一种治疗骨肿瘤的细胞靶向多肽及其制备方法和用途

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种治疗骨肿瘤的细胞靶向多肽及其制备方法和用途。


背景技术：

2.恶性骨肿瘤是一种常见且难以治愈的肿瘤，仍然是临床上的一大难题。手术和化疗是骨肿瘤临床治疗的主要方法。手术可以延长骨肿瘤患者的生命周期，但手术边缘或小病灶可能导致肿瘤复发。化疗是骨肿瘤治疗中常用的术后辅助治疗手段。临床上使用的化疗药物通常采用全身给药的方法，缺乏靶向性，因此不能在骨肿瘤处达到有效的治疗浓度，导致化疗效果不佳。此外，化疗副作用严重，易产生耐药性。骨微环境为肿瘤细胞的募集、生存和发展提供了肥沃的土壤。骨微环境中的肿瘤细胞分泌细胞因子刺激破骨细胞的发生，成熟的破骨细胞吸收骨基质释放生长因子，促进肿瘤生长，在肿瘤细胞增殖和骨吸收之间形成恶性循环，骨微环境也为恶性骨肿瘤的临床化疗提供了“屏障”。这是因为骨髓基质细胞产生的基质细胞衍生因子
‑
1和白细胞介素
‑
6介导肿瘤细胞的归巢、生存和增殖，而整合素介导的粘附在这种保护性环境中隔离肿瘤细胞。这种“屏障”效应使得肿瘤靶向分子难以进一步靶向骨肿瘤细胞。光热治疗已经被认为是一种非常有前途的肿瘤治疗方法，聚多巴胺(pda)纳米粒子是一类光热转换效率高、生物相容性极好的纳米粒子，但其体内的非特异性分布限制了进一步的应用。阿霉素(dox)是常用的抗肿瘤药物，但其严重的毒副作用例如心脏毒性限制了其进一步应用。因此，开发出一种有效稳定的具有骨肿瘤细胞靶向作用且同时可以减少药物毒副作用的纳米载体是非常重要的。


技术实现要素：

3.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种治疗骨肿瘤的细胞靶向多肽及其制备方法和用途，用于解决现有技术中骨肿瘤细胞靶向药物存在的安全性和有效性不能兼顾的问题。
4.为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括以下技术方案获得的。
5.本发明第一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽具有如式ⅰ所示的结构：
6.dm
‑
x
‑
rn
‑
c
ꢀꢀꢀꢀ
式ⅰ，
7.式ⅰ中，m为天冬氨酸的数量，6≤m≤10；n为精氨酸的数量，6≤n≤10，所述x为能够被mmp识别并剪切的多肽片段。
8.根据上述所述的多肽，m为8，n为8。
9.根据上述所述的多肽，所述x的氨基酸序列选自以下中的任一种：
10.kcqgwigqpgck
ꢀꢀꢀ
seq id no.1，
11.cqgwigqpgc
ꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.2，
12.qgwigqpg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.3，
13.cqgwigqpgck
ꢀꢀꢀꢀ
seq id no.4，
14.kcqgwigqpg
ꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.5，
15.cqgwigqpg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.6，
16.gwigqpgck
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.7，
17.gwigqp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no.8。
18.本技术还公开了一种采用如上述所述的多肽修饰的复合粒子，所述复合粒子为采用如上述所述多肽修饰的聚多巴胺或聚多巴胺纳米复合粒子；所述聚多巴胺纳米复合粒子以金属有机框架为内核，以聚多巴胺为外层。
19.根据上述所述的复合粒子，所述聚多巴胺纳米复合粒子的尺寸为80～200nm。
20.根据上述所述的复合粒子，所述金属有机框架是聚多巴胺与mn
2+
和co
3+
通过配位键自组装形成的具有分子内空隙的杂化材料。
21.根据上述所述的复合粒子，所述多肽与所述聚多巴胺或聚多巴胺纳米复合粒子的摩尔比为 (5～100)：1。
22.根据上述所述的复合粒子，所述聚多巴胺纳米复合粒子的制备方法为：mn(coo)2·
4h2o、 k3[co(cn)6]和多巴胺盐酸盐在碱性和有溶剂存在的条件下发生反应。
[0023]
根据上述所述的复合粒子，所述溶剂为乙醇或乙醇水溶液。
[0024]
根据上述所述的复合粒子，mn(coo)2·
4h2o、k3[co(cn)6]和多巴胺盐酸盐的摩尔比为1: (1～3)：(1～3)。
[0025]
本发明还公开了一种如上述所述的复合粒子的制备方法，所述多肽与聚多巴胺或聚多巴胺纳米复合粒子混合。
[0026]
本技术还公开了如上述所述多肽、如上述所述的复合粒子用作骨肿瘤细胞靶向药物载体或在制备骨肿瘤治疗药物中的用途。
[0027]
本技术还公开了一种骨肿瘤细胞靶向药物的载体，所述载体包括如上述所述多肽和如上述所述的复合粒子中的一种或两种。由于复合粒子中含有的金属离子如mn
2+
，可以有效增强骨肿瘤的mri加权信号，由此，本技术中的聚多巴胺纳米复合粒子为骨肿瘤的mri造影剂，非常适合用于骨肿瘤的光热治疗或者或者光热
‑
化疗协同治疗中。
[0028]
本技术还公开了一种骨肿瘤细胞靶向的药物组合物，至少包括：
[0029]
治疗骨肿瘤的有效成分和载体，所述载体被包括如上述所述多肽和如上述所述的复合粒子中的一种或两种修饰。
[0030]
根据上述所述的药物组合物，所述治疗骨肿瘤的有效成分为阿霉素。
[0031]
本技术中所述骨肿瘤包括原发骨肿瘤和继发骨肿瘤。原发骨肿瘤包括：骨肉瘤、尤文肉瘤、纤维肉瘤等。继发骨肿瘤是在身体的其他部位生长的肿瘤转移到骨的肿瘤。包括：乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肾癌和膀胱癌等。
[0032]
与现有技术相比，本发明主要有以下有益效果：
[0033]
1.现有技术只能单独靶向骨或者肿瘤细胞，单独骨靶向会导致纳米粒子无法从骨上脱落下来，存在潜在的毒性。因骨髓基质细胞产生的基质细胞衍生因子
‑
1和白细胞介素
‑
6 介导肿瘤细胞的归巢、生存和增殖，而整合素介导的粘附在这种保护性环境中隔离肿瘤细胞。这种“屏障”效应使得单独肿瘤靶向分子难以进一步靶向骨肿瘤细胞，容易脱靶。本发明设计合成的骨肿瘤细胞靶向肽前端的寡聚天冬氨酸序列可以先靶向到骨肿瘤的骨破损界面，然后通过骨肿瘤分泌的基质金属蛋白酶mmp剪切中间x这一多肽片段，暴露出末端由
enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academicpress，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
[0044]
本技术中申请人提供一种分离的多肽并意外的发现这一多肽能够用于制备治疗骨肿瘤相关疾病的药物中，其可以增强药物的靶向作用，同时减少药物有效成分如阿霉素的使用量，从而减少阿霉素的毒副作用，其可以委托多肽合成公司通过化学合成制备与获得，所述多肽具有如式ⅰ所示的氨基酸序列的多肽，
[0045]
dm
‑
x
‑
rn
‑
c
ꢀꢀꢀꢀ
式ⅰ；
[0046]
式ⅰ中，所述m为天冬氨酸的数量，6≤m≤10；n为精氨酸的数量，6≤n≤10，所述x为能够被mmp识别并剪切的多肽片段。
[0047]
上述中，m和n值低于6时没有办法形成电子聚集，靶向能力缺失；大于10时，多肽链太长，会自组装折叠，不利于靶向作用的发挥，并且对于m和n均是8时的靶向效果最佳。
[0048]
另外，多肽中还要含有能够被mmp识别并剪切的氨基酸序列，符合上述所有条件的的多肽片段x的氨基酸序列如表1所示。
[0049]
表1
[0050]
seq id no.氨基酸序列1kcqgwigqpgck2cqgwigqpgc3qgwigqpg4cqgwigqpgck5kcqgwigqpg6cqgwigqpg7gwigqpgck8gwigqp
[0051]
本发明设计合成的多肽为一种骨肿瘤细胞靶向肽，其前端的寡聚天冬氨酸序列可以先靶向到骨肿瘤的骨破损界面，然后通过骨肿瘤分泌的mmp剪切中间x段，暴露出末端由寡聚精氨酸组成的细胞穿膜肽片段，从而由细胞穿膜肽提升光热纳米粒子进入骨肿瘤细胞能力，最终实现骨肿瘤细胞靶向。该多肽能成功穿过骨微环境为骨肿瘤细胞提供的“屏障”，实现高效的骨肿瘤细胞靶向效果。
[0052]
由于这一多肽具有上述特性，申请人将上述所述多肽作为骨肿瘤细胞靶向药物有效成分的载体。用于骨肿瘤的光热治疗或者化疗或者光热
‑
化疗协同治疗中，采用上述多肽修饰聚多巴胺或多肽修饰聚多巴胺纳米复合粒子，并将他们作为骨肿瘤细胞靶向药物有效成分的载体。
[0053]
所述聚多巴胺纳米复合粒子以金属有机框架为内核，以聚多巴胺为外层。所述聚多巴胺纳米复合粒子的尺寸为80～200nm。优选地，所述金属有机框架是聚多巴胺与mn
4+
和co
3+
通过配位键自组装形成的具有分子内空隙的杂化材料。
[0054]
本技术中公开了一种骨肿瘤细胞靶向药物组合物，至少包括：治疗骨肿瘤细胞的有效成分和药学上可接受的载体，所述载体被如上述所述多肽和如上述所述的复合粒子中的一种或两种修饰。更具体地，所述药物组合物可以为阿霉素等已知的各种治疗骨肿瘤的
有效成分。
[0055]
本技术中的所述聚多巴胺纳米复合粒子的制备方法：mn(coo)2·
4h2o、k3[co(cn)6]和多巴胺盐酸盐在碱性和有溶剂存在的条件下发生反应。所述溶剂可以根据实际需要进行选择，如可以为乙醇或乙醇水溶液。优选地，mn(coo)2·
4h2o、k3[co(cn)6]和多巴胺盐酸盐的摩尔比为1:(1～3)：(1～3)。
[0056]
为了进一步验证上述发现及效果，本技术中进行了下列实验和表征加以进一步释明。
[0057]
本技术下述实施例中具体使用多肽中，m和n均为8，这种多肽为：
[0058]
d8‑
kcqgwigqpgck
‑
r8‑
c，记为bttp。
[0059]
实施例1
[0060]
本实施例中聚多巴胺纳米复合粒子的制备方法如下：
[0061]
9.05mg mn(coo)2·
4h2o溶于10ml 75％的乙醇中，然后加入10mg盐酸多巴胺，待盐酸多巴胺完全溶解，使用1m的氨水调节ph＝8.5。混合溶液在30℃磁力搅拌30min后，加入 16.6mgk3[co(cn)6]和10ml75％乙醇，混合溶液在30℃磁力搅拌24h。将反应产物12000rpm 离心20min，并用去离子水重复离心洗涤三次，即可得到聚多巴胺纳米复合粒子。(记为m@p)
[0062]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向药物载体的制备方法如下：
[0063]
将多肽与上述合成的聚多巴胺纳米复合粒子以摩尔比20:1混合，在1m的氨水调节 ph＝8.5的水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到多肽修饰的聚多巴胺纳米复合粒子。(记为tm@p)
[0064]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向药物组合物的制备方法如下：
[0065]
将上述载体与0.1mg/ml的阿霉素二甲亚砜溶液混合，其中，聚多巴胺纳米粒子与阿霉素的摩尔比1:2000，在水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到装载化疗药物阿霉素的骨肿瘤细胞靶向肽
‑
聚多巴胺纳米复合粒子的复合物。(记为tm@p/dox)
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例中聚多巴胺纳米复合粒子的制备方法如下：
[0068]
18.1mg mn(coo)2·
4h2o溶于10ml75％的乙醇中，然后加入5mg盐酸多巴胺，待盐酸多巴胺完全溶解，使用1m的氨水调节ph＝8.5。混合溶液在30℃磁力搅拌30min后，加入 8.3mgk3[co(cn)6]和10ml75％乙醇，混合溶液在30℃磁力搅拌24h。将反应产物12000rpm 离心20min，并用去离子水重复离心洗涤三次，即可得到聚多巴胺纳米复合粒子。(记为m@p)
[0069]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向的复合粒子的制备方法如下：
[0070]
将骨肿瘤细胞靶向肽与聚多巴胺纳米复合粒子以摩尔比100:1混合，在1m的氨水调节 ph＝8.5的水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到多肽修饰的聚多巴胺纳米复合粒子。(记为tm@p)
[0071]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向药物组合物的制备方法如下：
[0072]
将上述载体与0.1mg/ml的阿霉素二甲亚砜溶液混合，其中，聚多巴胺纳米粒子与阿霉素的摩尔比1:10000，在水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到装载化疗药物阿霉素的骨肿瘤细胞靶向肽
‑
聚多巴胺纳米复合粒子的复合物。(记为tm@p/dox)
[0073]
实施例3
[0074]
本实施例中聚多巴胺的制备方法如下：
[0075]
40mg盐酸多巴胺溶于10ml75％的乙醇中，待盐酸多巴胺完全溶解，使用1m的氨水调节ph＝8.5。溶液在30℃磁力搅拌24h。将反应产物12000rpm离心20min，并用去离子水重复离心洗涤三次，即可得到聚多巴胺纳米复合粒子(记为pda)。
[0076]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向药物载体的制备方法如下：
[0077]
将骨肿瘤细胞靶向肽与聚多巴胺以摩尔比(20:1)混合，在1m的氨水调节ph＝8.5的水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到骨肿瘤细胞靶向肽修饰的聚多巴胺纳米复合粒子(记为tp)。
[0078]
本实施例中骨肿瘤细胞靶向药物组合物的制备方法如下：
[0079]
将上述载体与0.1mg/ml的阿霉素二甲亚砜溶液混合，其中，聚多巴胺纳米粒子与阿霉素的摩尔比1:2000，在水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到装载化疗药物阿霉素的骨肿瘤细胞靶向肽
‑
聚多巴胺纳米复合粒子的物(记为tp/dox)。
[0080]
本技术申请人为了验证上述记载的技术效果，对实施例1中实验材料进行了如下试验和表征。
[0081]
(一)透射电子显微镜(tem)观察反应得到的m@p和tm@p纳米粒子
[0082]
将1μg反应得到的m@p和tm@p分别加入1ml去离子水中分散，超声1h后，将1μl 该稀释液分别滴加到电镜铜网上，待溶液晾干后备用。使用透射电子显微镜(tem)观察反应得到的m@p和tm@p纳米粒子，具体如图1所示。由图1可以看出，m@p和tm@p尺寸均一，呈立方体型，具有明显的mof结构。
[0083]
(二)体外模拟试验，扫描电镜元素分布
[0084]
nm@p样品的制备方法如下：
[0085]
采用d8‑
kcpggwqqigck
‑
r8‑
c多肽作为对照实验，这一多肽结构不能被mmp识别，故其为骨靶向mmp不可剪切肽，记为btnp。将btnp与实施例1中合成的m@p纳米复合粒子以摩尔比20:1混合，在1m的氨水调节ph＝8.5的水溶液中搅拌24h后，12000rpm离心漂洗三次，得到多肽修饰的聚多巴胺纳米复合粒子。(记为nm@p)
[0086]
分别将100μl m@p，nm@p和tm@p的水溶液与羟磷灰石片一起孵育24h，其中水溶液的浓度均为100μg/ml。此后，通过使用sem观察样品的eds元素分析图像。为了表征 tm@p的骨亲和能力，本技术中采用高晶度的羟基磷灰石片(骨的主要无机成分)进行体外骨靶向实验。研究表明，侵蚀性骨表面主要由高晶度羟基磷灰石组成，而新生骨界面主要由无定型羟基磷灰石组成。因此，采用高晶度羟基磷灰石片能在体外较好的模仿骨肿瘤的骨侵蚀界面。分别将m@p，nm@p和tm@p与羟基磷灰石片共孵育24h后，使用eds
‑
mapping 表征它们与羟基磷灰石的结合能力，具体表征结果如图2所示。nm@p和tm@p组羟基磷灰石表面结合了大量的mn
2+
，显著高于未修饰的m@p组，这说明无论是btnp和bttp均具有骨靶向性。
[0087]
(三)小鼠实验，活体成像图
[0088]
将mda
‑
mb
‑
231细胞(在20μlpbs中2
×
105个细胞)接种到胫骨的腔髓中，以生成原位骨肿瘤模型。将产生骨肿瘤的小鼠分别静脉注射近红外荧光分子标记的m@p
‑
cy5.5(30.00 mg/kg)，tm@p
‑
cy5.5(30.00mg/kg)和nm@p
‑
cy5.5(30.00mg/kg)，并在24h后通过小动物活体(ivis)成像。然后处死小鼠，并从胫骨中分离出骨肿瘤。骨肿瘤和胫骨也通过ivis 成像。ivis表征结果如图3所示。图3中可以看出，nm@p
‑
cy5.5和tm@p
‑
cy5.5在胫骨肿瘤处都检测出荧光信号，而m@p
‑
cy5.5在胫骨肿瘤处无荧光信号。进一步将胫骨肿瘤解剖，分离肿
瘤和胫骨，tm@p
‑
cy5.5的荧光主要分布在骨肿瘤处，而nm@p
‑
cy5.5的荧光主要分布在胫骨处。实验结果证明了bttp的骨肿瘤细胞靶向性，而不能够被mmp识别进而剪切的btnp不具有骨肿瘤细胞靶向性。
[0089]
(四)小动物核磁共振成像图
[0090]
将(30.00mg/kg)的m@p，tm@p和nm@p分别尾静脉静脉注射到荷瘤小鼠体内。 mr图像是在装有avance ii硬件的bruker 7.0t磁体上进行的，该磁体配备有72mm正交发射/接收线圈，在注射前和注射后24h拍摄。7t mri的参数为：tr(重复时间)＝750.0ms, te(回声时间)＝12.6ms,回声＝1/1，fov＝6.91/3.12cm,切片厚度＝2mm，nex(平均数) ＝2mm,矩阵＝256
×
116。
[0091]
验证bttp的骨肿瘤靶向性，使用mri进行表征。mn
2+
具有mri t1模态造影功能。用 7.0t mr扫描仪对m@p、nm@p和tm@p组的荷骨肿瘤小鼠进行了t1模态mri检查。 t1加权mr分别于静脉注射m@p，nm@p和tm@p前、后24h图像。肿瘤相关胫骨的 t1加权信号变化分析表明(如图4)，nm@p在胫骨处观察到明显较亮的t1加权信号，而 tm@p则在肿瘤处观察到较亮的t1加权信号。注射m@p前后的肿瘤相关胫骨信号无明显变化。结果表明，可作tm@p为骨肿瘤的mri造影剂，注射tm@p的小鼠t1加权mri信号显著增强，表明bttp显著增强了纳米颗粒的骨肿瘤靶向性。
[0092]
基于上述机理及实验效果，本技术实施例3中的形成的tp由于采用了这种具有骨靶向和骨肿瘤靶向的多肽的修饰，其作为药物载体，也相应的具有很好的骨靶向及骨肿瘤靶向效果。
[0093]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
[0094]
[0095]
[0096]