EMILIN2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及emilin2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用。

背景技术：

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的70-80％。由于其具有高度浸润性特征，促使外科手术无法将其完全切除，导致部分患者术后仍会复发。目前临床上常用手术、放疗、化疗及基因治疗等手段治疗胶质瘤，其中化疗为胶质瘤治疗的重要辅助手段。多年临床研究表明替莫唑胺(temozolomide，tmz)能有效改善胶质瘤患者的生存预后，已成为治疗恶性胶质瘤的一线化疗药物，但仍有相当部分胶质瘤患者对替莫唑胺治疗不敏感或逐渐出现继发性耐药，导致化疗失败。因此，深入探究影响胶质瘤替莫唑胺药物敏感性的作用机制，最大程度发挥其治疗作用，可为胶质瘤患者实行个体化精准治疗提供理论依据。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了emilin2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本申请由中国国家自然科学基金(no.81960458，82060680，81860664)以及江西省自然科学基金(no.20202babl216080，20192bab215063)资助。

本发明是这样实现的，emilin2在制备调节肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。

本发明还披露了emilin2在作为肿瘤替莫唑胺耐药检测、治疗和/或预后分子靶点的应用。

本发明还披露了emilin2的表达干扰试剂在制备提高肿瘤对替莫唑胺类药物敏感性的药物中的应用。

进一步地，所述干扰试剂包括emilin2sirna序列ggatcaatgtgacggagaa。

进一步地，所述肿瘤包括胶质瘤、食管癌、乳腺癌和肝癌中的至少一种。

一种肿瘤对替莫唑胺类药物耐药检测或生存预后检测试剂盒，包括rna逆转录试剂gdnaeraser、5×gdnaeraserbuffer、rnsaefreedh2o、5×primescriptbuffer2、primescriptrtenzymemix、rtprimermix，荧光定量pcr试剂tbgreen、rnsaefreedh2o及针对emilin2设计的引物，所述引物序列见seqidno.1和seqidno.2所示。

进一步地，所述肿瘤包括胶质瘤、食管癌、乳腺癌和肝癌中的至少一种。

本发明还提供了一种胶质瘤恶性进展分子标志物，所述分子标志物为emilin2基因。

本发明还提供了一种胶质瘤生存预后分子标志物，所述分子标志物为emilin2基因。

本发明还提供了如上述的分子标志物在制备胶质瘤诊断或治疗或生存预后检测的试剂或试剂盒中的应用。

本发明通过检测胶质瘤病人中emilin2表达水平，制备胶质瘤替莫唑胺耐药、肿瘤恶性程度、患者生存预后检测试剂盒，该试剂盒中含有定量检测emilin2rna转录水平以及蛋白表达水平的试剂等。通过检测患者胶质瘤组织中emilin2基因表达水平情况，预测患者对替莫唑胺化疗的敏感性，肿瘤恶性程度以及患者生存预后情况。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请发现emilin2在胶质瘤的生存预后及治疗中具有重要的临床意义。检测胶质瘤病人中emilin2水平是否上调，可作为肿瘤早期诊断、耐药检测及生存预后检测靶点。据此可制备相应的胶质瘤早期诊断检测试剂盒、替莫唑胺耐药试剂盒，生存预后检测试剂盒，这些试剂盒中包括定量检测emilin2的rna转录水平的试剂，包括rna逆转录试剂gdnaeraser、5×gdnaeraserbuffer、rnsaefreedh2o、5×primescriptbuffer2、primescriptrtenzymemix、rtprimermix，荧光定量pcr试剂tbgreen、rnsaefreedh2o及针对emilin2设计的引物等。通过检测患者胶质瘤组织中emilin2基因表达水平是否改变来预测患者的生存预后情况，通过检测患者胶质瘤组织中emilin2的rna表达水平等，从而判断该患者是否对替莫唑胺药物的治疗具有抵抗性，进而制定个体化临床诊疗方案。

本发明寻找到一个特异性的分子标志物，可成为胶质瘤患者替莫唑胺化疗疗效的预测及指导胶质瘤个体化用药提供新的生物标志物。本发明的目的基因可以在dna水平检测，dna比rna或蛋白具有更强的稳定性，可提高诊断的准确性和局限性。

本发明为胶质瘤患者的治疗提供了有针对性的治疗方案，对于emilin2低表达的胶质瘤患者，单独使用替莫唑胺即可获得较好的治疗效果。

本发明公开了emilin2作为胶质瘤耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用，本发明发现emilin2的高表达可促进肿瘤替莫唑胺药物耐受性及肿瘤的复发。目前恶性胶质瘤的标准治疗方案，是在最大范围手术全切除的基础上结合化疗和放疗的综合疗法。化疗是胶质瘤治疗的辅助手段，化疗耐药性现已成为影响胶质瘤患者预后的重要因素。

附图说明

图1是对geo数据库中gse80729及gse113510两个数据集进行分析，筛选与胶质瘤替莫唑胺耐药相关的差异表达基因。

图2是通过david6.7对耐药差异表达基因进行go和kegg富集分析，预测与之相关的生物学功能及kegg信号通路，结果显示可能与emt相关蛋白如e-cadherin、n–cadherin及wnt、integrin-β1有关。

图3是对2个与胶质瘤替莫唑胺耐药相关的geo数据集中差异表达基因取交集，筛选出与替莫唑胺耐药相关的基因，此外所得的基因再与tcga中胶质瘤与正常脑组织中差异表达的基因取交集，即获得与替莫唑胺耐药相关又参与胶质瘤恶性进展的基因。结果显示与替莫唑胺耐药相关的基因中同时在胶质瘤中高表达的基因有9个：batf2，tmem133，masp1，mnx1，cdh15，kcnq1，emilin2，c1r，tcirg1；低表达的基因有4个：nrg4，bhlhe22，btbd16，faim2。

图4是使用gepia网页进行差异基因的生存分析，预测低表达基因与胶质瘤临床预后的关系。

图5使用gepia网页进行差异基因的生存分析，预测胶质瘤中高表达基因与临床预后的关系，并通过p<0.05筛选出关键差异基因emlin2。

图6在tcga数据库中对emilin2表达情况进行验证，结果显示emilin2在胶质瘤组织中高表达(p<0.05)。

图7组织样本水平分析emilin2表达与胶质瘤恶性程度及临床预后的关系，结果显示emilin2表达水平在胶质瘤中显著上调，并且该基因的表达越高其肿瘤恶性程度越高，即其表达情况与胶质瘤恶性程度呈正相关；生存曲线证实emilin2表达越低患者预后越好。

图8流式实验及hoechst染色分析发现干扰emilin2可能影响胶质瘤细胞u251、u87对替莫唑胺的药物敏感性。

图9是本申请的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了emilin2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用。本发明所采取的技术方案是：本发明首先对geo数据库中与替莫唑胺耐药相关的gse80729和gse113510数据集分别进行分析，通过绘制火山图与聚类图探究差异表达基因，并通过go及kegg富集分析发现与替莫唑胺耐药相关的差异基因可能与细胞粘附信号通路及蛋白有关，即与上皮间质转化过程有关。进一步将于耐药相关的差异表达基因与tcga数据库中胶质瘤与正常脑组织的差异表达的基因取交集，得到与替莫唑胺耐药相关的基因中同时在胶质瘤中高表达的基因有9个，以及4个低表达的基因。随后，通过gepia工具进行生存分析，筛选出在胶质瘤中高表达基因emilin2与生存预后相关(图9是本申请的整体流程图)。

进一步的，采用tcga数据库分析，结果提示emilin2表达水平在胶质瘤中显著上调。为了进一步验证其表达水平，我们利用本课题组前期收集到的胶质瘤组织(n＝97)及脑外伤正常脑组织(n＝18)样本通过rt-qpcr发现emilin2表达水平在胶质瘤中显著上调，并且该基因的表达越高其肿瘤恶性程度越高，即其表达情况与胶质瘤恶性程度呈正相关；同时我们通过随访患者得出的生存曲线图也证实了emilin2表达越低患者预后越好。

更进一步的，为了证实emilin2与胶质瘤替莫唑胺耐药具有相关性，我们通过在u251及u87胶质瘤细胞系中干扰emilin2，流式细胞仪及hoechst染色检测替莫唑胺处理后的胶质瘤细胞凋亡情况，结果显示干扰emilin2可能提高了胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性。

本实验所涉及的实验材料及试剂：97例原发性神经胶质瘤组织样本、18例脑外伤手术患者正常脑组织样本及相关临床信息获取自南昌大学第二附属医院及江西省肿瘤医院，rt-qpcr相关试剂为市售。

下面结合具体实施例子，进一步阐明本发明内容。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1胶质瘤中差异表达的emilin2基因的筛选

(1)geo数据库分析筛选差异表达的耐药基因

方法：首先对geo数据库中与替莫唑胺耐药相关的gse80729和gse113510数据集分别进行分析，通过绘制火山图与聚类图筛选差异表达基因。

结果：共有6135个与替莫唑胺耐药相关的基因，其中gse80729数据集中109个基因上调，88个基因下调(图1a-b)，而gse113510数据集中有2769个基因上调，3366个基因下调(图1c-d所示)。

结论：多个基因参与了胶质瘤替莫唑胺耐药过程。

(2)预测耐药差异表达基因相关的生物学功能

方法：通过go富集分析发现差异表达基因，预测耐药基因相关生物学功能及kegg信号通路。

结果：差异表达的耐药基因可能与emt相关蛋白如e-cadherin、n–cadherin及wnt、integrin-β1有关(图2)。

结论：替莫唑胺耐药可能与emt过程有关。

实施例2筛选出的差异表达基因与患者生存预后相关

(1)进一步筛选耐药的差异表达基因

方法：将geo中替莫唑胺耐药相关gse80729和gse113510数据集取交集筛选的相关基因与tcga数据库中胶质瘤与正常脑组织中差异表达的基因取交集。

结果：得到9个与胶质瘤恶性进展有关并在与胶质瘤耐药相关的高表达的基因(batf2，tmem133，masp1，mnx1，cdh15，kcnq1，emilin2，c1r，tcirg1)，以及4个低表达的基因(nrg4，bhlhe22，btbd16，faim2)(图3)。

(2)筛选与预后相关的耐药差异表达基因

方法：通过对gepia数据库进行生存分析，筛选出在胶质瘤中与临床预后相关的耐药差异表达基因。

结果：emilin2在胶质瘤组织中显著高表达，并与胶质瘤病人的预后密切相关(图4-5)。

实施例3验证emilin2表达与胶质瘤恶性进展及患者生存预后的关系

1、生物信息学验证

方法：运用tcga数据库样本分析emilin2在正常组织及胶质瘤组织中的表达。

结果：emilin在胶质瘤中显著高表达(见图6)。

2、临床样本验证

方法：采用rt-qpcr，在本课题组前期收集到的胶质瘤组织(n＝97)及脑外伤正常脑组织(n＝18)样本中检测emilin2的表达水平，并探究其水平与预后的关系。

本实施例公开的一种胶质瘤emilin2诊断检测方法，采取正常脑组织或胶质瘤患者肿瘤组织，按照说明书操作步骤提取总rna，浓度为1000ng/μl，将提好的总rna逆转录为cdna，并将剩余的rna保存于-80℃。具体条件如下：

(1)逆转录反应如下：

1)体系1(去除基因组dna)

反应条件：42℃，2min，4℃，forever。

2)体系2(逆转录)

将反应结束后的体系1直接加入体系2，混匀，反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，forever。

(2)逆转录产物扩增的操作

用于rt-qpcr分析，将以上cdna混匀，吸取2μl配制反应体系如下：

引物序列同下。

反应条件采用两步法pcr标准扩增程序：

第一步：变性95℃30s

第二步：pcr反应95℃5s，60℃30s；50个循环

第三步：溶解曲线95℃10s，65℃5s

引物浓度为10μm，以gapdh为内参，按照2^-δct法计算相对表达量。其中检测emilin2基因水平拷贝数的引物序列为：

f:5′-cgaagtcacctcctgtagctt-3’，seqidno.1；

r:5′-atcactggggaaaggcttctg-3’，seqidno.2；

gapdh基因水平拷贝数的引物序列为：

f:5′-ggagcgagatccctccaaaat-3’,seqidno.3；

r:5′-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’,seqidno.4；

结果：rt-qpcr结果显示，与正常组织相比，emilin2的mrna水平在胶质瘤组织中显著上调(p<0.05)。(如图7所示)

结论：证实了emilin2在胶质瘤组织中高表达。

实施例4验证emilin2是否影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性

方法：在胶质瘤细胞系u251、u87中以sirna转染干扰emilin2后加入含有500μm浓度替莫唑胺的培养基，72h后采用流式细胞仪及hoechst染色实验检测细胞凋亡情况。

(1)转染

①emilin2sirna序列：

ggatcaatgtgacggagaa，seqidno.5；

②操作步骤

转染前一天，将胶质瘤u251、u87细胞接种于6孔板中，用含有10％fbs的dmem完全培养基培养。待细胞生长融合度达到40-50％时，对细胞进行转染。转染前先除去旧的细胞培养液，用pbs清洗2-3遍后，每孔加入1.5ml完全培养基。随后配制转染体系：在3个1.5mlep管中各加入250μlopti-mem，再分别加入5μlemilin2sirna、nc片段，另一组不加干扰片段设置为control组，轻轻混匀后静置5min；另取3个1.5mlep管中各加入250μlopti-mem，再分别加入5μllipo-rnaimax，轻轻混匀后静置5min。最后将两个体系轻轻混匀，静置20min后分别加入对应的孔中，继续培养48h后提取rna，进行rt-qpcr(操作步骤同实施例2)。

(2)加药处理

称取替莫唑胺粉末，加入含10％fbs的dmem完全培养基充分溶解，配制成500μm浓度的药液。在转染12h后，除去旧的细胞培养液，用pbs清洗1-2遍后，加入含替莫唑胺的完全培养基，继续培养至72h。

(3)流式细胞仪检测细胞凋亡

按上述步骤转染及加药后，待细胞生长至80-90％，收集上清离心，pbs清洗2遍，胰酶消化收集细胞转移至已收集的上清细胞的ep管中，再离心5min，弃上清，pbs洗1-2遍后，各样本中加入annexinv-fitc结合液195μl重悬细胞，再加入5μlannexinv-fitc及10μl碘化丙啶后轻轻混匀，室温避光孵育10-20min后，上机检测细胞凋亡情况。

(2)hoechst染色检测细胞凋亡情况

按上述步骤转染及加药后，待细胞生长至80-90％，弃掉旧培基，加入适量的4％多聚甲醛固定细胞30min。弃掉多聚甲醛后pbs清洗2-3遍，加入适量hoechst33342荧光抗猝灭剂染色10-20min后，立即在荧光显微镜中观察细胞凋亡情况。

结果：rt-qpcr检测emilin2sirna干扰效率(图8a)，流式细胞仪检测、hoechest染色结果显示emilin2干扰后并通过替莫唑胺处理的胶质瘤细胞凋亡数目显著增加(图8b-c)。以上结果均表明干扰emilin2可影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性。

总结：本发明通过生物信息学分析发现了一种细胞外基质蛋白emilin2在胶质瘤中显著高表达，且其表达水平与胶质瘤患者生存预后密切相关，同时在临床水平检测emilin2在胶质瘤组织与正常组织样本中的表达情况，结果与生物信息学分析结果一致。为了进一步研究emilin2与耐药相关，采用流式凋亡实验及hoechest染色证实干扰emilin2后并通过替莫唑胺处理的胶质瘤细胞细胞凋亡显著增加，即干扰emilin2可能提高了胶质瘤细胞u251、u87对替莫唑胺的敏感性。

上述实例仅为发明较佳的实施方式而已，并不受本发明限制，若有背离本发明的精神与原理在内的任何改动、替换、重组及删减等均视为同等置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南昌大学第二附属医院

江西省肿瘤医院

<120>emilin2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgaagtcacctcctgtagctt21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atcactggggaaaggcttctg21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggagcgagatccctccaaaat21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggctgttgtcatacttctcatgg23

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggatcaatgtgacggagaa19