一株产碱杆菌及其应用和促进大豆生长的方法

本发明涉及生物菌剂技术领域，尤其涉及的是一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄芪根腐病和促进生长中的应用和制剂。

背景技术：

大豆(glycinemax(l.)merr.)是一种重要的农产品，其在食品、饲料加工、畜禽、水产养殖等领域有非常广泛的应用。我国大豆需求量大，但产量相对不足，大量依赖进口，2012年我国大豆进口总量达到5600万吨，占大豆总需求量的80％。因此如何提高大豆产量是我国农业面临的一项紧要任务。将大豆根瘤菌与其它有益微生物复合,会更有利于大豆根瘤菌的结瘤固氮作用,并已成为大豆根瘤菌剂和其它微生物制剂的发展方向。植物促生根际细菌本身能通过分泌植物激素等方法促进植物生长,在农业上具有应用价值。

根瘤菌(rhizobia)是一类分布于土壤中的革兰氏阴性、需氧的杆状细菌，以鞭毛运动，无芽孢。根瘤菌—豆科植物共生体系的形成是一个非常复杂的过程：根瘤菌在土壤中营腐生生活，当豆科植物生长时，其根系会产生多种分泌物，其中就有次生代谢产物类黄酮。在根瘤共生体中，固氮酶受到豆血红蛋白的保护进行固氮。豆科作物为根瘤菌细胞提供充足的营养物质，例如糖类、氨基酸类和有机酸类物质，而根瘤菌将所固定的氮通过酰胺、酰脲的形式传递给豆科植物利用。由于根瘤菌能通过生物固氮作用将空气中的氮固定下来供植物使用，从而有助于植物的生长，所以大豆被认为是对土地利用效率最高的作物之一。我国作为大豆的原产地，有着丰富的大豆根瘤菌资源。

技术实现要素：

本发明提供一株产碱杆菌及其应用和促进大豆生长的方法。筛选出能促进大豆植株生长和结瘤的根际菌株与根瘤菌共接种促进豆科植物结瘤固氮，促进植物生长，以达到节约肥料资源、粮食持续增产和保护农田生态环境的重要意义

本发明的技术方案如下：

一株产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno：21555，分类命名为：粪产碱杆菌，alcaligenesfaecalis。

一种利用所述的产碱杆菌促进大豆生长的方法，产碱杆菌和根瘤菌共接种。

所述的方法，将根瘤菌和ccnwlxl9菌液共同加入无氮营养液中，待大豆子叶张开时，延大豆根部浇入。

所述的方法，根瘤菌和ccnwlxl9菌液体积比为1:1。

一种所述的产碱杆菌的应用，促进大豆生长，同时提高根、茎干重，能显著促进促根瘤菌进行结瘤、固氮。

一种所述的产碱杆菌的应用，该菌株作为产铁载体的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的的产碱杆菌能促进大豆生长，同时提高根、茎干重，能显著促进促根瘤菌进行结瘤、固氮；同时具有产铁载体的能力。

附图说明

图1为菌株划线结果；

图2为系统发育进化树；

图3为单接ccnwlxl9与不接菌干重百分比；

图4为ccnwlxl9与根瘤菌共接干重百分比；

图5为ccnwlxl9与根瘤菌共接根瘤数百分比；

图6为ccnwlxl9与根瘤菌共接总氮百分比；

图7为产铁载体实验结果；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

1、菌株来源

从陕西省杨凌区(34°16'n,108°4'e)试验田选取长势良好的，处于花期的大豆(品种为中黄13)3株，自其根部的根瘤分离纯化出该菌株。

2、菌株培养

培养于28℃恒温培养箱，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，琼脂18～20g，水1000ml，调ph7.2～7.4。121℃灭菌2h。菌株涂布结果如图1。

实施例2

菌株鉴定

将该菌株于液体培养基140rpm摇床培养2天后，提取dna，进行16srdna测序，序列如seqidno：1所示。

将测序结果在ncbi上进行blast比对，构建系统发育进化树。结果如图2所示，该菌株与alcaligenesfaecalissubsp.parafaecalisg的相似度为98％，属于产碱杆属(alcaligenessp.)命名为alcaligenessp.ccnwlxl9。

将产碱杆属ccnwlxl9于2020年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno：21555，分类命名为：粪产碱杆菌，alcaligenesfaecalis。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例3

菌株与根瘤菌共接种试验

1、供试菌株

以具有固氮促结瘤能力的中华根瘤菌sinorhizobiumamericanumcfnei156为主体菌株，与具有产铁载体能力的促生菌株alcaligenessp.ccnwlxl9为组合，进行促生长和促结瘤能力的检测。

2、试验设计

为保证植物实验的可靠性，对于该菌株进行3次重复实验，进行单接ccnwlxl9和ccnwlxl9与根瘤菌共接的两个菌系处理组对组合菌株促生长和促结瘤能力的检测。进行两组试验，第一组试验分两个处理，ⅰ为不接任何菌，只浇无氮营养液的空白对照，ⅱ为单接菌株ccnwlxl9，每个处理设置3次重复；第二组试验分两个处理，ⅲ为只接ccnwlxl9，并浇无氮营养液的对照组，ⅳ为共接菌株ccnwlxl9与根瘤菌，每个处理设置3次重复。

3、菌系制备

第一组试验，将ccnwlxl9菌株，在ym液体培养基(无琼脂，其他成分同yma培养基)中28℃，150rpm培养3d，培养液5000rpm离心10min收集菌体，菌体用无菌0.7％nacl溶液洗涤并悬浮为菌悬液，调od600至0.55左右(菌体细胞浓度约10⁸～10⁹cfu/ml)。等待后续接种。

第二组试验的菌系根瘤菌在ym液体培养基中，28℃、150rpm培养3d。ccnwlxl9接种于ty培养基中，28℃、150rpm培养2d。培养液5000rpm离心10min收集菌体，菌体用无菌0.7％nacl溶液洗涤并悬浮为菌悬液，调od600至0.55左右(菌体细胞浓度约10⁸～10⁹cfu/ml)。

4、植物试验

将蛭石和珍珠岩以2:1的比例混合，加入蒸馏水拌匀，在聚丙烯种植袋中装入约1l混合物，121℃灭菌1.5h后备用。选取饱满、粒大、表皮完整无破损的中黄13大豆种子，用无菌水摇动清洗1h，再用75％酒精处理30sec，用1％次氯酸钠处理4min进行表面消毒，用无菌水洗涤6次去除酒精和次氯酸钠。将消毒后的种子置于水琼脂平板(含琼脂1.2％)，倒置于28℃下避光3d进行发芽。选取发芽良好的种子在无菌条件下种于种植袋中，每袋2颗，同时浇入150ml无氮营养液(k2hpo40.5g，ca3(po4)22.0g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.1g，fecl30.01g，蒸馏水1000ml)，之后将其置于植物培养间，每天光照14h进行培养。

5、菌株接种

待大豆子叶张开时接入菌种。接种时分四种处理。①处理i——不接菌对照：将2ml无菌水加入150ml无氮营养液中，延根部浇入；②处理ii——单接ccnwlxl9对照：将ccnwlxl9菌液取1ml，再加1ml无菌水，加入150ml无氮营养液中，延根部浇入；③处理iii——只接根瘤菌的对照：将根瘤菌菌液取1ml，再加1ml无菌水，加入150ml无氮营养液中，延根部浇入；④处理iv——同时接根瘤菌和ccnwlxl9：将根瘤菌、ccnwlxl9菌液各取1ml，加入150ml无氮营养液中，延根部浇入。之后让植物在温室中继续生长，其间每隔10d浇入150ml无氮营养液。

接菌后第30d，取出植物，第一组试验测定根瘤总干重，根、茎干重。第二组试验对根、茎干重、根瘤数、总氮进行测定。

6、试验结果

在三次植物试验中，我们通过测定处理i和ii中植物的生长数据，ccnwlxl9菌株在未接根瘤菌的情况下，促进植物生长的能力，结果见图3。

比较不接菌的处理i和单接根瘤表面细菌的处理ii，我们看到在没有根瘤的情况下，ccnwlxl9菌株表现出一定的促植物生长能力。在接入后能将植株的根干重或茎干重相较于未接菌提高超过20％。根据显著性检验，在三次试验中，至少有一次促生效果在p＝0.05的水平上达到了显著。

通过测定处理iii和iv中植物的生长和结瘤数据，比较了ccnwlxl9菌株在接根瘤菌的情况下，促进植物生长和结瘤的能力，结果见图4、5、6。

对比单接根瘤菌的处理iii和共接根瘤菌及ccnwlxl9的处理iv。我们看到在有根瘤的情况下，ccnwlxl9表现出了促植物生长和促结瘤能力。至少在三次植物试验中的一次，在p＝0.05水平上显示出显著的促生长或促结瘤、促固氮能力。实验证明ccnwlxl9具有显著促植物生长能力：能同时提高根、茎干重，能显著促进结瘤。

实施例4

菌株促生能力检测

用cas平板检测产铁载体能力。

将ccnwlxl9菌株接种于cas平板培养基上，28℃从第3d开始至第14d观察菌落周围有无变为橘黄色的圈做定性分析。

观察在产铁载体鉴定(cas)培养基上28℃培养了3-14d的菌株，只要菌株能够在cas蓝色检测平板上生长，并且分泌的铁载体fe3+的结合能力比cas络合物强，即可被检测到。观察菌落周围有变为橘黄色的变色圈，如图7中30所示，形成了以菌株为中心的变色圈，证明该菌株有良好的产铁载体能力。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一株产碱杆菌及其应用和促进大豆生长的方法

<130>无

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1435

<212>dna

<213>alcaligenessp.

<400>1

caatggggagctttccatgcagtcgaacggcagcgcgagagagcttgctctcttggcggc60

gagtggcggacgggtgagtaatatatcggaacgtgcccagtagcgggggataactactcg120

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