一种蛋白药物在常温、高温条件下保存的方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种蛋白药物在常温、高温条件下保存的方法。

背景技术：

蛋白质作为生命的物质基础，与生物体生命活动关系密切，在人们的日常生活中得到广泛的应用。然而，大多数蛋白质，特别是嗜常温蛋白(mesophilicproteins)，仅能在低温或常温条件下保持其结构，发挥正常的功能活性。在这些蛋白的适用温度范围外，例如高温，容易导致蛋白聚集或变性，从而限制了蛋白的功能范围。

目前，提高蛋白热稳定性的方法非常有限，主要通过对比嗜常温蛋白与嗜热蛋白(thermophilicproteins)氨基酸序列，对单个或多个氨基酸进行突变或者利用化学修饰的方法对氨基酸进行共价改造等来改善蛋白质的热稳定性。这些方法普遍对蛋白的一级结构进行改变，而蛋白的一级结构是决定其生物学功能的，即这些方法或多或少会对蛋白质的功能产生影响。同时，由于这些方法对氨基酸序列的改造是有针对性的，即对不同的蛋白需要针对性的选择不同的氨基酸进行改造，这就有可能导致有些蛋白质无法通过基因工程或化学修饰的方法实现其热稳定性的提高。因此，目前改善蛋白质的热稳定性的技术仍缺乏普适性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种普适性的常温或高温保存的蛋白质的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供两亲性聚合物在制备耐高温蛋白质中的应用，所述两亲性聚合物由亲水性高分子材料和疏水性高分子材料聚合而成。

进一步地，所述亲水性高分子材料包括聚乙二醇、聚氧乙烯、mpeg-nh2-400、mpeg-nh2-600、mpeg-nh2-800、mpeg-nh2-1000、mpeg-nh2-2000、mpeg-nh2-4000、mpeg-nh2-5000或mpeg-nh2-10000中的至少一种。

进一步地，所述疏水性高分子材料包括聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)、聚(马来酸酐-十二碳烯)、聚(马来酸酐-十四碳烯)或聚(马来酸酐-十六碳烯)中的至少一种。

进一步地，所述亲水性高分子材料与疏水性高分子材料的嫁接摩尔比为(1:10)～(2:1)；更优选为(1:10)～(1:1)。

根据本发明第一个方面所述的应用，更具体地，所述两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤：

s01.将疏水性高分子材料溶解于有机溶剂中，加入亲水性高分子材料混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，得混合物a；

s02.将混合物a用水复溶，纯化后收集产物，即得两亲性聚合物。

根据本发明第一个方面所述的制备方法，优选地，步骤s01中有机溶剂二氯甲烷。

优选地，步骤s01中混合反应还加入催化剂。

更优选地，所述催化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，edc)和三乙胺中的至少一种。

优选地，步骤s01中混合反应在磁力搅拌器上进行。

更优选地，磁力搅拌的转速约为800rpm，反应时间约为24h。

根据本发明第一个方面所述的制备方法，优选地，步骤s02中所述纯化采用透析袋透析的方法。

更优选地，所述透析袋截留分子量为14000da。

进一步地，所述两亲性聚合物可以通过冻干制成固体制剂。

优选地，所述冻干的时间约为24h。

本发明的第二个方面，提供一种耐高温蛋白质，由蛋白质与本发明第一个方面所述的两亲性聚合物混合而成。

根据本发明第二个方面所述的耐高温蛋白质，优选地，所述蛋白质包括酶、抗体、蛋白疫苗或蛋白药物。

更优选地，所述蛋白质包括牛血清白蛋白、转铁蛋白、肌红蛋白或胰岛素中的至少一种。

本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述耐高温蛋白质的制备方法，包括以下步骤：

s11.将蛋白质溶于缓冲溶液中得到蛋白质溶液，将两亲性聚合物和助溶剂溶于水中得到两亲性聚合物混悬液；

s12.蛋白质溶液与两亲性聚合物混悬液混合，搅拌至澄清，得混合液b；

s13.将混合液b纯化后收集产物，即得所述耐高温蛋白质。

根据本发明第三个方面所述的制备方法，优选地，步骤s11中所述缓冲溶液包括pbs缓冲液，hepes缓冲液，hepps缓冲液。

根据本发明第三个方面所述的制备方法，优选地，步骤s11中蛋白质溶液中蛋白质的浓度约为1mg/ml。

优选地，步骤s11中助溶剂为二甲基亚砜(dmso)。

根据本发明第三个方面所述的制备方法，优选地，步骤s12中所述两亲性聚合物混悬液与蛋白质溶液的质量比为(10：1)～(1：10)。

更优选地，所述两亲性聚合物混悬液与蛋白质溶液的质量比为2:1。

优选地，步骤s12中搅拌为在磁力搅拌器上搅拌。

更优选地，所述磁力搅拌的转速约为400rpm，搅拌时间约为2h。

根据本发明第三个方面所述的制备方法，优选地，步骤s13中纯化的方法为采用透析袋透析的方法。

更优选地，所述透析袋截留分子量为14000～100000da。

更具体地，所述透析袋截留分子量为100000da、30000da和14000da。

高分子聚合物在水相中能够形成胶束，形成胶束的过程中能够包裹蛋白，高分子间具有各种离子键和氢键，这些非共价键作用在包裹蛋白的时候与蛋白上的位点结合，从而起到稳定蛋白质的作用。

本发明的第四个方面，提供一种提高蛋白质热稳定性的方法，将蛋白质与本发明第一个方面所述的两亲性聚合物混合制成蛋白-两亲性聚合物混合物。

优选地，所述蛋白质包括酶、抗体、蛋白疫苗或蛋白药物。

更优选地，所述蛋白质包括牛血清白蛋白、转铁蛋白、肌红蛋白或胰岛素中的至少一种。

发明内容中所述的“约”均代表本数及上下误差在20％，例如“约为800rpm”即为800±160rpm。

本发明的有益效果是：

本发明开发了一种普适的提高蛋白热稳定性的方法，本发明设计了一种能与蛋白通过疏水相互作用结合的两亲性聚合物(amphiphilicpolymer)，使蛋白能够耐受高温，甚至是100℃水溶液的高温，同时能在常温条件下长时间存放蛋白质，无需冷藏。

本发明提供的提高蛋白热稳定性的方法，操作简单，参数可控，重现性良好。相比于对蛋白氨基酸序列进行化学修饰，反应在水环境中进行，条件温和，对初始蛋白的结构影响小。

与现有技术相比，该方法没有涉及对蛋白一级结构进行改造，因此最大程度上保留蛋白原始活性。同时，该方法对蛋白没有具体要求，基于蛋白普遍表面具有亲疏水性位点，两亲性聚合物可与大多数蛋白通过疏水作用力进行结合，从而产生高温保护作用。因此，该方法适用于大多数蛋白质，具备实际应用价值。

本发明提供的提高蛋白热稳定性的方法，操作简单，参数可控，重现性良好。相比于对蛋白氨基酸序列进行化学修饰，反应在水环境中进行，条件温和，对初始蛋白的结构影响小。与现有技术相比，该方法没有涉及对蛋白一级结构进行改造，因此最大程度上保留蛋白原始活性。同时，该方法对蛋白没有具体要求，基于蛋白普遍表面具有亲疏水性位点，两亲性聚合物可与大多数蛋白通过疏水作用力进行结合，从而产生高温保护作用。因此，该方法适用于大多数蛋白质，具备实际应用价值，可以广泛应用在蛋白质，rna药物，dna药物等大分子药物的常温，高温条件下的保存。

附图说明

图1不同比例peg嫁接的两亲高分子聚合物表征结果。a：傅立叶变换红外吸收光谱图；b：不同嫁接比例的两亲性聚合物的核磁表征。其中1.1-1.3ppm：c18链的ch2；3.8-3.5ppm：peg的ch2。

图2水相中两亲性聚合物自组装成胶束的粒径大小。

图3水相中两亲性聚合物自组装成胶束的电势。

图4高热稳定的转铁蛋白的耐高温能力。

图5高热稳定的肌红蛋白的耐高温能力。

图6高热稳定的胰岛素的耐高温能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。

聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)，poly(maleicanhydride-alt-1-octadecene)，pmhc18，分子量10～100kda。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，edc)。

具体实施方式中所述的“约”均代表本数及上下误差在20％，例如“约为800rpm”即为800±160rpm。

实施例1两亲性聚合物的制备

按照以下步骤制备两亲性聚合物：

s01.将疏水性高分子材料溶解于有机溶剂中，加入亲水性高分子材料混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，得混合物a；

s02.将混合物a用水复溶，纯化后收集产物即得。

s03.收集透析后产物，-80℃冷冻过夜，随后在冻干机上冻干，即得到白色絮状物质。

亲水性高分子材料包括聚乙二醇、聚氧乙烯、mpeg-nh2-400、mpeg-nh2-600、mpeg-nh2-800、mpeg-nh2-1000、mpeg-nh2-2000、mpeg-nh2-4000、mpeg-nh2-5000或mpeg-nh2-10000中的至少一种；本实施例中选用聚乙二醇。

疏水性高分子材料优选包括聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)、聚(马来酸酐-十二碳烯)、聚(马来酸酐-十四碳烯)或聚(马来酸酐-十六碳烯)中的至少一种；本实施例中选用聚(马来酸酐-十八碳烯)。

有机溶剂一般选用二氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、乙醇，本实施例中选用二氯甲烷。

亲水性高分子材料与疏水性高分子材料的嫁接比例pmmn为(1:10)～(2:1)，分别制备得到p1m10、p1m5、p2m1、p1m1、p2m1五种不同嫁接比例的两亲性高分子聚合物。

检测所制备的两亲性高分子聚合物的试剂peg化程度，结果如下表1所示。

表1两亲性聚合物的试剂peg化程度

图1为不同比例peg嫁接的两亲性聚合物的表征结果，图1中a的虚线框中的部分为两亲性聚合物的特征峰，从图中可以看出反应后有peg的特征峰，说明两亲聚合物顺利接上了peg。

表征所制备的两亲高分子，核磁表征结果如附图1中b所示；其中1.1-1.3ppm：c18链的ch2；3.8-3.5ppm：peg的ch2。结果说明该高分子在水相中具有优异的蛋白药物包裹效率，并且在生理环境下能够缓慢释放出蛋白药物，从而使蛋白药物发挥持续的作用。

实施例2两亲性聚合物的制备以及自组装情况检测

按照以下步骤制备两亲性聚合物

s01.将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)溶解于有机溶剂中，按比例加mpeg-nh2混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，得混合物a；

s02.将混合物a用水复溶，装入透析袋在纯水中进行透析；

s03.收集透析后产物，-80℃冷冻过夜，随后在冻干机上冻干，即得到白色絮状物质。

有机溶剂一般选用二氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、乙醇，本实施例中选用二氯甲烷。

mpeg-nh2与聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)的嫁接比例pmmn为(1:10)～(2:1)，分别制备得到p1m10、p1m5、p2m1、p1m1、p2m1五种不同嫁接比例的两亲性聚合物。

通过dls方法检测不同嫁接比例的两亲性聚合物的自主装胶束的粒径。

将聚合物溶解在纯水中，随后，将这些两亲性聚合物溶液进行超声处理15分钟，使其分散均匀。dls测量是在马尔文纳米粒子粒度仪(nanoszetasizernano系列仪器)上进行的。仪器的测试温度设置为25℃，溶剂选择水，参照物选择聚合物。在每次测试之前，平衡时间为120秒。每个样品重复测试6次，取平均值作为最终测量结果。

图2为不同嫁接比例的两亲性聚合物在水相中自组装成胶束的粒径大小，可以看出，这些两亲性聚合物可在水中自组装形成纳米胶束，且在嫁接比例p1m10～p2m1的范围内，所述两亲性聚合物自组装成纳米胶束的粒径在20～150nm之间。

通过zeta方法检测同嫁接比例的两亲性聚合物的自主装胶束的电势，结果见图2。

从图3中可以看，随着与聚合物共价的peg密度的增加，这些纳米颗粒显示出逐渐降低的zeta电势，产生这一现象的原因可能是聚合物上的羧基数目逐渐减少导致的电负性减小，或是随peg链密度增加而产生的屏蔽效应，说明peg化的聚合物能够自组装成胶束，且降低制剂的电荷，适合应用于生物体内。

实施例3耐高温转铁蛋白的制备

(1)将mpeg-nh2和聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)加入二氯甲烷中，并且加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺。在反应容器中按比例投料进行反应，磁力搅拌器上搅拌，转速约800rpm，反应约24h，得到的反应产物进行纯化、冻干，制备得到如实施例2中所述的p1m5的两亲性聚合物。

(2)将转铁蛋白溶于水中，得到转铁蛋白水溶液；将步骤(1)所述两亲性聚合物和助溶剂(dmso)溶于水中，得到两亲性聚合物混悬液。

(3)将步骤(2)所述的两亲性聚合物混悬液按照质量比2:1逐滴滴加入转铁蛋白水溶液中，在磁力搅拌器上搅拌至澄清，搅拌转速约400rpm，搅拌约2h。

(4)将步骤(3)得到的蛋白-聚合物混合溶液进行透析纯化，选择对应截留分子量的透析袋，除去未与聚合物结合的蛋白，得到所述的高热稳定的转铁蛋白。

通过光谱法检测所制备的高热稳定的转铁蛋白的耐高温能力。

结果见附图4，从图中可以看出两亲性聚合物保护的转铁蛋白二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护转铁蛋白的二级结构不受破坏。

实施例4耐高温肌红蛋白的制备

(1)将mpeg-nh2和聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)加入二氯甲烷中，并且加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺。在反应容器中按比例投料进行反应，磁力搅拌器上搅拌，转速约800rpm，反应约24h，得到的反应产物进行纯化、冻干，制备得到如实施例2中所述的p1m5的两亲性聚合物。

(2)将肌红蛋白溶于水中，得到肌红蛋白水溶液；将步骤(1)所述两亲性聚合物和助溶剂(dmso)溶于水中，得到两亲性聚合物混悬液。

(3)将步骤(2)所述的两亲性聚合物混悬液按照质量比2:1逐滴滴加入肌红蛋白水溶液中，在磁力搅拌器上搅拌至澄清，搅拌转速约400rpm，搅拌约2h。

(4)将步骤(3)得到的蛋白-聚合物混合溶液进行透析纯化，选择对应截留分子量的透析袋，除去未与聚合物结合的蛋白，得到所述的高热稳定的肌红蛋白。

通过圆二色谱方法检测所制备的高热稳定的肌红蛋白的耐高温能力。

结果见附图5，从图中可以看出两亲性聚合物保护的肌红蛋白二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护肌红蛋白的二级结构不受破坏。

实施例5耐高温胰岛素的制备

(1)将mpeg-nh2和聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)加入二氯甲烷中，并且加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺。在反应容器中按比例投料进行反应，磁力搅拌器上搅拌，转速约800rpm，反应约24h，得到的反应产物进行纯化、冻干，制备得到如实施例2中所述的p1m5的两亲性聚合物。

(2)将胰岛素溶于水中，得到胰岛素水溶液；将步骤(1)所述两亲性聚合物和助溶剂(dmso)溶于水中，得到两亲性聚合物混悬液。

(3)将步骤(2)所述的两亲性聚合物混悬液按照质量比2:1逐滴滴加入胰岛素水溶液中，在磁力搅拌器上搅拌至澄清，搅拌转速约400rpm，搅拌约2h。

(4)将步骤(3)得到的蛋白-聚合物混合溶液进行透析纯化，选择对应截留分子量的透析袋，除去未与聚合物结合的蛋白，得到所述的高热稳定的胰岛素。

通过圆二色谱方法检测所制备的高热稳定的胰岛素的耐高温能力。

结果见附图6，从图中可以看出两亲性聚合物保护的胰岛素二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护胰岛素的二级结构不受破坏。

上述结果说明实施例1或2中提供的聚合物具有很好的蛋白质包裹效率，该聚合物保护的蛋白的二级结构不会发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护蛋白的二级结构不受破坏；同时可以在常温，甚至高温条件下保存。因此该聚合物是一种具有普适性的包裹蛋白质的聚合物，可以用于制备各种类型的蛋白质固体制剂，包括但不限于蛋白药物、蛋白类疫苗、酶、激素和细胞因子。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。