓜子蛋白在用3000l纯化水50℃搅拌3h，匀浆1h，同样采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，之后南瓜子蛋白灭菌，喷雾干燥，所得产品为412kg,蛋白含量为74.3％；合并南瓜子蛋白浸出液，浓缩至2000l左右，待酶解处理。
84.(2)待酶解处理的南瓜子浸出液保温至45℃，添加果胶酶1.2kg，木瓜蛋白酶0.8kg，酶解4h，得到酶解后的南瓜子蛋白浸出液，冷却至室温。酶解液1000分子量的有机膜，进膜压力1.5mpa，过膜液直接进预处理好的阳离子交换树脂，进完后用2倍柱体积的纯化水洗涤，再用1.2％的氢氧化铵6倍量洗脱，得到纯化后的南瓜子氨酸水溶液，碱洗液用球形浓缩器浓缩至稠膏，加80kg纯化水再次浓缩，直至无氨味，之后放出浸膏，加入35kg纯化水，再入10倍量95％乙醇，放置过滤，滤液加入过氯酸至ph＝5.3，放置冷库6h析晶，粗结晶用50％乙醇反复结晶两次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
85.(3)南瓜子氨酸过氯酸盐加8倍纯化水溶解，通过已处理好的阴离子交换树脂，流速为0.8bv柱体积每小时，之后水洗1.5bv柱体积，合并脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸溶液，真空减压浓缩，温度70℃，浓缩至浸膏28.5kg后室温放置6h，析晶，之后离心过滤。
86.(4)南瓜子氨酸粗晶，用5倍量60％乙醇加热至70℃搅拌溶解，之后过滤，浓缩至17kg，加入20g南瓜子氨酸晶种，放置室温24h，析晶，过滤，得到7.6kg南瓜子氨酸产品，产品南瓜子氨酸经hplc检测含量为93.2％。
87.实施例3
88.本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
89.(1)称取临界生产的南瓜子蛋白500kg，蛋白含量为63.24％，南瓜子氨酸含量2.80％(hplc)，不锈钢反应釜中加入纯化水3500l，升温至50℃，之后开启搅拌，投入南瓜子蛋白，边加边搅拌，投完料后升温至50℃，持续搅拌3h,待待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1h,之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，之后南瓜子蛋白灭菌，喷雾干燥，所得产品为426kg，蛋白含量为73.4％，所得南瓜子蛋白浸出液2520l，之后将南瓜子蛋白浸出液浓缩至1600l左右，待酶解处理。
90.(2)待酶解处理的南瓜子浸出液保温至48℃，添加纤维素酶0.8kg，淀粉酶2kg，酶解3.5h，得到酶解后的南瓜子蛋白浸出液，冷却至室温。酶解液500分子量的有机膜，进膜压力1.6mpa，过膜液直接进预处理好的阳离子交换树脂，进完后用2.5倍柱体积的纯化水洗涤，再用1％的氨水8倍量洗脱，得到纯化后的南瓜子氨酸水溶液，碱洗液用球形浓缩器浓缩至稠膏，加62kg纯化水再次浓缩，直至无氨味，之后放出浸膏，加入25kg纯化水，再加入8倍量95％乙醇，放置过滤，滤液加入过氯酸至ph＝5.5，放置冷库10h析晶，粗结晶用55％乙醇反复结晶两次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
91.(3)南瓜子氨酸过氯酸盐加8倍纯化水溶解，通过已处理好的阴离子交换树脂，流速为0.8bv柱体积每小时，之后水洗2.5bv柱体积，合并脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸溶液，真空减压浓缩，温度70℃，浓缩至浸膏20kg后室温放置8h，析晶，之后离心过滤。
92.(4)南瓜子氨酸粗晶，用5倍量75％乙醇加热至60℃搅拌溶解，之后过滤，浓缩至
13.5kg加入20g南瓜子氨酸晶种，放置室温24h，析晶，过滤，得到7.9kg南瓜子氨酸产品，产品南瓜子氨酸经hplc检测含量为91.7％。
93.实施例4
94.本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
95.(1)超临界生产的南瓜子蛋白500kg，蛋白含量为63.67％，南瓜子氨酸含量2.72％(hplc)；不锈钢反应釜中加入纯化水3000l，升温至50℃，之后开启搅拌，投入南瓜子蛋白，边加边搅拌，投完料后升温至50℃，持续搅拌3h，待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1h，之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，离心后的南瓜子蛋白在用3000l纯化水50℃搅拌3h，匀浆1h，同样采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，之后南瓜子蛋白灭菌，喷雾干燥，所得产品为407kg,蛋白含量为75.8％；合并南瓜子蛋白浸出液，浓缩至2100l左右，待酶解处理。
96.(2)待酶解处理的南瓜子浸出液保温至45℃，添加果胶酶1.2kg淀粉酶1kgkg，酶解4h，得到酶解后的南瓜子蛋白浸出液，冷却至室温。酶解液500分子量的有机膜，进膜压力1.2mpa，过膜液直接进预处理好的阳离子交换树脂，进完后用2倍柱体积的纯化水洗涤，再用1％的氨水得到纯化后的南瓜子氨酸水溶液，碱洗液用球形浓缩器浓缩至稠膏，加80kg纯化水再次浓缩，直至无氨味，之后放出浸膏，加入30kg纯化水，再入8倍量95％乙醇，放置过滤，滤液加入过氯酸至ph＝5.5，放置冷库8h析晶，粗结晶用50％乙醇反复结晶两次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
97.(3)南瓜子氨酸过氯酸盐加8倍纯化水溶解，通过已处理好的阴离子交换树脂，流速为0.8bv柱体积每小时，之后水洗2bv柱体积，合并脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸溶液，真空减压浓缩，温度70℃，浓缩至浸膏29.5kg后室温放置8h，析晶，之后离心过滤。
98.(4)南瓜子氨酸粗晶，用4倍量60％乙醇加热至80℃搅拌溶解，之后过滤，浓缩至16.5kg，加入20g南瓜子氨酸晶种，放置室温24h，析晶，过滤，得到7.2kg南瓜子氨酸产品，产品南瓜子氨酸经hplc检测含量为92.4％。
99.实施例5
100.本发明实施例提供的超临界南瓜籽蛋白处理废液制备南瓜子氨酸的方法包括以下步骤：
101.(1)称取临界生产的南瓜子蛋白500kg，蛋白含量为62.78％，南瓜子氨酸含量2.64％(hplc)；不锈钢反应釜中加入纯化水4000l，升温至50℃，之后开启搅拌，投入南瓜子蛋白，边加边搅拌，投完料后升温至50℃，持续搅拌3h，待粗粉全部溶散开后开启匀浆泵，打浆1h，之后采用卧式螺旋离心机分离南瓜子蛋白和南瓜子浸出液，之后南瓜子蛋白灭菌，喷雾干燥，所得产品为421.5kg，蛋白含量为72.7％，之后将南瓜子蛋白浸出液浓缩至1750l左右，待酶解处理。
102.(2)待酶解处理的南瓜子浸出液保温至48℃，添加木瓜蛋白酶0.5kg，淀粉酶2kg，酶解4h，得到酶解后的南瓜子蛋白浸出液，冷却至室温。酶解液800分子量的有机膜，进膜压力1.1mpa，过膜液直接进预处理好的阳离子交换树脂，进完后用3倍柱体积的纯化水洗涤，再用1％的氨水6倍量洗脱，得到纯化后的南瓜子氨酸水溶液，碱洗液用球形浓缩器浓缩至稠膏，加52kg纯化水再次浓缩，直至无氨味，之后放出浸膏，加入25kg纯化水，再入8倍量
95％乙醇，放置过滤，滤液加入过氯酸至ph＝4.9，放置冷库8h析晶，粗结晶用50％乙醇反复结晶两次，得到纯品南瓜子氨酸过氯酸盐。
103.(3)南瓜子氨酸过氯酸盐加10倍纯化水溶解，通过已处理好的阴离子交换树脂，流速为1bv柱体积每小时，之后水洗1.5bv柱体积，合并脱去过氯酸根离子的南瓜子氨酸溶液，真空减压浓缩，温度70℃，浓缩至浸膏20kg后室温放置8h，析晶，之后离心过滤。
104.(4)南瓜子氨酸粗晶，用4倍量80％乙醇加热至80℃搅拌溶解，之后过滤，浓缩至14.5kg，加入20g南瓜子氨酸晶种，放置室温24h，析晶，过滤，得到7.5kg南瓜子氨酸产品，产品南瓜子氨酸经hplc检测含量为92.5％。
105.上述实施例中最终得到的南瓜子氨酸产品含量均在98％以上，南瓜子蛋白含量均在70％以上，说明通过本发明制得的南瓜子蛋白和南瓜子氨酸纯度高，且产品无化学试剂残留，能增强产品的市场竞争力。
106.下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
107.1、实例中南瓜子蛋白数据：
108.项目名称原料蛋白含量产品蛋白含量产品残油产品得率蛋白转化率实施例161.44％71.4％5.33％81.6％94.83％实施例262.47％74.3％6.27％80.4％85.62％实施例363.24％73.4％5.85％81.2％94.25％实施例463.67％74.8％5.32％81.4％95.63％实施例562.78％72.4％5.12％82.3％94.91％
109.备注：粗蛋白检测方法为gb5009.5
‑
2016中第一法：凯氏定氮法；南瓜子蛋白氮折算成蛋白质的折算系数采用6.25。
110.2、实例中南瓜子氨酸数据
111.项目名称南瓜子原料中南瓜籽氨酸含量产品中南瓜子氨酸含量水分南瓜子氨酸转化率实施例12.76％93.6％4.32％49.51％实施例22.68％93.2％3.47％52.86％实施例32.80％91.7％3.56％51.75％实施例42.72％92.4％4.14％48.92％实施例52.64％92.5％2.56％52.56％
112.3、南瓜子氨酸分子式及液相图谱：
113.3.1南瓜子氨酸检测方法：
114.色谱柱：sinochrom ods
‑
bp柱(250mm*4.6mm,5um)c18柱；检测波长215nm
115.3.2南瓜子氨酸分子式：c5h10n2o2
116.3.3南瓜子氨酸结构式：
117.3.4南瓜子氨酸图谱，如图3和图4所示。
118.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何
熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。