一类抑制草地贪夜蛾取食的白细胞激肽及其类似物

一、
技术领域：
本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一类具有抑制昆虫取食效果的激肽及其类似物。二、技术背景昆虫神经肽是昆虫脑内神经细胞周期性合成、分泌并传递的一类小分子活性多肽，通常由2～10个氨基酸构成，是一类重要的化学信使。1917年，kopec通过对舞毒蛾进行的实验，提出了关于内激素的假设，而在1926年，kopec等首次发现昆虫大脑中的分泌物能够控制昆虫的取食行为，这是科学家首次对昆虫神经肽的认识和研究。而第一次分离出神经肽则是1975年对直肠素(proctolin)的分离。随后脂动激素(adipokinetichormone)的结构也被解析出来，这两种肽均为10个氨基酸以内的短肽。在这之后，随着现代生物化学、生物物理学、分子生物学、分析测试及基因工程技术的发展和应用，一系列重要的昆虫神经肽被分离、纯化，大量的一级结构被确定。目前的研究表明，昆虫神经肽控制和调节着昆虫体内器官或腺体的活动，进而影响昆虫的生长、发育、变态、生殖和代谢等重要的生理过程，且多数昆虫神经肽受体是g蛋白偶联受体(gpcr)，因此研究昆虫激肽及其类似物与受体的相互作用可帮助发现新的杀虫剂作用靶标并对新型杀虫剂的研发具有重要指导意义。白细胞激肽(leucokinins，lks)广泛存在于无脊椎动物尤其是昆虫的神经系统中，最早在马德拉蜚蠊(leucophaeamaderae)体内被发现。后来不断地从各种昆虫体内分离出来，其中又以双翅目、鳞翅目和直翅目的昆虫为多，再后来从线虫动物和软体动物中也分离出了类似的激肽。lks一般由7-15个氨基酸构成，具有c末端五肽序列fx1x2wg，其中x1＝f、h、n、s或y，x2＝a、p或s。nachman和holman等人发现，这种五肽片段是lks保持生物活性所需的最短序列，是lks的主要功能区，称为“活性核心”。研究表明lks在利尿、消化器官收缩和幼虫发育等关键过程中起到重要作用，而其在昆虫取食方面的抑制作用则是最有应用价值、最有可能被开发为新型杀虫剂的。此类多肽及类似物在取食方面的重要作用已经在很多研究被证明，例如人工施加外源白细胞激肽可以抑制烟芽夜蛾(heliothisvirescens)幼虫的体重增长，注射白细胞激肽则会率引起蚜虫拒食并死亡等。lks一般是通过改变昆虫肠道运动模式、抑制消化酶释放、阻断体液循环及营养转运等方式使昆虫消化过程紊乱，导致食物在肠道中堆积，从而起到抑制昆虫取食的作用，最终引起昆虫死亡。不过lks易被特异性的酶降解，生物稳定性较低，这大大降低了其实用价值。因此需要对其进行修饰和改造，以提高其生物稳定性。nachmn等人发现当c端五肽类似物中位于酶解位点的ser被非天然氨基酸[aib]替换后，抗昆虫ace酶降解能力明显增强。这种通过关键氨基酸残基替换的修饰方式也为后续lks类似物的开发提供了思路。草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)属于鳞翅目(lepidoptera)夜蛾科(noctuidae)。原产于美洲热带和亚热带地区，具有远距离迁飞习性，是一种重要的农业害虫。其食谱范围大，寄主植物高达353种，主要包括禾本科的玉米、水稻以及棉花、甜菜等多种作物。草地贪夜蛾对不同寄主有偏好性，也因为这种偏好性逐渐分化形出了玉米型和水稻型两个亚型。2016年起，草地贪夜蛾开始入侵至非洲、亚洲各国，并于2019年由缅甸入侵我国云南西部地区，并随后波及了19个省份。主要为害我国的冬玉米，已在我国造成巨大的农业损失。目前田间主要是通过化学农药来对其进行防治，然而因害虫抗药性的不断提高使得农药的使用剂量随之加大，而农药剂量的增加则引发了农产品质量安全、环境安全和生物多样性等一系列问题，所以亟需研发出具有新型作用机制，且对环境污染小的安全、高效的新型杀虫剂以及新的杀虫作用靶点。本发明借助生物信息学技术克隆了草地贪夜蛾白细胞激肽基因；并分析预测了其成熟肽序列；随后通过对成熟肽的修饰改造获得了具有显著抑制害虫取食作用的激肽类似物。三、技术实现要素：发明目的本发明的目的在于提供一类具有抑制昆虫取食作用的激肽及其类似物，为进一步开发抑制害虫取食的新型杀虫剂以及新型杀虫剂作用靶标的研发提供帮助。技术方案以室内饲养的草地贪夜蛾为对象，经过基因克隆技术克隆得到草地贪夜蛾白细胞激肽sflk基因序列，并分析预测其成熟肽序列，对其成熟肽序列进行修饰改造，然后进行合成，分别得到以下四种序列：sfkinin-2：vrfspwga、sfkinin-3：kvkfsawga、sflkanalogs-1：[aib]fs[aib]wga、sflkanalogs-2：ac-r[β3f]fs[aib]wga。再利用注射的方式将成熟肽及其类似物递送至草地贪夜蛾体内，最后对草地贪夜蛾进行取食行为测定，明确其对害虫取食的抑制效果。有益效果本发明发明所提供的的几种白细胞激肽类似物，相较于昆虫体内生物源的天然多肽来讲，其生物稳定性更高，抑制取食的效果更显著。可以为进一步开发安全、高效、绿色的新型多肽类害虫取食抑制剂提供帮助。附图说明图1sflk基因编码的三种成熟肽。图2两种成熟肽及其类似物的分子结构图。图3注射白细胞激肽成熟肽及其类似物对草地贪夜蛾取食量的影响。具体实施方式以下所述的试验操作便于更好的理解本发明，但不限定本发明。下述内容中所用试验材料与方法，如无特殊说明，均为常规材料和方法。1.sflk基因克隆及类似物合成(1)sflk基因克隆以本实验室所测得草地贪夜蛾转录组数据为基础，通过nr，nt，pfam，kog/cog，swiss-prot，kegg，go七大数据库对所测得转录本进行注释，获得所有可能的sflk基因。将获得的基因利用seqman软件进行拼接，拼接后的序列利用blastx分析，确定sflk的基因序列。然后利用editseq软件预测此序列中编码白细胞激肽的开放阅读框(orf)，即蛋白质编码区(cds)，利用ncbi在线引物设计工具设计引物，对此序列进行克隆验证。全长克隆引物sf-lk-f80：gcagtgatcgaattacaaaagaaccsf-lk-r1153：aagttcgggagcaaaacatcg克隆验证具体实验操作如下：取草地贪夜蛾四龄幼虫一头加入1mltrizolreagent(invitrogen)，匀浆仪匀浆处理4min，匀浆样品在室温放置5min后，涡旋震荡使核酸蛋白复合物完全分离，利用rna抽提试剂盒提取总rna，所提取的rna直接用于反转录或者置于-70℃冰箱备用。总rna提取后，按照iiqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)试剂盒(vazyme，nanjing，china)的说明，以500ng总rna为模板，在10μl的反应体系中合成cdna。合成的cdna模板直接用于基因克隆或者置于-20℃冰箱保存备用。使用vazyme公司的高保真酶2×phantamastermix进行pcr扩增。利用琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行验证，对于长度正确的条带进行切胶，使用omega公司的胶回收试剂盒按照说明进行回收。将回收得到的目的基因连到pmdtm19-tvectors上，然后将连接目的基因的t载体转化到dh5α感受态细胞中，加入lb培养液37℃摇床培养1h；转化后细胞培养后均匀涂布在含有lb培养基的平板上，37℃倒置培养16h后挑斑，挑取白斑作为pcr模板进行菌落pcr，通过琼脂糖凝胶验证目的基因与t载体的连接效果；将菌落pcr验证连接正确的菌液进行测序。(2)草地贪夜蛾白细胞激肽成熟肽预测及修饰利用dnaman软件翻译前述步骤中已经获得和验证的sflk基因cds区，获得白细胞激肽的前体神经肽，然后以二元裂解信号kr(lys-arg)和kk(lys-lys)、c端酰胺化信号g(gly)、核心五肽的保守位点(第一位的phe、第四位的trp、第五位的gly)为特征氨基酸寻找成熟肽，获得三种成熟肽，sfkinini、sfkininii、sfkininiii(图1)以获得的草地贪夜蛾成熟肽序列为基础进行修饰改造，获得两种类似物。由南京金斯瑞生物公司合成成熟肽及其类似物。sfkininiyfspwgamidesfkininiivrfspwgamidesfkininiiikvkfsawgamidesflkanalogs-1[aib]fs[aib]wgamidesflkanalogs-2ac-r[β3f]fs[aib]wgamide2.注射草地贪夜蛾白细胞激肽类似物及草地贪夜蛾取食行为测定本实验选取体重在0.07±0.03g的四龄幼虫作为实验昆虫。并在实验前禁食24h，以保证受试昆虫状态统一。利用1μl规格的微量进样器进行注射，注射位置为幼虫背部第三四体节中间。注射溶液包括多肽溶液及作为对照的pbs缓冲液或dmso。注射浓度为2.387×10-4mol/l，注射量为0.5μl。每种多肽以及对照组作为一个处理注射至少15头虫。注射后的受药昆虫单头接入饲料管中，每24h对取食量进行一次测定，直至幼虫开始钻蛀。同时设置仅有饲料的空白对照，用来矫正由于挥发而导致的测量误差，最终得到多肽及类似物对害虫取食的影响。通过观察和统计分析褐飞虱的取食量，结果表明：同对照组相比，注射多肽可显著降低草地贪夜蛾取食量(图2)。当前第1页12