一种用于释放被红细胞仿生材料捕获的肿瘤细胞的方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于释放被红细胞仿生材料捕获的肿瘤细胞的方法。


背景技术：

2.肿瘤局部或区域的复发和远处转移，对于肿瘤的早期诊断以及肿瘤治愈提出了严峻的考验。近些年分子生物学及临床研究显示，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)导致了肿瘤的侵袭和微转移过程的发生。ctcs是由原本的肿瘤细胞从原发肿瘤脱落，进入人体的血液系统所形成的，ctcs经过外周血的循环、扩散，最终转移到人体的其他组织和器官，进而形成与原发部位肿瘤相同类型的继发肿瘤，即造成了肿瘤和癌症的转移和复发。通过捕获外周血中的循环肿瘤细胞，分析外周血中循环肿瘤细胞数量随时间的变化，可以更早预测肿瘤预后，为癌症用药的治疗反应检测和放化疗疗效分析提供一个简便易行的方法和手段。
3.由于外周血中的ctcs含量很低，每毫升血液中仅有几个至几十个ctcs，而背景血细胞含量则达到了109量级，对ctcs分离富集检测产生了极大的干扰，因此好的ctcs分离富集要求其具有高灵敏度和高选择性，同时还应能够保持ctcs的活性。目前已经开发了众多ctcs分离富集方法，包括基于物理性质不同(尺寸、密度、介电泳等)的分离方法和表面修饰抗体的免疫亲和法。由于ctcs与白细胞的物理性质有一定的重叠，很难从分离的ctcs中有效地去除白细胞，这就造成了只基于一种物理性质的分离方法难以同时获得高效率和高纯度。基于表面修饰抗体的免疫亲和法可以特异性靶向ctcs上的抗原，虽然抗原
‑
抗体的结合具有高特异性，但由于常规材料对于无关细胞存在一定的非特异性吸附，会对实际分离的ctcs纯度造成不良影响。
4.为了尽量减少修饰抗体的材料对无关细胞的非特异性吸附，现有技术中有一类方法是设计基于红细胞的仿生材料，包括了纯红细胞、纳米材料修饰的红细胞、红细胞团簇以及平面红细胞仿生层等。这一类材料的共同点是红细胞作为循环肿瘤细胞的捕获界面，其界面处为红细胞的生物膜结构，利用亲疏水作用力在细胞膜的磷脂双分子层中插入dspe
‑
peg
‑
x(x代表fa或者biotin)类型的分子，再利用biotin
‑
sa的特异性结合方式修饰上可特异性靶向循环肿瘤细胞表面抗原的抗体分子(fa可直接靶向循环肿瘤细胞)。而生物膜结构对于其他无关细胞则具有优良的防非特异性吸附的能力，这样即可实现对循环肿瘤细胞的高纯度富集。
5.为了后续的培养分析，往往需要将富集到的高纯度循环肿瘤细胞进行释放。对于基于红细胞的这类仿生材料来说，已知的对其表面捕获的循环肿瘤细胞的释放方法是红细胞裂解液释放法。市面上的红细胞裂解液包含两类，一类是酶类裂解液，其中含有可以攻击特定红细胞表面抗原的酶，可造成红细胞变形，生物通道扩大膨胀裂解，或者引起红细胞的变性；另一类是氯化铵型裂解液，铵根离子不能透过细胞膜，而其他离子可以通过，这样就造成了细胞内外的离子浓度差异，即渗透压差，最终导致外部水分扩散至细胞内使红细胞
涨破。这两类红细胞裂解液都很难实现细胞膜双磷脂分子层的彻底瓦解，因而其基于亲疏水作用力而修饰的dspe
‑
peg
‑
x分子也难以被细胞膜释放，那么被红细胞裂解液作用后的变性红细胞与循环肿瘤细胞之间的结合力依然存在，也就很难实现循环肿瘤细胞的高效释放。另外红细胞裂解液不能达到100％准确的裂解红细胞，总会或多或少导致其他种类细胞的裂解。鉴于此，亟需探索一种高效且温和的用于红细胞系列捕获材料的循环肿瘤细胞释放方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种用于释放被红细胞仿生材料捕获的肿瘤细胞的方法。
7.本发明的核心技术的发现来源于对红细胞捕获循环肿瘤细胞的多次失败实验结果的总结。用于循环肿瘤细胞富集的红细胞的仿生材料的制备核心技术是，红细胞表面修饰特异性靶向循环肿瘤细胞的分子，这一修饰过程需要在红细胞膜表面修饰dspe
‑
peg
‑
x(x为fa、rgd或者biotin)类型的分子，修饰前后的红细胞形貌会发生明显变化，可作为dspe
‑
peg
‑
x类型分子修饰成功的证明。首先以dspe
‑
peg
‑
fa的修饰为例，图1对比了未修饰以及两种dspe
‑
peg
‑
fa表面修饰量的红细胞光学显微镜明场图以及sem图。从图1中可以明显看出，修饰了dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞形貌由原本的饼状变成了表面具有尖刺型突起的棘形红细胞，并且修饰量越大，棘形红细胞的形状更圆，说明dspe
‑
peg
‑
fa的不同修饰量可以改变红细胞形貌。类似的，用dspe
‑
peg
‑
fitc同样对红细胞进行修饰，图2为修饰后的棘形红细胞的荧光显微镜照片，由此也说明了红细胞的形貌改变与dspe
‑
peg
‑
fitc的修饰有关。
8.对于红细胞表面修饰特异性靶向循环肿瘤细胞的分子(以叶酸为例)后，将其与新鲜传代的含有dmem完全培养基的hela细胞进行混合，在37℃下孵育2h。结束后将混合细胞吹悬观察捕获效果，并没有观察到被修饰了叶酸的红细胞(原本为棘形红细胞的形貌)所捕获的hela细胞，反而修饰了叶酸的尖刺球形红细胞几乎全部变回了修饰叶酸之前的饼状红细胞，如图3(a)所示。
9.根据图1和图2的结果可知，红细胞表面修饰dspe
‑
peg
‑
x分子会导致其形貌由饼状变成尖刺球形，那么图3(a)实验过程中红细胞由尖刺球形变回了饼状的现象则预示着修饰分子dspe
‑
peg
‑
fa的脱落，初步猜测脱落现象可能与dmem完全培养基的存在关联。为了证实这一猜测，使用了pbs洗涤后不含dmem完全培养基的hela细胞与修饰了叶酸的尖刺球形红细胞进行相同的孵育操作，结果并没有观察到修饰了叶酸的尖刺球形红细胞变回修饰叶酸之前的饼状红细胞的现象，并且尖刺球形红细胞成功靶向了hela细胞，如图3(b)所示，由此初步证明了dmem完全培养基会导致dspe
‑
peg
‑
fa从尖刺球形红细胞表面脱落。为了得到更多的证据，直接向修饰了dspe
‑
peg
‑
fa的尖刺球形红细胞中加入dmem完全培养基，在37℃下孵育2h，最终棘形红细胞的形貌变回了饼状，如图3(c)所示，再次应证了dmem完全培养基会导致dspe
‑
peg
‑
fa从尖刺球形红细胞表面脱落。
10.类似的，将dspe
‑
peg
‑
fitc修饰得到尖刺球形红细胞也用dmem完全培养基进行孵育，棘形红细胞的形貌也变回了饼状红细胞，如图4(a)和4(b)所示。同时表面修饰了dspe
‑
peg
‑
fitc的绿色荧光红细胞也随着dspe
‑
peg
‑
fitc的脱落，变成了表面没有荧光的红细胞，同时分散液从无荧光变成了均匀的绿色荧光，如图4(c)所示。再用pbs洗涤红细胞三遍，去
除了含有脱落dspe
‑
peg
‑
fitc的dmem完全培养基，用荧光显微镜观察基本看不到变回饼状的红细胞表面的绿色荧光，如图4(d)所示。由此说明了dmem完全培养基可实现dspe
‑
peg
‑
fitc从红细胞膜中脱落的效果。
11.再类似的，将dspe
‑
peg
‑
biotin修饰得到的棘形红细胞用dmem完全培养基进行孵育，同样观察到了棘形红细胞的形貌也变回了饼状红细胞，如图5(a)和5(b)所示。由此说明了dmem完全培养基可实现dspe
‑
peg
‑
biotin从红细胞膜中脱落的效果。
12.综合以上实验现象，本发明证明了dmem完全培养基可实现dspe
‑
peg
‑
x(x为fa、fitc或者biotin)从红细胞膜中脱落的效果，由此可推测其他dspe
‑
peg
‑
x型的类似物(比如dspe
‑
peg
‑
rgd)都可以在dmem完全培养基的作用下实现释放。
13.基于红细胞所设计的仿生材料在捕获循环肿瘤细胞时，通常都需要通过对捕获界面处的红细胞膜上修饰dspe
‑
peg
‑
x(x代表fa、rgd或者biotin)类型的分子。如果修饰的是dspe
‑
peg
‑
biotin，则还需要利用biotin
‑
sa的特异性结合方式，以sa为桥梁分子，最终修饰上特异性靶向循环肿瘤细胞的抗体分子。那么基于红细胞的仿生材料在捕获循环肿瘤细胞时，界面红细胞对循环肿瘤细胞的捕获依靠的是二者之间连接的大量分子桥梁，这种分子桥梁的一端依靠dspe端与红细胞膜之间的疏水相互作用力嵌入红细胞膜，另一端则依靠特异性的分子或者抗体与肿瘤细胞表面的抗原形成特异性结合。既然dmem完全培养基可以实现dspe
‑
peg
‑
x型分子从红细胞膜中脱落，那么可以由此得到启发，dmem可以使捕获了循环肿瘤细胞的界面红细胞上dspe端从红细胞膜中脱落，从而实现对循环肿瘤细胞的释放效果，该猜想最终通过实施例中的实验得到了证实。
14.同时本发明还发现，细胞培养常用的完全培养基都能实现类似的效果，比如dmem高糖完全培养基、rpmi
‑
1640完全培养基、mccoy's 5a完全培养基、mem完全培养基都可以实现类似的效果，相应的实验结果见本发明实施例。
15.基于上述内容，本发明的目的通过下述技术方案实现：
16.一种用于释放被红细胞仿生材料捕获的肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：将捕获肿瘤细胞的红细胞仿生材料用培养基进行孵育，经过孵育肿瘤细胞从红细胞仿生材料上得到释放。所述的红细胞仿生材料为修饰了dspe
‑
peg
‑
x(x代表fa、rgd或biotin)的纯红细胞、纳米材料修饰的红细胞、红细胞团簇、平面红细胞仿生层等，如果修饰的是dspe
‑
peg
‑
biotin，则还需要利用biotin
‑
sa的特异性结合方式，以sa为桥梁分子，最终修饰上特异性靶向肿瘤细胞的抗体分子。
17.进一步地，所述的肿瘤细胞括但不限于hela细胞、mcf
‑
7细胞、skov3细胞、ht29细胞等。
18.进一步地，所述的培养基为完全培养基，包括但不限于dmem完全培养基、dmem高糖完全培养基、rpmi
‑
1640完全培养基、mccoy's 5a完全培养基、mem完全培养基等。
19.进一步地，所述的孵育的条件为37℃温度下孵育0.1min～2h。
20.更进一步地，所述的用于释放被红细胞仿生材料捕获的肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
21.(1)去除红细胞仿生材料捕获肿瘤细胞后的体系中的缓冲液。所述的缓冲液可以为pbs缓冲液。
22.(2)往捕获体系中加入培养基，将捕获体系完全浸没。
23.(3)将捕获体系置于37℃温度下孵育0.1min～2h，肿瘤细胞从红细胞仿生材料上得到释放，可将整个体系转移至培养箱中对释放的肿瘤细胞进行再培养。
24.本发明的有益效果在于：由于完全培养基可用于多种肿瘤细胞的培养，因此通过其作用而释放的肿瘤细胞无需对其进行换液处理，可直接在完全培养基的条件下进行培养。而传统的红细胞裂解液的释放方法则需要在释放后先去除红细胞裂解液，再加入培养基才能实现释放的肿瘤细胞再培养，因此本发明方法相对于传统方法来说具有明显的优势。
附图说明
25.图1是未修饰的红细胞与修饰不同量的dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞的明场图和sem图。其中，(a)是明场图，比例尺20微米；(b)是sem图，比例尺5微米。
26.图2是修饰了dspe
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peg
‑
fitc的毛刺球形红细胞的明场(a)以及荧光(b)图，比例尺：20微米。
27.图3是修饰叶酸的红细胞在不同情况下的明场图。其中，(a)是修饰叶酸的红细胞在dmem完全培养基环境下捕获hela细胞后的明场图；(b)是修饰叶酸的红细胞在pbs环境下捕获hela细胞后的明场图；(c)是修饰叶酸的红细胞在dmem完全培养基环境下孵育后的明场图，比例尺：20微米。
28.图4是dspe
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peg
‑
fitc修饰的红细胞不同情况下的状态图。其中，(a)是dspe
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peg
‑
fitc修饰的红细胞的荧光图；(b)是dmem完全培养基处理dspe
‑
peg
‑
fitc修饰的红细胞后的明场图；(c)是dmem完全培养基处理dspe
‑
peg
‑
fitc修饰的红细胞后的荧光图；(d)是dmem完全培养基处理dspe
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peg
‑
fitc修饰的红细胞后再用pbs洗涤后的荧光图，比例尺：20微米。
29.图5是dspe
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peg
‑
biotin修饰的红细胞不同情况下的明场图。其中，(a)是dspe
‑
peg
‑
biotin修饰的红细胞的明场图；(b)是dmem完全培养基处理dspe
‑
peg
‑
biotin修饰的红细胞后的明场图，比例尺：20微米。
30.图6是表面修饰有dspe
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peg
‑
fa的红细胞捕获的hela细胞用dmem完全培养基释放的结果图。其中，(a)是释放前的明场图；(b)是释放后的明场图，比例尺：20微米。
31.图7是表面修饰有dspe
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peg
‑
rgd的红细胞捕获的mcf
‑
7细胞用dmem高糖完全培养基释放的结果图。其中，(a)是释放前的明场图；(b)是释放后的明场图，比例尺：20微米。
32.图8是表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞捕获的mcf
‑
7细胞用rpmi
‑
1640完全培养基释放的结果图。其中，(a)是释放前的明场图；(b)是释放后的明场图，比例尺：20微米。
33.图9是表面修饰有聚凝胺和dspe
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peg
‑
fa的磁性红细胞团簇捕获的skov3细胞用mccoy's 5a完全培养基释放的结果图。其中，(a)是释放前的明场图；(b)是释放后的明场图，比例尺：10微米。
34.图10是表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
rgd的红细胞平面仿生层捕获的hela细胞用mem完全培养基释放的结果图。其中，(a)是释放前的明场图；(b)是释放后的明场图，比例尺：20微米。
具体实施方式
35.下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限
于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
36.图1中修饰不同量的dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞的制备为：往红细胞分散液(用percoll分离液分离全血获得纯红细胞，然后用pbs溶液将红细胞洗涤三遍，并用pbs溶液分散红细胞，得到红细胞分散液)中加入dspe
‑
peg
‑
fa，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸的红细胞。其中，制备表面修饰量较少的红细胞时，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
fa的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.02mg dspe
‑
peg
‑
fa；制备表面修饰量更大的红细胞时，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
fa的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.04mg dspe
‑
peg
‑
fa。
37.图2中修饰了dspe
‑
peg
‑
fitc的毛刺球形红细胞的制备为：往红细胞分散液中加入dspe
‑
peg
‑
fitc，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰fitc毛刺球形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
fitc的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.04mg dspe
‑
peg
‑
fitc。
38.图3中修饰了叶酸的红细胞的制备为：往红细胞分散液中加入dspe
‑
peg
‑
fa，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸的毛刺球形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
fa的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.02mg dspe
‑
peg
‑
fa。
39.图4中dspe
‑
peg
‑
fitc修饰的红细胞的制备同图2中的修饰了dspe
‑
peg
‑
fitc的毛刺球形红细胞。
40.图5中dspe
‑
peg
‑
biotin修饰的红细胞的制备为：往红细胞分散液中加入dspe
‑
peg
‑
biotin，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰biotin的棘形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
biotin的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.04mg dspe
‑
peg
‑
biotin。
41.【实施例1】对表面修饰有dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞捕获的hela细胞用dmem完全培养基释放
42.(1)捕获
43.该体系使用了表面修饰有dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞对hela细胞进行捕获，捕获体系总体体积为0.2ml。
44.表面修饰有dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞制备过程：往红细胞分散液中加入dspe
‑
peg
‑
fa，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸的毛刺球形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
fa的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.02mg dspe
‑
peg
‑
fa。
45.捕获hela细胞过程：定量取105个hela细胞并用pbs洗涤分散，向其中定量加入107个表面修饰有dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞，二者混合均匀后在离心机中1500rpm转速离心3min，然后在37℃下孵育1h，即可实现修饰有dspe
‑
peg
‑
fa的纯红细胞对hela细胞的捕获。
46.(2)释放
47.首先，在1500rpm离心速度下将整个体系的细胞进行离心，去除上清液。然后加入1ml的dmem完全培养基，轻轻将细胞吹悬。最后将整个体系置于37℃的环境中孵育2h。孵育过程中间歇性地对沉降了的细胞进行吹悬操作，以保证dmem完全培养基能够与捕获体系充分接触。
48.释放前的图片如图6(a)所示，释放后的图片如图6(b)所示，释放效率大约为95％。
49.【实施例2】对表面修饰有dspe
‑
peg
‑
rgd的红细胞捕获的mcf
‑
7细胞用dmem高糖完全培养基释放
50.(1)捕获
51.该体系使用了表面修饰有dspe
‑
peg
‑
rgd的红细胞对mcf
‑
7细胞进行捕获，捕获体
系总体体积为0.4ml。
52.表面修饰有dspe
‑
peg
‑
rgd的红细胞制备过程：往红细胞分散液中加入dspe
‑
peg
‑
rgd，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰dspe
‑
peg
‑
rgd的毛刺球形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
‑
peg
‑
rgd的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.02mg dspe
‑
peg
‑
rgd。
53.捕获hela细胞过程：定量取105个mcf
‑
7细胞并用pbs洗涤分散，向其中定量加入107个表面修饰有dspe
‑
peg
‑
rgd的红细胞，二者混合均匀后在离心机中1500rpm转速离心3min，然后在37℃下孵育1h，即可实现修饰有dspe
‑
peg
‑
rgd的纯红细胞对mcf
‑
7细胞的捕获。
54.(2)释放
55.首先，在1500rpm离心速度下将整个体系的细胞进行离心，去除上清液。然后加入1.2ml的dmem高糖完全培养基，轻轻将细胞吹悬。最后将整个体系置于37℃的环境中孵育2h。孵育过程中间歇性地对沉降了的细胞进行吹悬操作，以保证dmem高糖完全培养基能够与捕获体系充分接触。
56.释放前的图片如图7(a)所示，释放后的图片如图7(b)所示，释放效率大约为93％。
57.【实施例3】对表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞捕获的mcf
‑
7细胞用rpmi
‑
1640完全培养基释放
58.(1)捕获
59.该体系使用的表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞是通过电穿孔的方法将磁性纳米颗粒载入红细胞内部来制备的，红细胞表面还修饰有dspe
‑
peg
‑
biotin/sa/biotin
‑
antiepcam，捕获体系总体体积为0.3ml。
60.表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞制备过程：第一步，红细胞载入磁性纳米颗粒。向含有109个新鲜红细胞的500μl悬液中加入100μl 5mg/ml的20nm磁性四氧化三铁纳米颗粒悬液，二者混合均匀后分两次转移至2cm的电转杯中，通过电穿孔的方式将磁性纳米颗粒载入至红细胞内部。磁性分离去除非磁性的红细胞，并通过1000rpm低速离心的方式去除游离磁性纳米颗粒，从而获得纯的磁性红细胞。第二步，磁性红细胞修饰epcam抗体。定量取出1.5
×
108个红细胞，定量加入含有0.06mg分子量为2000的dspe
‑
peg
‑
biotin的pbs溶液，4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞；将biotin修饰的红细胞与200μl浓度为100μg/ml的sa溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰sa的红细胞；最后将sa修饰的红细胞与500μl浓度为5μg/ml的生物素化的epcam抗体溶液混合均匀，37℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰epcam抗体的磁性红细胞。
61.捕获mcf
‑
7细胞过程：定量取105个mcf
‑
7细胞并用pbs洗涤分散，向其中定量加入107个表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞，二者混合均匀后在离心机中1500rpm转速离心3min，然后在37℃下孵育1h，即可实现表面修饰有epcam抗体的磁性红细胞对mcf
‑
7细胞的捕获。
62.(2)释放
63.首先，在磁力架上用磁力分离的方式将磁性红细胞捕获的mcf
‑
7细胞分离洗涤。然后，去除上清液并加入1ml的rpmi
‑
1640完全培养基，轻轻将细胞吹悬。最后将整个体系置于37℃的环境中孵育2h。孵育过程中间歇性地对沉降了的细胞进行吹悬操作，以保证rpmi
‑
1640完全培养基能够与捕获体系充分接触。
64.释放前的图片如图8(a)所示，释放后的图片如图8(b)所示，释放效率大约为88％。
65.【实施例4】对表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇捕获的skov3细胞用mccoy's 5a完全培养基释放
66.(1)捕获
67.该体系使用的表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇是通过在表面修饰羧基的磁性微球表面吸附满层红细胞的方式制备的，所吸附的红细胞表面修饰了聚凝胺以及dspe
‑
peg
‑
fa，捕获体系总体体积为0.5ml。
68.表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇的制备：第一步，dspe
‑
peg
‑
fa修饰。根据红细胞分散液的红细胞含量，定量取出2
×
108个红细胞，定量加入含有0.08mg分子量为2000的dspe
‑
peg
‑
fa的pbs溶液，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即可获得dspe
‑
peg
‑
fa修饰的红细胞。第二步，聚凝胺修饰。将修饰上dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞与300μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与dspe
‑
peg
‑
fa的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。第三步，红细胞团簇的制备。将表面修饰羧基的磁性微球用pbs洗涤三遍，再加入100倍微球计数个数的修饰红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心1min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育30min，最后将离心管底部的混合物吹悬后，用磁力架对其进行磁性分离洗涤，将过量的游离红细胞洗涤去除，最后获得表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇。
69.捕获skov3细胞过程：定量取105个skov3细胞并用pbs洗涤分散，向其中定量加入107个表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇，二者混合均匀后在离心机中1500rpm转速离心3min，然后在37℃下孵育1h，即可实现表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
‑
fa的磁性红细胞团簇对skov3细胞的捕获。
70.(2)释放
71.首先，在磁力架上用磁力分离的方式将磁性红细胞团簇捕获的skov3细胞分离洗涤。然后，去除上清液并加入1.4ml的mccoy's 5a完全培养基，轻轻将细胞吹悬。最后将整个体系置于37℃的环境中孵育2h。孵育过程中间歇性地对沉降了的细胞进行吹悬操作，以保证mccoy's 5a完全培养基能够与捕获体系充分接触。
72.释放前的图片如图9(a)所示，释放后的图片如图9(b)所示，释放效率大约为85％。
73.【实施例5】对表面修饰有聚凝胺和dspe
‑
peg
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rgd的红细胞平面仿生层捕获的hela细胞用mem完全培养基释放
74.(1)捕获
75.该体系使用的表面修饰有聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞平面仿生层是通过在氨基载玻片(尺寸为1cm
×
3cm)表面紧密吸附一层红细胞的方式制备的，所吸附的红细胞表面修饰了聚凝胺以及dspe
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rgd。
76.表面修饰有聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞平面仿生层的制备过程：第一步，红细胞表面修饰dspe
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rgd。往红细胞分散液中加入dspe
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rgd，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰dspe
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rgd的毛刺球形红细胞。其中，原始红细胞与dspe
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rgd的用量比例关系为每5
×
107个红细胞加入0.02mg dspe
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rgd。第二步，聚凝胺修饰。将修饰上dspe
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rgd的红细胞与300μl的浓度为10mg/ml的聚凝胺pbs溶液混合，在4℃下静置孵育
30min，用pbs离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与dspe
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rgd的红细胞，将其分散至pbs溶液中备用。第三步，制备红细胞平面仿生层。将表面修饰了聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞悬液滴到氨基载玻片表面，在4℃下静置2h，用pbs淋洗氨基载玻片，去除未被吸附的红细胞，即可获得表面修饰有聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞平面仿生层。
77.捕获hela细胞的过程：定量取105个hela细胞并用pbs洗涤分散，将其滴至表面修饰有聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞平面仿生层上，在37℃下静置2h，即可实现表面修饰有聚凝胺和dspe
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rgd的红细胞平面仿生层对hela细胞的捕获。
78.(2)释放
79.首先，将整个捕获了hela细胞的红细胞平面仿生层用pbs淋洗，以去除少量未被捕获的hela细胞。然后将红细胞平面仿生层面朝上置于培养皿中，加入3ml的mem完全培养基使红细胞平面仿生层完全浸润于其中，并用封口膜将培养皿完全封口以防培养基漏出。最后将整个培养皿置于37℃恒温摇床中孵育2h，孵育过程保持20rpm的速度摇晃培养皿，以保证mem完全培养基能够充分释放捕获的hela细胞。
80.释放前的图片如图10(a)所示，释放后的图片如图10(b)所示，释放效率大约为88％。
81.上述所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。