一种基于水稻褐飞虱抗性基因Bph26的PARMS标记与应用

一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用
【技术领域】
1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，具体涉及一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用。


背景技术：

2.褐飞虱属同翅目飞虱科，以水稻为主要的寄主，褐飞虱是危害水稻生产的主要害虫之一。褐飞虱通过口针吸食水稻维管束鞘汁液，严重时造成稻株基部变黑、倒伏甚至枯死，褐飞虱在取食时传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病，同时也促使水稻纹枯病、小球菌核病的传播。随着耕作方式的改变和高产品种的大面积推广，褐飞虱危害逐年加重，已经成为水稻生产的首要虫害。
3.目前，防治褐飞虱的方法主要有：农业防治，生物防治和化学防治，其中培育抗(耐)虫水稻品种是最有效、最经济的策略。分子育种实践表明，分析水稻重要农艺性状基因的基因结构变异，开发目标基因功能标记，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度提高育种效率，缩短育种时间。现已有相关的研究，例如中国专利申请cn201911291214水稻抗褐飞虱基因bph37、蛋白、载体、宿主细胞、分子标记、方法及应用，公开了水稻抗褐飞虱基因bph37的核苷酸序列，利用分子标记156
‑
35可筛选含有水稻抗褐飞虱基因bph37的水稻，通过遗传转化，将bph37基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。又例如中国专利申请cn201510172218水稻抗褐飞虱基因bph6及其紧密连锁的分子标记，所述水稻抗褐飞虱基因bph6的核苷酸序列中，bph6基因定位于分子标记h和y37之间，并与二者紧密连锁，利用分子标记h和y37可筛选含有抗褐飞虱基因bph6的水稻，通过遗传转化和杂交，将bph6基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。
4.目前常用的分子标记rflp，rapd，caps，aflp，ssr，issr，sts，srap和irap可用于目标基因的连锁分析、检测，但是这些标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点，不适用于大规模的基因型分析。
5.单核苷酸多态性snp，是指在基因组水平上引起的单个碱基的变异，其在群体中的发生频率不小于1％。snp可以发生在基因组的任何位置，作为新一代分子标记，具有数量多、分布均匀、多态性丰富、精度高等优点。parms技术，即五引物扩增受阻突变体系，是最新开发出的基于荧光检测的snp基因分型方法，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对snp或短indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型，具有操作简便、耗时短、成本低的优势。基于parms技术开发的荧光分子标记，检测样品只通过一次pcr扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，快速获得相应基因型结果。
6.研究建立一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用具有很好的市场前景。


技术实现要素：

7.针对现有技术中防治褐飞虱的标记检测耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质、不适用于大规模的基因型分析的缺点，本发明提供了一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，具体是基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，本发明利用一代测序检测bph26在高抗褐飞虱材料y224和易感褐飞虱品种日本晴中差异，发现在该基因富亮氨酸重复(lrr)结构域内发生c
→
t，c
→
t和t
→
a三个位点的突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸，引起bph26的无功能，在设计的正向引物中引入这两个碱基的差异，并在此基础上增加两条不同荧光标记通用引物，开发基于parms技术的水稻褐飞虱抗性基因bph26的荧光功能分子标记，便于bph26基因在水稻抗性分子育种上应用。
8.本发明所述的一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，是一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，包括如下步骤：
9.1)水稻材料褐飞虱抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定多份水稻材料的褐飞虱抗性，筛选出抗褐飞虱材料y224；
10.2)bph26基因结构分析：提取y224和日本晴新鲜叶片的dna，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件vector nti 11分析bph26基因在两个水稻材料中的差异，发现在loc_os12g37280cds区域888bp，943bp和947bp位点发生c
→
t，c
→
t和t
→
a突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸，引起bph26的无功能；
11.3)bph26基因功能标记的设计与合成：根据bph26第1外显子488bp位点t
→
c突变，设计了1个parms分子标记parms
‑
bph26，该标记由3条bph26基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：
12.正向引物bph26
‑
ra：tggggagtggaggccatgaaggtgaccaagttcatgct；
13.正向引物bph26
‑
rg：tggggagtggaggccaagaaggtcggagtcaacggatt；
14.反向引物bph26
‑
f：cacacgcaacaacctcatctt；
15.另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
16.#1：gaaggtgaccaagttcatgct；
17.#2：gaaggtcggagtcaacggatt；
18.4)parms
‑
bph26的使用：标记的3条根据bph26基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到pcr反应体系进行扩增，bph26等位基因序列根据snp差异与正向引物bph26
‑
fg匹配而扩增获得fam荧光信号值，与正向引物bph26
‑
fa匹配而扩增获得hex荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；
19.5)bph26基因的pcr扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料的褐飞虱抗性后，利用parms
‑
bph26对褐飞虱基因bph26分型，将所设计的3条引物bph26
‑
fg、bph26
‑
fa和bph26
‑
r及#1、#2两条通用引物同时加入到pcr反应体系中，上述pcr反应体系为10μl：5μl 2
×
parms master mix，0.15μl10 mm bph26
‑
fg标记引物，0.15μl10 mm bph26
‑
fa标记引物，0.4μl10 mm bph26
‑
r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μl ddh2o；
20.pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取
荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的fam和hex荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；
21.根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得fam荧光信号(蓝色)的是易感褐飞虱bph26等位基因(t)类型材料，获得hex荧光信号(绿色)的是抗褐飞虱bph26(c)类型材料，灰色为阴性对照；
22.6)parms
‑
bph26有效性评估：对聚合多个抗性基因的水稻材料进行分析，确定表型、基因型。
23.本发明中：
24.步骤1)所述的多份，是200
‑
300份。
25.步骤2)所述的提取y224和日本晴新鲜叶片的dna，是采用ctab法提取y224和日本晴新鲜叶片的dna。
26.步骤5)所述的鉴定聚合多个抗性基因的多份水稻材料，是鉴定聚合多个抗性基因的40
‑
65份水稻材料。
27.步骤5)所述的pcr反应体系中的pcr反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(
‑
0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，20s，57℃，1min。
28.步骤6)所述的表型为抗褐飞虱、感褐飞虱；所述的基因型鉴定结果为tt型、cc型。
29.和现有技术相比，本发明具有如下优点：
30.1、本发明所述的一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，只需一次pcr扩增，操作过程简易，便于掌握，不需要凝胶电泳分离dna片段，避免接触有毒化学物质。
31.2、本发明所述的一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错，而且parms
‑
bph26检测结果准备可靠。
【附图说明】
32.图1是本发明实施例1中bph26基因在y224和日本晴两个水稻材料中的序列差异的图，显示在loc_os12g37280cds区域888bp，943bp和947bp位点发生c
→
t，c
→
t和t
→
a突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸，引起bph26的无功能。
33.图2是本发明实施例1中bph26基因在y224和日本晴两个水稻材料中的荧光图。
【具体实施方式】
34.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
35.实施例1：
36.一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，是一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，包括如下步骤：
37.1)水稻材料褐飞虱抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定226份水稻材料的褐飞虱抗性，筛选出抗褐飞虱材料y224；
38.2)bph26基因结构分析：采用ctab法提取y224和日本晴新鲜叶片的dna，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件vector nti 11分析bph26基因在两个水稻材料中的差异，发现在loc_os12g37280cds区域888bp，943bp和947bp位点发生c
→
t，c
→
t和t
→
a突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸(参见附图1)，引起bph26的无功能
39.3)bph26基因功能标记的设计与合成：根据bph26第1外显子488位点t
→
c突变，设计了1个parms分子标记parms
‑
bph26，该标记由3条bph26基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：
40.正向引物bph26
‑
ra：tggggagtggaggccatgaaggtgaccaagttcatgct；
41.正向引物bph26
‑
rg：tggggagtggaggccaagaaggtcggagtcaacggatt；
42.反向引物bph26
‑
f：cacacgcaacaacctcatctt；
43.另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
44.#1：gaaggtgaccaagttcatgct；
45.#2：gaaggtcggagtcaacggatt；
46.4)parms
‑
bph26的使用：标记的3条根据bph26基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到pcr反应体系进行扩增，bph26等位基因序列根据snp差异与正向引物bph26
‑
fg匹配而扩增获得fam荧光信号值，与正向引物bph26
‑
fa匹配而扩增获得hex荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；
47.5)bph26基因的pcr扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的44份水稻材料的褐飞虱抗性后，利用parms
‑
bph26对褐飞虱基因bph26分型，将所设计的3条引物bph26
‑
fg、bph26
‑
fa和bph26
‑
r及#1、#2两条通用引物同时加入到pcr反应体系中，上述pcr反应体系为10μl：5μl 2
×
parms master mix，0.15μl10 mm bph26
‑
fg标记引物，0.15μl10 mm bph26
‑
fa标记引物，0.4μl10 mm bph26
‑
r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μl ddh2o；pcr反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(
‑
0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，20s，57℃，1min
48.pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的fam和hex荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；
49.根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得fam荧光信号(蓝色)的是易感褐飞虱bph26等位基因(t)类型材料，获得hex荧光信号(绿色)的是抗褐飞虱bph26(c)类型材料，灰色为阴性对照；
50.6)parms
‑
bph26有效性评估：在63份材料中，有57份表型为抗褐飞虱，基因型鉴定结果为tt型；6份材料为感褐飞虱，基因型cc型(参见图2)，该标记的有效性为98.4％，可用于水稻抗褐飞虱分子育种。
51.计算各品系褐飞虱平均抗性级别，公式如下：
52.平均抗级＝∑(各抗级株数
×
对应抗性级别)/总株数。
53.平均抗性级别分为：
54.1.0
‑
1.9为高抗(hr)，
55.2.0
‑
3.9为抗(r)，
56.4.0
‑
5.9为中抗(mr)，
57.6.0
‑
7.9为中感(ms)，
58.8.0
‑
9.0为高感(hs)。
59.实施例2：
60.一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，是一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，包括如下步骤：
61.1)水稻材料褐飞虱抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定200份水稻材料的褐飞虱抗性，筛选出抗褐飞虱材料y224；
62.2)bph26基因结构分析：采用ctab法提取y224和日本晴新鲜叶片的dna，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件vector nti 11分析bph26基因在两个水稻材料中的差异，发现在loc_os12g37280cds区域888bp，943bp和947bp位点发生c
→
t，c
→
t和t
→
a突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸，引起bph26的无功能
63.3)bph26基因功能标记的设计与合成：根据bph26第1外显子488位点t
→
c突变，设计了1个parms分子标记parms
‑
bph26，该标记由3条bph26基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：
64.正向引物bph26
‑
ra：tggggagtggaggccatgaaggtgaccaagttcatgct；
65.正向引物bph26
‑
rg：tggggagtggaggccaagaaggtcggagtcaacggatt；
66.反向引物bph26
‑
f：cacacgcaacaacctcatctt；
67.另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
68.#1：gaaggtgaccaagttcatgct；
69.#2：gaaggtcggagtcaacggatt；
70.4)parms
‑
bph26的使用：标记的3条根据bph26基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到pcr反应体系进行扩增，bph26等位基因序列根据snp差异与正向引物bph26
‑
fg匹配而扩增获得fam荧光信号值，与正向引物bph26
‑
fa匹配而扩增获得hex荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；
71.5)bph26基因的pcr扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的63份水稻材料的褐飞虱抗性后，利用parms
‑
bph26对褐飞虱基因bph26分型，将所设计的3条引物bph26
‑
fg、bph26
‑
fa和bph26
‑
r及#1、#2两条通用引物同时加入到pcr反应体系中，上述pcr反应体系为10μl：5μl 2
×
parms master mix，0.15μl10 mm bph26
‑
fg标记引物，0.15μl10 mm bph26
‑
fa标记引物，0.4μl10 mm bph26
‑
r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μl ddh2o；pcr反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(
‑
0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，20s，57℃，1min
72.pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取
荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的fam和hex荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；
73.根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得fam荧光信号(蓝色)的是易感褐飞虱bph26等位基因(t)类型材料，获得hex荧光信号(绿色)的是抗褐飞虱bph26(c)类型材料，灰色为阴性对照；
74.6)parms
‑
bph26有效性评估：在63份材料中，有57份表型为抗褐飞虱，基因型鉴定结果为tt型；6份材料为感褐飞虱，基因型cc型，该标记的有效性为98.4％，可用于水稻抗褐飞虱分子育种。
75.实施例3：
76.一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，是一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，包括如下步骤：
77.1)水稻材料褐飞虱抗性鉴定：以日本晴为对照，在苗期人工接种鉴定300份水稻材料的褐飞虱抗性，筛选出抗褐飞虱材料y224；
78.2)bph26基因结构分析：采用ctab法提取y224和日本晴新鲜叶片的dna，分段扩增，纯化后送生物公司测序，利用软件vector nti 11分析bph26基因在两个水稻材料中的差异，发现在loc_os12g37280cds区域888bp，943bp和947bp位点发生c
→
t，c
→
t和t
→
a突变，导致由异亮氨酸变成苯丙氨酸，谷氨酸变为赖氨酸，甘氨酸变为天冬氨酸，引起bph26的无功能
79.3)bph26基因功能标记的设计与合成：根据bph26第1外显子488位点t
→
c突变，设计了1个parms分子标记parms
‑
bph26，该标记由3条bph26基因的特异引物构成，在设计的正向引物中引入两个碱基的差异：
80.正向引物bph26
‑
ra：tggggagtggaggccatgaaggtgaccaagttcatgct；
81.正向引物bph26
‑
rg：tggggagtggaggccaagaaggtcggagtcaacggatt；
82.反向引物bph26
‑
f：cacacgcaacaacctcatctt；
83.另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
84.#1：gaaggtgaccaagttcatgct；
85.#2：gaaggtcggagtcaacggatt；
86.4)parms
‑
bph26的使用：标记的3条根据bph26基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到pcr反应体系进行扩增，bph26等位基因序列根据snp差异与正向引物bph26
‑
fg匹配而扩增获得fam荧光信号值，与正向引物bph26
‑
fa匹配而扩增获得hex荧光信号值，如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增；
87.5)bph26基因的pcr扩增与基因分型：鉴定聚合多个抗性基因的63份水稻材料的褐飞虱抗性后，利用parms
‑
bph26对褐飞虱基因bph26分型，将所设计的3条引物bph26
‑
fg、bph26
‑
fa和bph26
‑
r及#1、#2两条通用引物同时加入到pcr反应体系中，上述pcr反应体系为10μl：5μl 2
×
parms master mix，0.15μl10 mm bph26
‑
fg标记引物，0.15μl10 mm bph26
‑
fa标记引物，0.4μl10 mm bph26
‑
r通用反向引物，1μl模板dna，3.3μl ddh2o；pcr反应程序是：95℃，5min；然后10个循环95℃，20s，65℃(
‑
0.8℃/循环)，1min；然后32个循环95℃，
20s，57℃，1min
88.pcr产物在包含fam、hex和rox三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析，获得每个样品扩增的fam和hex荧光信号强度，并对每个信号点用图形方式输出，最后根据荧光信号强度，自动进行基因分型，获得基因型结果；
89.根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得fam荧光信号(蓝色)的是易感褐飞虱bph26等位基因(t)类型材料，获得hex荧光信号(绿色)的是抗褐飞虱bph26(c)类型材料，灰色为阴性对照；
90.6)parms
‑
bph26有效性评估：在63份材料中，有57份表型为抗褐飞虱，基因型鉴定结果为tt型；6份材料为感褐飞虱，基因型cc型，该标记的有效性为98.4％，可用于水稻抗褐飞虱分子育种。
91.总结：
92.1、现有技术中，常规的dna标记检测方法主要有聚丙烯酰胺电泳和琼脂糖凝胶电泳，这些检测方法具有耗时长、操作繁琐、效率低、自动化程度低并且使用有毒物质等缺点；毛细管电泳存在由于进样量少，因而制备能力差；由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法(如紫外吸收光谱法)时，灵敏度较低；电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性等局限性。通过实施例1
‑
3，说明本发明一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，通过一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26 lrr保守结构域snp突变的功能性parms标记与应用，只需一次pcr扩增，操作过程简易，便于掌握，不需要凝胶电泳分离dna片段，避免接触有毒化学物质。
93.2、本发明所述的一种基于水稻褐飞虱抗性基因bph26的parms标记与应用，多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错，而且parms
‑
bph26检测结果准备可靠。
94.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。