一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用。


背景技术：

2.布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患传染病，人感染后出现发热、肌肉酸疼等症状，之后逐步丧失劳动力。动物感染后主要引起繁殖障碍。总之，布鲁氏菌病会对社会和经济发展造成重大的影响。过去的几十年中，通过疫苗免疫和防控宣传，使大家对布鲁氏菌病有了更充分的了解，但要更一步的提高防控效果以及根除布鲁氏菌仍有更多的工作要做，最主要的是研发安全有效的疫苗，当前使用的疫苗主要为减毒活疫苗，在疫苗的使用过程中对人和动物存在感染的风险，成为疫苗推广使用的主要痛点。
3.革兰氏阴性菌的外膜囊泡(outer membrane vesicles，omvs)具有双层膜，由脂蛋白、外膜蛋白(omp)、脂多糖(lps)和一些周质成分组成，含有菌体必须的免疫原性蛋白，同时含有大量的病原相关模式分子(pamp)，能有效诱导机体的非特异性免疫。因此，外膜囊泡可用于研发布鲁氏菌疫苗或者用于增强免疫性。然而，由布鲁氏菌正常分泌产生的外膜囊泡的量相对较少，因此，有必要提供一种能够提高布鲁氏菌外膜囊泡产量的制备方法。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法及其应用，以解决现有技术中存在的布鲁氏菌外膜囊泡产量不高的技术问题。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.在一方面，本发明提供了一种布鲁氏菌外膜囊泡的制备方法，所述方法包括以基因bamd、omp39、omp2b、cgs、bf3285c中的一种或多种为靶标进行改造获得基因缺失突变株的步骤。
8.本发明提供的外膜囊泡制备方法，通过基因工程方法选择细胞膜稳定性相关的基因靶标位点进行改造，成功获得5株基因缺失菌株，利用所述基因缺失突变株提取外膜囊泡，3株显著提高了菌株外膜囊泡产量。
9.在一个实施方案中，所述改造获得基因缺失突变株采用同源重组的方法进行；优选地，所述同源重组为自杀性质粒介导的同源重组。
10.在一个实施方案中，所述改造获得基因缺失突变株包括以下步骤：
11.(a)扩增待敲除基因的上下游同源臂；
12.(b)将扩增产物dna片段分别连接果糖蔗糖酶基因sacb，然后构建自杀性质粒；
13.(c)将所述自杀性质粒加入布鲁氏菌感受态细胞中并进行转化；
14.(d)筛选阳性克隆株。
15.在一个实施方案中，所述自杀性质粒为pbk
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cmv
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δbamd
‑
sacb、pbk
‑
cmv
‑
δomp39
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sacb、pbk
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cmv
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δomp2b
‑
sacb、pbk
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cmv
‑
δcgs
‑
sacb、pbk
‑
cmv
‑
δbf3285c
‑
sacb。
16.在一个实施方案中，当所述待敲除基因为bamd时，扩增上游同源臂序列的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；
17.当所述待敲除基因为omp39时，扩增上游同源臂序列的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；
18.当所述待敲除基因为omp2b时，扩增上游同源臂序列的引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；
19.当所述待敲除基因为cgs时，扩增上游同源臂序列的引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示；
20.当所述待敲除基因为bf3285c时，扩增上游同源臂序列的引物序列如seq id no.17和seq id no.18所示；扩增下游同源臂序列的引物序列如seq id no.19和seq id no.20所示。
21.在一个实施方案中，所述筛选阳性克隆株包括利用卡那霉素抗性和果糖蔗糖酶基因sacb进行正、负向筛选得到敲除基因的阳性突变株。
22.在一个实施方案中，所述筛选阳性克隆株的具体方法包括：将电击完成后的转化液涂于含有卡那霉素的布氏琼脂培养基上进行培养，挑单菌落加入tsb培养基中培养，将培养物稀释后涂布于添加蔗糖的布氏琼脂培养基平板上，对平板上长出的菌落进行pcr鉴定。
23.在一个实施方案中，所述方法还包括使用获得的基因缺失突变株制备外膜囊泡的步骤。
24.在一个实施方案中，所述制备外膜囊泡的步骤包括选取pcr鉴定正确的阳性菌落接种培养，将培养菌液离心，过滤获得上清液后超速离心，弃去超速离心后的上清，将沉淀重悬于无菌pbs缓冲液中。
25.在一个实施方案中，在将沉淀重悬于无菌pbs缓冲液中后，还包括再次进行离心去上清以及重悬沉淀的步骤。
26.在另一方面，本发明还提供了根据前述方法制备的布鲁氏菌外膜囊泡在制备疫苗或免疫增强剂中的应用。
27.有益效果：
28.本发明提供的利用分子生物学方法筛选靶标基因进行改造，开发出一种新的布鲁氏菌omv制备方法，与传统添加去污剂的制备方法相比，该方法避免了去污剂的残留，提高了制备的简便性并且显著提高了omv产量，并且完全保留了omv抗原的天然结构，所制备的疫苗更有效的诱导免疫反应。
29.本发明通过基因工程方法，选择潜在的基因靶标位点进行改造，成功获得5株基因缺失菌株，其中3株菌株培养omv提取结果显示改造后的菌株产量得到显著提高，同时保证了omv抗原的天然结构，接种后能更有效的诱导免疫反应，以所提取的omv为抗原制备疫苗，动物接种后能有效防御野毒菌株的攻击。布鲁氏菌omv具有活疫苗不具备的高度安全性，且能提供高效的保护效力，为布鲁氏菌病的防控提供有利的工具。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明实施例提供的蛋白定量标准曲线；
32.图2为本发明实施例提供的不同菌株omv电泳检测结果(其中，m：蛋白maker；1～6：hb20
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δomp39、hb20+sds、hb20
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δbamd、hb20
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δomp2b、hb20
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δcgs、hb20
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δbf3285c)；
33.图3为不同菌株(hb20
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δomp39、hb20+sds、hb20
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δbamd、hb20
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δomp2b、hb20
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δcgs、hb20
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δbf3285c)omv免疫后m28攻毒保护的结果图。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例1布鲁氏菌菌株的改造
36.布鲁氏菌天然菌株产生的omv数量有限，一般产量不超过0.4μg/ml菌液，可利用基因工程手段对菌株进行改造来提高布鲁氏菌omv的产量。
37.具体方法如下：
38.1.1靶基因敲除质粒构建
39.本发明选取与布鲁氏菌细胞膜稳定性相关的基因bamd、omp39、omp2b、cgs、bf3285c为靶标进行改造，利用生物信息学工具全面评估，筛选出需要敲除的基因序列，分别针对要敲出基因序列上下游设计同源臂(引物信息见表1)，以pib279质粒(含sacb基因)基因组为模板，以sacb
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f和sacb
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r为引物pcr扩增sacb基因，将同源臂分别连接sacb基因，获得自杀质粒pbk
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cmv
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δbamd
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sacb、pbk
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cmv
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δomp39
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sacb、pbk
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cmv
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δomp2b
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sacb、pbk
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cmv
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δcgs
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sacb、pbk
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cmv
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δbf3285c
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sacb。
40.表1引物信息表
41.[0042][0043]
1.2制备布鲁氏菌感受态细胞
[0044]
将本实验室所分离野生型布鲁氏菌hb20株涂布于布鲁氏菌琼脂培养基上，37℃培养3日后，挑取单菌落于200ml tsb培养基中震荡培养至od600为0.3左右，放入冰水混合物中冰浴30min。5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用含有10％甘油的超纯水洗涤5遍后，用2ml含有10％甘油的超纯水重悬，每管分装200μl冻存备用。
[0045]
1.3电击转化
[0046]
将提取的自杀质粒pbk
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cmv
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δbamd
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sacb、pbk
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cmv
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δomp39
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sacb、pbk
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cmv
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δomp2b
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sacb、pbk
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cmv
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δcgs
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sacb、pbk
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cmv
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δbf3285c
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sacb的dna加入布氏菌布鲁氏菌hb20感受态细胞中并混匀，冰浴30min。1250v，0.5cm，电击转化，加入1ml soc复苏液。电击转化液于37℃，180r/min振荡培养24小时。将转化液涂于含有卡那霉素(kanamycin，kanr)(50μg/ml)的布氏琼脂培养基平板上，37℃培养。
[0047]
1.4筛选阳性克隆株
[0048]
从含有kanr抗生素的tsa平板上挑单菌落于适量tsb液中，37℃下250r/min振荡培养48小时，适当稀释培养物并涂布于添加5％蔗糖的布氏琼脂培养基平板上，37℃培养4日。平板上长出的菌落进行pcr鉴定，将pcr鉴定正确的阳性菌落分别命名为hb20
‑
δbamd、hb20
‑
δomp39、hb20
‑
δomp2b、hb20
‑
δcgs、hb20
‑
δbf3285c。
[0049]
1.5不同菌株omv制备
[0050]
分别接种培养hb20、hb20
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δbamd、hb20
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δomp39、hb20
‑
δomp2b、hb20
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δcgs、hb20
‑
δbf3285c各500ml，37℃，以200r/min培养48小时，将培养菌悬液离心，以10,000g/
min，4℃，离心15分钟。离心后收集的菌液上清，用0.45μm滤膜过滤2次。过滤后的上清进行超速离心，以35000r/min，4℃，离心2小时。弃掉超速离心后的上清，将沉淀重悬于无菌pbs缓冲液中(ph＝7.2)，再次以35000r/min，4℃，离心2小时，弃掉上清后用2ml无菌pbs缓冲液(ph＝7.2)重悬沉淀，置
‑
20℃保存备用。
[0051]
1.6不同菌株omv产量对比
[0052]
将同等条件下，相同培养体积的菌液所产生的omv进行定量，分析不同菌株之间omv产量的差异。用bca蛋白定量试剂盒定量对步骤1.5中样品进行定量(蛋白定量标准曲线如图1所示)，同时进行sds
‑
page电泳。结果显示，改造过的菌株omv的产量得到了提升，与未改造菌株呈显著性差异。下表2为不同菌株omv产量检测。图2为不同菌株omv电泳检测结果图。
[0053]
表2不同菌株omv产量检测
[0054][0055][0056]
由表2、图2可以看出，针对膜稳定性的基因进行改造后可显著提高布鲁氏菌hb20株omv的产量，其中bf3285c基因部分缺失后的菌株效果最为理想，其次为cgs和omp2b部分基因缺失菌株。而omp39和bamd基因缺失后与hb20无差异，效果较差。
[0057]
1.7改造菌株omv免疫原性验证
[0058]
300～350μg豚鼠，分为5组(n＝10)，分别腹部皮下接种hb20、hb20
‑
δomp2b、hb20
‑
δcgs、hb20
‑
δbf3285c菌株所生产omv铝胶疫苗及生理盐水，20μg/只，间隔14日后，以相同剂量相同途径进行加强免疫，加强免疫后28日，用野生型布鲁氏菌m28株进行攻毒，腹部皮下，30cfu/只，攻毒后30日剖检豚鼠，取脾脏、淋巴结进行细菌学检查。
[0059]
结果显示，所有omv免疫豚鼠均能提供有效保护，其中hb20
‑
δbf3285c、hb20
‑
δcgs效果最优，结果见图3。
[0060]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。