一种用于动物组织直接PCR扩增的方法与流程

一种用于动物组织直接pcr扩增的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于动物组织直接pcr扩增的方法。


背景技术：

2.目前的动物组织直接pcr扩增方法虽然声称无需核酸提取步骤，但都需要配合具有组织裂解液功能的溶液等先对动物组织样本进行加热裂解处理之后将裂解液的上清(含粗制的dna)作为模板进行pcr扩增，并不是真正的在反应体系中加入动物组织进行直接pcr扩增。这样的pcr扩增方法工序复杂，不便捷，也会增加扩增成本。另外，现有的pcr扩增方法中取样过程中经常出现组织加量大小不一致的情况，从而导致取样差异，进而会造成扩增实验的失败。


技术实现要素：

3.为此，本发明提供一种用于动物组织直接pcr扩增的方法，以解决现有pcr扩增方法存在工序复杂、不便捷、扩增成本高、取样存在差异等问题。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.根据本发明的第一方面，一种用于动物组织直接pcr扩增的方法，所述方法包括如下步骤：
6.先使用取样器取动物组织加入pcr管中，再在pcr管中加入酶预混液、上游引物和下游引物并充分混匀，然后将装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增；
7.所述取样器包括手柄和取样头，所述取样头可拆卸地安装在所述手柄上；
8.所述酶预混液包括tris
‑
hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。
9.通过上述技术方案，本发明一种用于动物组织直接pcr扩增的方法中采用特定原料组成的酶预混液能实现动物组织直接pcr扩增，无需额外的组织裂解处理，减少了扩增工序，降低了扩增成本，使扩增更加便捷。其中，酶预混液含有除模板和引物外的其他pcr扩增必需组分，同时在不影响dna聚合酶活性和pcr扩增的条件下，向其中添加具有动物组织裂解力的裂解剂及可以保护酶并抗抑制的pcr增效剂，能有效实现动物组织直接pcr扩增。本发明的方法中采用专门的微量动物组织取样器对动物组织进行取样，保证取样标准化，能有效地避免取样差异造成的扩增失败等问题。
10.进一步地，所述tris
‑
hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l；所述tris
‑
hcl缓冲液的ph值为8.3～9.2；所述dna聚合酶为hotstart taq酶和pfu酶中的一种或两种；所述dna聚合酶的质量浓度为0.5％～4％。
11.进一步地，所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合；所述dntps的体积浓度为200～350μmol/l；所述镁离子为氯化镁或硫酸镁的一种或两种；所述镁离子的体积浓度为1.5～4mmol/l。
12.进一步地，所述单价阳离子为氯化钾或硫酸铵中的一种或两种；所述单价阳离子的终体积浓度为10～50mmol/l；所述pcr增效剂为去离子甲酰胺、dmso、bsa、甜菜碱、海藻糖、甘油、单链结合蛋白、氯化四甲基铵中的一种或几种；所述pcr增效剂的质量浓度为0.05％～15％。
13.进一步地，所述裂解剂为吐温20、吐温80、曲拉通x
‑
100、乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇十六烷基醚、十二烷基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的一种或几种；所述裂解剂的质量浓度为0.01％～5％。
14.进一步地，所述酶预混液、所述上游引物和所述下游引物的体积比为23：1：1；所述上游引物和所述下游引物的浓度均为10μmol/l。
15.通过对本发明方法中酶预混液的各原料种类、浓度、ph值进行进一步地优化，使优化后的pcr酶预混液可直接对少量的动物组织进行pcr扩增。
16.进一步地，所述扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min。
17.进一步地，使用所述取样器提取的动物组织的直径为1mm，厚度为1
‑
2mm。
18.进一步地，所述手柄呈“t”型状；所述取样头包括连接部和铲头，所述连接部的一端与所述手柄可拆卸地连接，另一端连接所述铲头。
19.进一步地，所述铲头包括半圆形铲刀和弧形包裹板，所述半圆形铲刀的一端与所述连接部连接，另一端两侧分别连接有所述弧形包裹板；所述半圆形铲刀的直径为1mm。
20.本发明具有如下优点：
21.本发明一种用于动物组织直接pcr扩增的方法中通过将含有特定原料组成的酶预混液与动物组织、上游引物和下游引物混合后装入pcr管中，就能实现动物组织直接pcr扩增，无需额外的组织裂解处理，该方法不仅快捷方便、节约成本，还可以避免核酸提取中各种有机溶剂的使用，更健康、更环保。
22.本发明一种用于动物组织直接pcr扩增的方法通过采用专门的微量动物组织取样器对动物组织能实现标准化取样，从而能减少组织加量大小不一对pcr扩增产生的不利影响。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
24.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
25.图1为本发明实施例1提供的取样器的结构示意图；
26.图2为本发明实施例1提供的小鼠肝、脾的850bp和1800bp扩增产物图；
27.图3为本发明实施例2提供的小鼠肝、脾的850bp和1800bp扩增产物图；
28.图中：手柄1，取样头2，连接部21，铲头22，半圆形铲刀221，弧形包裹板222。
具体实施方式
29.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.一种用于动物组织直接pcr扩增的方法包括如下步骤：
32.先使用如图1所示的取样器均匀取直径为1mm，厚度为1mm的小鼠肝脏组织加入pcr管中，再在pcr管中加入23μl酶预混液、1μl上游引物和1μl下游引物并充分混匀，然后将装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增，扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min，得到小鼠肝、脾的850bp和1800bp扩增产物如图2所示，其中图2中，1
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3为小鼠肝的850bp扩增产物；4
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6为小鼠肝的1800bp扩增产物；a
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c为小鼠脾的850bp扩增产物；d
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f为小鼠脾的1800bp扩增产物。
33.所述取样器包括手柄1和取样头2，所述取样头1可拆卸地安装在所述手柄2上，方便取样头1的更换；所述手柄1呈“t”型状，方便操作人员的拿去和拆卸取样头1；所述取样头2包括连接部21和铲头22，所述连接部21的一端与所述手柄1可拆卸地连接，另一端连接所述铲头22。所述铲头22包括半圆形铲刀221和弧形包裹板222，所述半圆形铲刀221的一端与所述连接部21连接，另一端两侧分别连接有所述弧形包裹板222；通过半圆形铲刀能更加快速便捷地对动物组织进行标准取样，弧形包裹板222能进一步对取到的动物组织起到一定的保护作用，防止滑落，进一步地，所述半圆形铲刀221的直径为1mm，能够提取到尺寸标准的动物组织。本发明的取样器设计精细，能对动物组织实现标准化取样，减少组织加量大小不一对pcr扩增产生的不利影响。
34.所述酶预混液包括tris
‑
hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。其中，所述tris
‑
hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l，ph值为9.0；所述dna聚合酶为hotstart taq酶，质量浓度为1％；所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合，其体积浓度为250μmol/l；所述镁离子为硫酸镁；所述镁离子的体积浓度为3.5mmol/l；所述单价阳离子为硫酸铵，其终体积浓度为20mmol/l；所述pcr增效剂为0.1％bsa、1％甜菜碱、5％海藻糖、5％甘油；所述裂解剂为2％吐温20、0.5％聚乙二醇十六烷基醚、0.2％十二烷基硫酸钠；其它为纯化水。
35.实施例2
36.一种用于动物组织直接pcr扩增的方法包括如下步骤：
37.先使用实施例1所示的取样器均匀取直径为1mm，厚度为1mm的小鼠肝脏组织加入pcr管中，再在pcr管中加入23μl酶预混液、1μl上游引物和1μl下游引物并充分混匀，然后将装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增，扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min，得到小鼠肝、脾的850bp和1800bp扩增产物如图3所示，其中图3中，1
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3为小鼠肝的850bp扩增
产物；4
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6为小鼠肝的1800bp扩增产物；a
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c为小鼠脾的850bp扩增产物；d
‑
f为小鼠脾的1800bp扩增产物。
38.所述酶预混液包括tris
‑
hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。其中，所述tris
‑
hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l，ph值为8.3；所述dna聚合酶为hotstart taq酶，质量浓度为1％；所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合，其体积浓度为250μmol/l；所述镁离子为硫酸镁；所述镁离子的体积浓度为3.5mmol/l；所述单价阳离子为硫酸铵，其终体积浓度为20mmol/l；所述pcr增效剂为0.1％bsa、1％甜菜碱、5％海藻糖、5％甘油；所述裂解剂为2％吐温20、0.5％聚乙二醇十六烷基醚、0.2％十二烷基硫酸钠；其它为纯化水。
39.实施例3
40.一种用于动物组织直接pcr扩增的方法包括如下步骤：
41.先使用实施例1所示的取样器均匀取直径为1mm，厚度为1mm的小鼠肝脏组织加入pcr管中，再在pcr管中加入23μl酶预混液、1μl上游引物和1μl下游引物并充分混匀，然后将装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增，扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min。
42.所述酶预混液包括tris
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hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。其中，所述tris
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hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l，ph值为8.7；所述dna聚合酶为pfu酶，质量浓度为0.5％；所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合，其体积浓度为200μmol/l；所述镁离子为氯化镁；所述镁离子的体积浓度为1.5mmol/l；所述单价阳离子为氯化钾，其终体积浓度为10mmol/l；所述pcr增效剂为0.01％bsa、0.01％去离子甲酰胺、0.05％海藻糖、0.05％单链结合蛋白；所述裂解剂为2％吐温80、2％曲拉通x
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100、1％月桂酰肌氨酸钠；其它为纯化水。
43.实施例4
44.一种用于动物组织直接pcr扩增的方法包括如下步骤：
45.先使用实施例1所示的取样器均匀取直径为1mm，厚度为1mm的小鼠肝脏组织加入pcr管中，再在pcr管中加入23μl酶预混液、1μl上游引物和1μl下游引物并充分混匀，然后将装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增，扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min。
46.所述酶预混液包括tris
‑
hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。其中，所述tris
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hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l，ph值为9.2；所述dna聚合酶为pfu酶，质量浓度为4％；所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合，其体积浓度为350μmol/l；所述镁离子为氯化镁；所述镁离子的体积浓度为4mmol/l；所述单价阳离子为氯化钾，其终体积浓度为50mmol/l；所述pcr增效剂为2％dmso、2％去离子甲酰胺、2％海藻糖、2％氯化四甲基铵；所述裂解剂为2％乙基苯基聚乙二醇、1％十二烷基硫酸锂；其它为纯化水。
47.实施例5
48.一种用于动物组织直接pcr扩增的方法包括如下步骤：
49.先使用实施例1所示的取样器均匀取直径为1mm，厚度为1mm的小鼠肝脏组织加入pcr管中，再在pcr管中加入23μl酶预混液、1μl上游引物和1μl下游引物并充分混匀，然后将
装有动物组织、酶预混液、上游引物和下游引物的pcr管放入pcr仪中进行扩增，扩增的程序为：预变性95℃10min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸1kb/min，循环数40，后延伸5min。
50.所述酶预混液包括tris
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hcl缓冲液、dna聚合酶、dntps、镁离子、单价阳离子、pcr增效剂、裂解剂、纯化水。其中，所述tris
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hcl缓冲液的体积浓度为20mmol/l，ph值为9.2；所述dna聚合酶为pfu酶，质量浓度为2％；所述dntps是datp、dctp、dgtp、dttp按1：1：1：1比例混合，其体积浓度为300μmol/l；所述镁离子为氯化镁；所述镁离子的体积浓度为2mmol/l；所述单价阳离子为氯化钾，其终体积浓度为30mmol/l；所述pcr增效剂为0.05％dmso；所述裂解剂为0.01％聚乙二醇十六烷基醚；其它为纯化水。
51.由图2和图3的结果可以看出，采用本发明的方法可以实现动物组织中基因组dna的直接扩增，且pcr扩增产物长度小于等于4kb，可以满足大部分实验需求。
52.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。