一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法与流程

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法。
背景技术：
：随着哺乳动物细胞体外培养技术的日益成熟及其表达产物的生物学特性更接近人体的天然产物，哺乳动物细胞越来越受到科研工作者的重视，并常被用于病理学机制研究、药物筛选和生物制品生产等方面，据统计，大约70％的治疗性重组蛋白药物是由哺乳动物细胞生产。然而，哺乳动物有着相似的营养成分需求和培养环境条件，其在培养传代过程中，很容易发生细胞间交叉污染。德国dsmz保藏中心的研究学者鉴定的252株细胞系中，至少18％的细胞系发生交叉污染。国际癌症杂志2010年公布的360种细胞系中，大多数发生种内交叉污染，9％的细胞系发生种间交叉污染。细胞间交叉污染不但会影响实验结果的准确性和重复性，导致药物筛选失败，同时也是生物制品生产的潜在威胁。目前，str图谱分析法是细胞鉴别及交叉污染检测较为常用的方法，但该法适用于人源及鼠源少数物种细胞的种内细胞鉴别和交叉污染的检测。除此之外，染色体核型分析和同工酶技术也能够用于细胞鉴别及交叉污染检测，然而，此类检测方法具有细胞用量大、操作复杂、耗时及成本高等缺点，且检测效率极低。为提高检测效率，目前急需一种灵敏、快速、稳定的用于多细胞鉴别和种属间交叉污染检测的方法。线粒体基因是独立于基因组的遗传分子单元，其具有母系遗传、基因序列相对保守及突变率低等特点，常被分子遗传学家用于物种分类，种群遗传学及进化生物学等方面的分析。本专利基于十一个物种细胞线粒体上两个相对保守的基因细胞色素b(cytochromeb,cytb)和细胞色素c氧化酶i(cytochromecoxidasesubuniti，coi)基因序列差异设计出了多条扩增不同片段长度的引物，经过引物特异性筛选、引物组合检验和灵敏度检验，最终确定一套特异性强，灵敏度高的混合引物，并建立了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的多重pcr检测方法。技术实现要素：本发明的目的是克服现有检测技术中细胞用量大、操作复杂、检测效率低、成本高等问题。为此，本发明提供了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物，其包括以下引物对：(1)对牛mdbk细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅰ：正向引物：5’-agccctagtagcagacctattg-3’反向引物：5’-tttgttttcgattgtgccggcc-3’；(2)对小鼠balb/c-3t3细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅱ：正向引物：5’-acatacgaaaaacacacccat-3’反向引物：5’-tactgatgaaaaggctgttatt-3’；(3)对狗mdck细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅲ：正向引物：5’-atccttactaggagtatgcttg-3’反向引物：5’-caggtgaaaataaaactagtga-3’；(4)对大鼠walker-256细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅳ：正向引物：5’-atcaatcctaatcttagccttc-3’反向引物：5’-gctactaggattcagtaaagga-3’；(5)对叙利亚仓鼠bhk-21细胞的cytb基因进行扩增的引物对ⅴ：正向引物：5’-agttatagctacagcattcgta-3’反向引物：5’-gttatgagggcaatcaatagtag-3’；(6)对非洲绿猴vero细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅵ：正向引物：5’-tgaatctgaggtgggtactccattgg-3’反向引物：5’-ggttgtaattaggaatcagaacagg-3’；(7)对中国仓鼠ch0-k1细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅶ：正向引物：5’-ttgggaattgattagtgcctt-3’反向引物：5’-tggtgtttggtattgtgtaaca-3’；(8)对猫pg-4细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅷ：正向引物：5’-tctcaggatatacccttgacaac-3’反向引物：5’-gatgcgaaagcttctcacact-3’；(9)对人hela细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅸ：正向引物：5’-acgggatcaaacaacccccta-3’反向引物：5’-tccgattcaggttagaatgagg-3’；(10)对猪pk-15细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅹ：正向引物：5’-accgtaggaatagacgtagatacc-3’反向引物：5’-atgctgtgtatgcgtcaggataa-3’；(11)对恒河猴frhk-4细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅺ：正向引物：5’-cccttacctgaattggaagcg-3’反向引物：5’-ttgttttcgattagggaggcc-3’。具体的，上述混合引物中所述引物对ⅰ、所述引物对ⅱ、所述引物对ⅲ、所述引物对ⅳ、所述引物对ⅴ、所述引物对ⅵ、所述引物对ⅶ、所述引物对ⅷ、所述引物对ⅸ、所述引物对ⅹ和所述引物对ⅸ等比例混合。本发明还提供了一种多细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，包括以下步骤：(1)制备待测细胞样品；(2)提取待测细胞的基因组dna；(3)以待测细胞的基因组dna为模板，利用上述用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物进行pcr扩增；(4)pcr反应结束后，对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增产物的dna片段大小来判定样品的来源细胞。具体的，上述步骤(3)中pcr扩增的反应体系为：10xpcr缓冲液2.5μl，dna聚合酶0.5μl，dna模板1μl，dntpmix0.5μl，混合引物13μl，去离子水7.5μl。具体的，上述步骤(3)中pcr扩增的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃完全延伸5min；16℃保存。具体的，上述步骤(4)中的判定依据为：牛mdbk细胞的引物对扩增出的dna片段大小为148bp；小鼠balb/c-3t3细胞的引物对扩增出的dna片段大小为191bp；狗mdck细胞的引物对扩增出的dna片段大小为641bp；大鼠walker-256细胞的引物对扩增出的dna片段大小为102bp；叙利亚仓鼠bhk-21细胞的引物对扩增出的dna片段大小为357bp；非洲绿猴vero细胞的引物对扩增出的dna片段大小为507bp；中国仓鼠ch0-k1细胞的引物对扩增出的dna片段大小为314bp；猫pg-4细胞的引物对扩增出的dna片段大小为235bp；人hela细胞的引物对扩增出的dna片段大小为411bp；猪pk-15细胞的引物对扩增出的dna片段大小为469bp；恒河猴frhk-4细胞的引物对扩增出的dna片段大小为124bp；将琼脂糖凝胶电泳检测结果中dna片段与上述片段进行对照，确定与之对应的细胞。具体的，上述步骤(1)的具体步骤为：若待测细胞为悬浮细胞时，将细胞转入15ml离心管中，450g离心5min弃培养液，加入pbs重悬后转入1.5ml离心管中，450g离心5min弃上清，收集细胞；若待测细胞为贴壁细胞，向其中加入1ml胰酶，消化至细胞脱落后，加入2ml10％fbsdmem培养基，混匀后按照悬浮细胞处理。具体的，上述步骤(2)的具体步骤为：将待测细胞收集至1.5ml的ep管中，加入500μl的nuclearlysissolution(promega)，65℃水浴30min，加入10μl20mg/ml的蛋白酶k和5μl的rnasesolution，55℃水浴至溶液变清澈，取出后冷却至室温，加入200μlproteinprecisionsolution(promega)，迅速颠倒混匀，冰上放置10min，14000rpm离心4分钟，将上清液转移至新的ep管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒至产生白色沉淀，14000rpm离心1min，弃上清液，加入600μl80％的乙醇，轻轻上下颠倒清洗dna，重复清洗一次后，室温放置5min使乙醇挥发，加入50μl灭菌水或者te缓冲液，4℃过夜。本发明还提供了一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的试剂盒，包括上述用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物。可将本发明所述混合引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用，其中所述相关试剂可以为本发明多细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法中pcr反应体系里除dna模板外的试剂，也可以为其他适用于pcr反应的常规试剂，此外，本发明的试剂盒中还包括实施本发明所需的基本用具。本发明提供的试剂盒可用于对多物种的细胞混合样品进行种属鉴别和交叉污染检测，也可以用于对单物种的细胞进行种属鉴定和交叉污染检测。与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：(1)本发明提供的方法只需对细胞dna进行提取便可以进行检测，具有操作简单、用时短、效率高和价格便宜等优势。(2)本发明提供的混合引物能够在一个pcr反应体系中实现同时对多种片段的扩增，样品用量较传统pcr技术而言较少，且能够同时对多种细胞进行种属鉴别和种属间交叉污染检测。(3)本发明提供的方法除了对目前常见的哺乳类细胞进行种属鉴别和种属间交叉污染检测外，同时加入了生物制品及科研类常用的叙利亚仓鼠bhk-21细胞的引物，实现了更多细胞种类的检测。(4)本发明提供的混合引物是基于cytb和coi基因标准序列的差异而设计的，大大减小了引物之间的交叉配对和干扰概率，提高了检测的特异性和灵敏度。以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。附图说明图1是本发明的用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物的特异性验证结果；m:dnamarkerdl2000；1-11分别为mdck、vero、pk-15、hela、bhk-21、cho-k1、pg-4、balb/c-3t3、mdbk、frhk-4和walker-256细胞引物。图2是本发明的用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物之间的交叉配对和干扰排除实验结果；m:dnamarkerdl2000；1-11分别为mdck、vero、pk-15、hela、bhk-21、cho-k1、pg-4、balb/c-3t3、mdbk、frhk-4和walker-256细胞基因组dna模板。图3是本发明的用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测方法的灵敏度及特异性检测结果；m:dnamarkerdl2000；1：mdck、vero、pk-15、hela、bhk-21、cho-k1、pg-4、balb/c-3t3、mdbk、frhk-4和walker-256细胞基因组dna混合模板；2和3分别是1中混合模板的2倍和4倍稀释液。具体实施方式下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属
技术领域：
的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。除非特别说明，本发明所使用的试剂和设备都可通过常规市场购买，所使用的试剂均按照《分子克隆实验指南》配制。本发明实施例中使用的引物由生工生物工程股份有限公司合成，并经page纯化方式进行纯化，所使用的dna聚合酶是champagnetaqdnapolymerase(p122-d2，诺唯赞生物技术有限公司)。一、设计用于多细胞鉴别及和种属间交叉污染检测的混合引物利用美国国立生物技术信息中心(ncbi)的核酸序列数据库对mdbk、balb/c-3t3、mdck、walker-256、bhk-21、vero、ch0-k1、pg-4、hela、pk-15、frhk-4细胞的序列进行筛选分析；选取各种细胞cytb和coi基因中高度保守且具有特异性的序列(保守区)，将特异性序列进行比对搜索，以确定该序列在所有物种中的特异性，避免序列出现重复现象；为了减小引物之间的交叉配对和干扰概率，提高检测的特异性和灵敏度，本发明选择同时针对cytb基因和coi基因设计引物；用引物设计软件primer进行分析设计，并微调引物序列，以确定引物之间没有过多的配对，没有二聚体，并保证所有引物的tm值大致相同，设计出多条针对各细胞cytb或coi基因的特异性扩增引物；使用设计的引物对含有十一种细胞基因组dna混合模板的扩增，确定引物的特异性，即只扩增对应细胞的基因组dna而不对其他的基因组dna进行扩增，之后针对每种细胞选出一对特异性扩增效果好的引物，等比例混合后对十一种细胞单一的基因组dna模板进行扩增，以排除引物之间的交叉配对和干扰。各引物序列如下所述：(1)对牛mdbk细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅰ：正向引物：5’-agccctagtagcagacctattg-3’反向引物：5’-tttgttttcgattgtgccggcc-3’；(2)对小鼠balb/c-3t3细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅱ：正向引物：5’-acatacgaaaaacacacccat-3’反向引物：5’-tactgatgaaaaggctgttatt-3’；(3)对狗mdck细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅲ：正向引物：5’-atccttactaggagtatgcttg-3’反向引物：5’-caggtgaaaataaaactagtga-3’；(4)对大鼠walker-256细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅳ：正向引物：5’-atcaatcctaatcttagccttc-3’反向引物：5’-gctactaggattcagtaaagga-3’；(5)对叙利亚仓鼠bhk-21细胞的cytb基因进行扩增的引物对ⅴ：正向引物：5’-agttatagctacagcattcgta-3’反向引物：5’-gttatgagggcaatcaatagtag-3’；(6)对非洲绿猴vero细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅵ：正向引物：5’-tgaatctgaggtgggtactccattgg-3’反向引物：5’-ggttgtaattaggaatcagaacagg-3’；(7)对中国仓鼠ch0-k1细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅶ：正向引物：5’-ttgggaattgattagtgcctt-3’反向引物：5’-tggtgtttggtattgtgtaaca-3’；(8)对猫pg-4细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅷ：正向引物：5’-tctcaggatatacccttgacaac-3’反向引物：5’-gatgcgaaagcttctcacact-3’；(9)对人hela细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅸ：正向引物：5’-acgggatcaaacaacccccta-3’反向引物：5’-tccgattcaggttagaatgagg-3’；(10)对猪pk-15细胞的coi基因进行特异性扩增的引物对ⅹ：正向引物：5’-accgtaggaatagacgtagatacc-3’反向引物：5’-atgctgtgtatgcgtcaggataa-3’；(11)对恒河猴frhk-4细胞的cytb基因进行特异性扩增的引物对ⅺ：正向引物：5’-cccttacctgaattggaagcg-3’反向引物：5’-ttgttttcgattagggaggcc-3’使用各引物分别对相应来源细胞的基因组dna进行pcr扩增，扩增出的dna片段大小如表1所示。表1各引物对信息二、多细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法1、制备待测细胞样品：若待测细胞为悬浮细胞时，将细胞转入15ml离心管中，450g离心5min弃培养液，加入pbs重悬后转入1.5ml离心管中，450g离心5min弃上清，收集细胞；若待测细胞为贴壁细胞，向其中加入1ml胰酶，消化至细胞脱落后，加入2ml10％fbsdmem培养基，混匀细胞后转入15ml离心管中，450g离心5min弃培养液，加入pbs重悬后转入1.5ml离心管中，450g离心5min弃上清，收集细胞。2、提取待测细胞的基因组dna：将待测细胞收集至1.5ml的ep管中，加入500μl的nuclearlysissolution(promega)，65℃水浴30min，加入10μl20mg/ml的蛋白酶k和5μl的rnasesolution，55℃水浴至溶液变清澈，取出后冷却至室温，加入200μl的proteinprecisionsolution(promega),，迅速颠倒混匀，冰上放置10min，14000rpm离心4分钟，将上清转移至新的ep管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒至产生白色沉淀，14000rpm离心1min，弃上清，加入600μl80％的乙醇，轻轻上下颠倒清洗dna，重复清洗一次后，室温放置5min使乙醇挥发，加入50μl灭菌水或者te缓冲液，4℃过夜，充分溶解dna。3、以待测细胞的基因组dna为模板，利用上述用于多细胞鉴别及和种属间交叉污染检测的混合引物进行pcr扩增；pcr扩增的反应体系为：10xpcr缓冲液2.5μl，dna聚合酶0.5μl，dna模板1μl，dntpmix0.5μl，混合引物13μl，去离子水7.5μl；pcr扩增的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃完全延伸5min；16℃保存。4、pcr反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物的dna片段大小与表1中各扩增片段大小进行对照，来判定样品所属的细胞种属。下面通过具体实施例对本发明的效果进行研究。实施例1：为了确定所设计的引物只对其对应细胞的基因组dna进行扩增，而不对其他细胞的基因组dna进行扩增，本实施例进行了特异性验证。(1)制备mdbk、balb/c-3t3、mdck、walker-256、bhk-21、vero、ch0-k1、pg-4、hela、pk-15和frhk-4细胞的单一细胞样品；(2)提取各个单一细胞的基因组dna，将其混合以制备混合基因组dna，其中每个单一细胞的基因组dna均为1ng/μl；(3)以混合基因组dna为模板，使用单一引物对ⅰ-ⅺ分别对十一种细胞混合基因组dna进行pcr扩增；具体的pcr反应体系如表2所示；pcr扩增的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃完全延伸5min；16℃保存；表2pcr反应体系10xchampagnetaqtmbuffe2.5μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μldntpmix0.5μlchampagnetaqtmdnapolymerase0.5μl混合基因组dna1μl去离子水19.5μl总量25μl(4)pcr反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，marker为dnamarkerdl2000，结果如图1所示，各个单一引物的扩增产物中均只有单一条带；将图1与表1中扩增片段大小对照，所设计的引物只对其对应细胞的基因组dna进行扩增，而不对其他细胞的基因组dna进行扩增，由此可见本发明设计的引物具有良好的特异性。实施例2：为了验证所设计的引物中引物之间不会存在交叉配对和干扰，且能够正常的进行检测，本实施例进行了引物之间的交叉配对和干扰排除实验，本轮使用的引物经page纯化方式纯化后稀释成10μm。(1)制备mdbk、balb/c-3t3、mdck、walker-256、bhk-21、vero、ch0-k1、pg-4、hela、pk-15和frhk-4细胞的单一细胞样品；(2)提取各个单一细胞的基因组dna，各基因组dna的浓度均为50ng/μl；(3)经page纯化后的引物稀释成10μm，以单一细胞基因组dna为模板，将引物对ⅰ-引物对ⅺ等比例混合后分别对十一种单一细胞基因组dna模板进行扩增；具体的pcr反应体系如表3所示；pcr扩增的反应程序与实施例1相同；表3pcr反应体系10xchampagnetaqtmbuffe2.5μl混合引物(10μm)13μldntpmix0.5μlchampagnetaqtmdnapolymerase0.5μl基因组dna1μl去离子水7.5μl总量25μl(4)pcr反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，marker为dnamarkerdl2000，结果如图2所示，各个单一细胞样品的扩增产物中均只有单一条带；将图2与表1中扩增片段大小对照，所设计的引物只对其对应细胞的基因组dna进行扩增，各引物之间不存在交叉配对和干扰，能够正常的进行检测。实施例3：为了证明本发明的灵敏度及特异性，本实施例对不同浓度的混合基因组dna模板进行了实验。(1)制备mdbk、balb/c-3t3、mdck、walker-256、bhk-21、vero、ch0-k1、pg-4、hela、pk-15和frhk-4细胞的单一细胞样品；(2)提取各个单一细胞的基因组dna，将其混合以制备混合基因组dna，其中mdbk细胞基因组dna浓度为1ng/μl、balb/c-3t3细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、mdck细胞基因组dna浓度为1ng/μl、walker-256细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、bhk-21细胞基因组dna浓度为1ng/μl、vero细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、ch0-k1细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、pg-4细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、hela细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl、pk-15细胞基因组dna浓度为0.25ng/μl、frhk-4细胞基因组dna浓度为0.5ng/μl；(3)以混合基因组dna为模板，将引物对ⅰ-引物对ⅺ等比例混合后对其进行扩增；本实施例中使用的pcr反应体系和pcr反应条件与实施例2中相同；(4)将混合基因组dna分别稀释2倍和4倍后，重复上述步骤(3)；(5)对步骤(3)和步骤(4)中的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，marker为dnamarkerdl2000，结果如图3所示，不同浓度的混合基因组dna的扩增产物中均可看见十一条目的条带；将图3与表1中扩增片段大小对照，各引物均对其对应细胞的基因组dna进行了扩增。当使用本发明提供的混合引物对含有十一种细胞基因组dna进行扩增时，能够灵敏检测出0.25ng的mdck和vero细胞基因组dna，0.0625ng的pk-15细胞基因组dna，0.125ng的hela、bhk-21、cho-k1、pg-4、balb/c-3t3、mdbk、frhk-4和walker-256细胞基因组dna。综上所述，本发明基于cytb和coi基因标准序列的差异而设计的混合引物大大减小了引物之间的交叉配对和干扰概率，提高了检测的特异性和灵敏度，只需对细胞dna进行提取便可以同时对多种细胞进行种属鉴别和种属间交叉污染检测，具有操作简单、用时短、效率高和价格便宜等优势。以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。当前第1页12