一株具有防龋齿病的植物乳杆菌LP220及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一株具有防龋齿病的植物乳杆菌lp220及应用。
背景技术：
：龋病是由细菌引起的慢性感染性疾病，是一个连续矿化和脱矿化交替变化的过程。牙齿表面的牙菌斑是龋病发生的重要原因，它是一种典型的生物膜，是由细菌分泌的物质和细菌之间相互作用而形成的。变异链球菌(streptococcusmutans)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是公认的人类口腔中最主要的致龋细菌(haowang等人,ambexpress,2017,7(1):204-213.)，它能高效利用蔗糖代谢产生乳酸，破坏牙体组织；并且具有很强的粘附能力和产多糖能力，会促进牙齿表面致龋性生物膜的进一步形成和发展。2017年发布的第四次全国口腔健康流行病学调查也显示，我国12岁儿童恒牙龋患率为34.5％，比十年前上升了7.8个百分点。5岁儿童乳牙龋患率为70.9％，比十年前上升了5.8个百分点，儿童患龋情况已呈现上升态势。此外，中年人龋齿患病率为88.1％，老年人龋齿患病率为98.4％，龋齿总体状况不容乐观。现阶段防治龋病的主要方法有糖化替品的使用、含氟牙膏使用、正确的刷牙方法和频率、定期口腔保健等。但糖替代品的使用要求具有较强的识别观念、含氟牙膏摄入过量时会导致氟斑牙，机械去除牙菌斑的方法需考虑到个体的接受性，定期口腔保健及风险评估对个人健康意识和经济条件要求较高，因此寻求一种简单有效的龋病防治方法对口腔健康具有十分重要的意义。近年来，许多研究结果表明益生菌能通过抑制致病菌定植、调节黏膜免疫等机制对龋齿、牙周病、口臭等口腔疾病的治疗发挥作用。乳酸菌作为一种益生菌，被世界卫生组织(who)、美国食品药品监督管理局(fda)和国际益生菌和益生元科学协会(isapp)认定是对人体有利的微生物，被广泛应用于食品、医药、饲料等行业。植物乳杆菌作为乳酸菌的一种，被广泛应用于食品发酵、保健食品、活体药物等行业。其中植物乳杆菌对调理肠道菌群、增强免疫力等方面研究较多，但植物乳杆菌对变异链球菌与金黄色葡萄球菌共同形成的生物膜的抑制作用和口腔的益生特性研究较少。技术实现要素：本发明的目的之一在于，提供一株具有防龋齿病的植物乳杆菌lp220，其能改善口腔微生态环境，减少口腔致龋，防治龋齿。本发明的目的之二在于，提供该植物乳杆菌lp220的应用。本发明的目的之三在于，提供一种包含该植物乳杆菌lp220的组合物。本发明采用的技术方案如下：本发明所述的一株植物乳杆菌lp220，其于2018年07月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018465。本发明的植物乳杆菌lp220是从天津农家玉米秆中分离纯化得到。植物乳杆菌lp220在bmrs琼脂培养基上菌落呈圆形、菌落大小中等、乳白色、向上凸起、菌落边缘较为整齐。革兰氏染色后显微镜下呈阳性，扫描电镜下呈杆状。将分离得到的乳酸菌送至中国典型培养物保藏中心进行16srrna鉴定，通过采用细菌通用引物27f和1492r对其16srdna进行扩增，将扩增后的16srrna序列输入ncbi数据库进行比对，与genebank中的标准菌株lactobacillusplantarumsubsp.plantarumatcc14917相似率达100％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。植物乳杆菌lp220的16srna鉴定序列如seqid.1所示。本发明所述的植物乳杆菌lp220在制备抗龋病的药物中的应用。本发明所述的植物乳杆菌lp220在制备抗龋病的功能性食品中的应用。本发明的部分技术方案中，所述药物包括具有抑菌作用的药物。所述功能性食品包括具有抑菌作用的功能性食品。本发明的植物乳杆菌lp220，对变异链球菌cgmcc1.2499的抑菌圈直径为(16.32±0.55)mm，对金黄色葡萄球菌cmcc26003的抑菌圈直径为(16.50±0.55)mm，高于阳性对照复方氯己定含漱液。本发明的部分技术方案中，所述药物包括对羟基磷灰石有抑制作用的药物。所述功能性食品包括对羟基磷灰石有抑制作用的功能性食品。本发明所述植物乳杆菌lp220，对羟基磷灰石具有较好的抑制效果，抑制率为80.5％。本发明的部分技术方案中，所述药物包括抑制细菌胞外多糖的药物。所述功能性食品包括抑制细菌胞外多糖的功能性食品。本发明所述植物乳杆菌lp220，6小时介导时，胞外多糖的减少量可达50.6％，效果非常显著。本发明的部分技术方案中，所述药物包括能抑制病原微生物生物膜形成的药物。所述功能性食品包括能抑制病原微生物生物膜形成的功能性食品。本发明植物乳杆菌lp220与变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003混合培养后，视野中致病菌大量减少，生物膜中细菌多为杆菌，同时结构变得比较疏松，胞外多糖含量明显减少，抑制了双菌生物膜的形成，从而防治龋病的形成。本发明所述植物乳杆菌lp220菌株生长迅速、菌体量大，吸光度值od600在10h达到7.80，在18h可最高达到9.34。本发明所述植物乳杆菌lp220对溶菌酶的最高耐受浓度为2mg/ml，对酸、盐也具有较好的耐受性，易于在口腔中定植。本发明所述植物乳杆菌lp220，通过自聚及共聚能力试验表明，该菌株具有很强的自聚集能力在6h达到15.05％，同时与变异链球菌cgmcc1.2499、金黄色葡萄球菌cmcc26003的共聚能力在6h达到43.3％。本发明所述的一种药物组合物，包括植物乳杆菌lp220以及药学上可接受的载体。本发明中所述的“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的植物乳杆菌lp220在bmrs琼脂培养基上生长良好，可以抑制变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003菌体生长、耐受2mg/ml的溶菌酶、具有很好的自聚及共聚能力，对羟基磷灰石降解、胞外多糖生物膜、变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003双菌形成生物膜具有抑制作用，同时对酸、盐也具有较好的耐受性，易于在口腔中定植，具有商业化前景。本发明提供的植物乳杆菌lp220具有改善口腔微生态环境，减少口腔致龋，防治龋齿的功效。附图说明图1为植物乳杆菌lp220在bmrs琼脂培养基上的菌落形态图；图2为植物乳杆菌lp220革兰氏染色后光学显微镜形态图(10*1000倍)；图3为植物乳杆菌lp220扫描电镜图；图4a为植物乳杆菌lp220对变异链球菌cgmcc1.2499抑菌圈图；图4b为植物乳杆菌lp220对金黄色葡萄球菌cmcc26003抑菌圈图；图5为植物乳杆菌lp220菌株生长曲线图；图6为植物乳杆菌lp220对不同浓度的溶菌酶的耐受能力考察结果图；图7为植物乳杆菌lp220自聚与共聚能力考察结果图；图8为植物乳杆菌lp220对双菌生物膜产胞外多糖量影响考察结果图；图9为植物乳杆菌lp220抑制变异链球菌与金黄色葡萄球菌双菌生物膜形成的扫描电镜图；其中a、b为变异链球菌cgmcc1.2499与金黄色葡萄球菌cmcc26003共同培养形成的膜(a为1000×，b为5000×)，c、d为植物乳杆菌lp220与变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003共同培养形成的膜(c为1000×，d为5000×)。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明实施例中所所涉及的培养基组成为：bmrs培养基(植物乳杆菌lp220)：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉5.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温801.0g/l，k2hpo4·7h2o2.0g/l，无水乙酸钠3.02g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，mnso4·h2o0.038g/l，(加琼脂粉20g/l为固体培养基)。bhi固体培养基(变异链球菌)：胰蛋白胨10.0g/l，牛心沁粉17.5g/l，氯化钠5g/l，磷酸氢二钠(12h2o)2.5g/l，葡萄糖2g/l，调节ph至7.2±0.2，(加琼脂粉20g/l为固体培养基)。lb培养基(金黄色葡萄球菌)：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，调节ph至7.2±0.2，(加琼脂粉20g/l为固体培养基)。实施例1植物乳杆菌lp220的分离、筛选及分子生物学鉴定1.样品采集样品采集于天津农家玉米秆。2.菌种分离将采集的样品剪碎后称取1g，放入9ml无菌生理盐水中。充分震荡混匀后，10倍梯度稀释涂布于bmrs固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，划线纯化4次以上。通过革兰氏染色和溶钙法初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株用45％甘油保存于-80℃冰箱备用。3.菌株分子生物学鉴定：将分离得到的乳酸菌送至中国典型培养物保藏中心进行16srrna鉴定，通过采用细菌通用引物27f和1492r对其16srdna进行扩增，将扩增后的16srrna序列输入ncbi数据库进行比对，与genebank中的标准菌株lactobacillusplantarumsubsp.plantarumatcc14917相似率达100％，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，该菌株的基因序列如seqidno:1所示，命名为植物乳杆菌lp220(lactobacillusplantarumlp220)。将植物乳杆菌lp220划线于bmrs琼脂培养基上，37℃倒置培养48h后，对菌株的菌落形态进行观察，结果如图1所示，所述菌株在bmrs琼脂培养基上生长良好，菌落呈圆形、菌落大小中等、乳白色、向上凸起、菌落边缘较为整齐。革兰氏染色后呈阳性，显微镜下形态见图2，透射式电镜下形态图见图3。4.植物乳杆菌lp220对变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003的生长抑制实验：在无菌平板中倾倒10ml的水琼脂培养基，待冷却凝固后放上牛津杯，将指示菌菌悬液(变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003)分别加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中，使指示菌浓度为106cfu/ml，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，待其凝固后，用镊子取出牛津杯，即形成孔洞，向每个孔中加入200μl的植物乳杆菌lp220样品，扩散30min，37℃培养24h，同时向孔中加入200μl稀释5倍的复方氯己定含漱液作为对照(江苏晨牌邦德药业有限公司)，扩散30min，37℃培养24h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径，记录抑菌圈直径，最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。如图4a所示，植物乳杆菌lp220对变异链球菌cgmcc1.2499的抑菌圈直径为(16.32±0.55)mm；如图4b所示，对金黄色葡萄球菌cmcc26003的抑菌圈直径为(16.50±0.55)mm，高于阳性对照复方氯己定含漱液。表明对变异链球菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效果。实施例2本实施例公开了植物乳杆菌lp220生长能力测试实验。将植物乳杆菌lp220菌种按5％的接种量接种到bmrs液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次；将活化好的lp220菌液按5％的接种量接种到bmrs液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×18cm试管)。并将分装好的lp220菌液放置于37℃恒温培养箱中静置培养，于规定时间点取3支试管测定lp220菌液吸光度值od600，计算平均值，并绘制生长曲线。植物乳杆菌lp220菌株生长曲线如图5所示：从图5中可以看出，菌株生长迅速、菌体量大，吸光度值od600在10h达到7.80，18h可达最高9.34，表明植物乳杆菌lp220可以快速生长。实施例3本实施例公开了植物乳杆菌lp220对不同浓度的溶菌酶的耐受能力测试实验。在不同的试管(18mm×18cm)中加入10mlbmrs培养基，再分别添加不同浓度的溶菌酶(酶活单位为20000u/g)溶液，使得终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0(mg/ml)。将植物乳杆菌lp220培养物以5％(v/v)的接种量接种到试管中，37℃培养24h，测定植物乳杆菌lp220活菌数，通过植物乳杆菌lp220的生长情况判断对溶菌酶的耐受性。对照组溶菌酶溶液的量用等体积无菌水代替，另添加等体积的1×108cfu/ml植物乳杆菌lp220。结果如图6所示，以实验组活菌数/对照组活菌数值×100％>60％作为菌株对溶菌酶具有高耐受性的标准，植物乳杆菌lp220对溶菌酶的最高耐受浓度为2mg/ml，一般人群口腔唾液中溶菌酶的浓度(0～60μg/ml)，这说明植物乳杆菌lp220具备在口腔环境中存活的能力。实施例4本实施例考察了植物乳杆菌lp220的自聚能力及与致病菌的共聚能力。通过分光光度法考察植物乳杆菌lp220的自聚能力，以及与变异链球菌cgmcc1.2499的共聚能力，与金黄色葡萄球菌cmcc26003的共聚能力。自聚能力强的菌在口腔里有一定的定植能力，而与致病菌共聚能力强的菌可以将致病菌随漱口水或其他媒介将致病菌带离口腔，达到改善口腔微生物群，从而改善口腔健康。(1)自聚能力的测试将植物乳杆菌lp220、变异链球菌cgmcc1.2499、金黄色葡萄球菌为cmcc26003分别接种到对应的液体培养基中，室温过夜培养，6000r/min离心15min后收集菌体，用磷酸盐缓冲液(ph7.0)清洗两次后并将沉淀重悬，得到菌悬液，并将菌悬液的od600值调整为0.6士0.02的菌悬液，准确记录吸光值(a0)。在试管中添加10ml菌悬液并静置环境下培养，每间隔2小时吸取上层液体测定od600处吸光值，则为：(2)共聚能力的测试植物乳杆菌lp220、变异链球菌cgmcc1.2499、金黄色葡萄球菌为cmcc26003菌悬液制备方法同自聚能力测试试验，分别取植物乳杆菌lp220、变异链球菌cgmcc1.2499、金黄色葡萄球菌为cmcc26003菌悬液1ml充分混合后，并测量混合样品此时od600下的吸光度，记为t0，后置于室温静置培养，每间隔2小时吸取上层液体测定od600处吸光值，记为t2，则为：结果如图7所示，植物乳杆菌lp220与变异链球菌在2h时共聚能力达到35.4％，6h达到43.3％；植物乳杆菌lp220与金黄色葡萄球菌在2h时共聚能力达到6.5％，6h达到39.4％。表明本发明的植物乳杆菌lp220随着时间的延长，与变异链球菌和金黄色葡萄球菌的共聚能力增强，说明植物乳杆菌lp220具有将致病菌随漱口或饮水带离口腔的能力，从而达到改善口腔微生态的作用。实施例5本实施例公开了植物乳杆菌lp220抑制胞外多糖实验。在试管(18mm×18cm)中加入5ml含2％(w/v)蔗糖bhi培养基，5mlbmrs培养基，变异链球菌和金黄色葡萄球菌发酵液各0.05ml(终浓度活菌数分别为106cfu/ml)，加入植物乳杆菌lp220发酵液0.1ml(终浓度活菌数106cfu/ml)充分混合，以不含菌液的bmrs培养基为空白对照，37℃培养6h、12h、18h、24h。使用蒽酮-硫酸法测定胞外多糖的含量，用葡萄糖作为标准曲线，根据标准曲线计算胞外多糖含量。实验结果如图8所示：胞外多糖减少量在6h可达50.6％，12h减少量可达46.9％，效果显著。胞外多糖是生物膜最关键的指标，胞外多糖是致病菌生长的基础也是致病菌成长发育的产物，植物乳杆菌lp220可以显著抑制变异链球菌和金黄色葡萄球菌双菌胞外多糖的形成。实施例6本实施例公开了植物乳杆菌lp220抑制羟基磷灰石降解实验。在试管(18mm*18cm)中加入5ml浓度为50mg/ml羟基磷灰石bhi培养基，5mlbmrs培养基，变异链球菌和金黄色葡萄球菌发酵液各0.05ml(终浓度活菌数106cfu/ml)，加入植物乳杆菌lp220发酵液0.1ml(终浓度活菌数106cfu/ml)充分混合，以不含菌液的bmrs培养基为空白对照，37℃培养24h，使用邻甲苯酚络合物比色法测定菌液中钙离子的含量，其中抑制率＝实验组/对照组×100％。实验结果表明，对照组钙离子的含量为212.22μg/ml，植物乳杆菌处理后钙离子的含量为46.67μg/ml，抑制率为80.5％，说明植物乳杆菌lp220对羟基磷灰石具有较好的抑制效果。实施例7本实施例公开了植物乳杆菌lp220对口腔耐受能力试验1、对抗生素的耐受性试验采用滤纸片法研究lp220对四环素(30μg/片)、红霉素(15μg/片)、氯霉素(30μg/片)、氨苄西林(10μg/片)、青霉素g(10iu/片)、万古霉素(30μg/片)的耐受性，将活化后的lp220接入冷却至45℃左右的bmrs固体培养基中，使活菌终浓度为106cfu/ml，充分混匀后倒入平板中，凝固后放入抗生素滤纸片，37℃培养24h，根据《performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenty-fifthinformationalsupplement.clsidocumentm100-s25》判定标准评价植物乳杆菌lp220对不同浓度抗生素的耐受性。试验结果表明，lp220对四环素(30μg/片)、红霉素(15μg/片)、氯霉素(30μg/片)、氨苄西林(10μg/片)、青霉素g(10iu/片)敏感，对万古霉素(30μg/片)耐受。2、对酸的耐受性将植物乳杆菌lp220菌种按5％的接种量接种到bmrs液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次；将活化好的lp220菌液按5％的接种量接种到bmrs液体培养基中，恒温培养箱中37℃静置培养15h；将培养好的lp220菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀；按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到ph分别为3.0、4.0、5.0和6.0的无菌生理盐水中，以ph6.0的无菌生理盐水作为对照，37℃恒温培养箱中孵育2h；将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入灭菌的pbs缓冲液，拍打混匀后检测植物乳杆菌lp220菌数，对检测的乳酸菌活菌进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组×100％。试验结果如表1所示，当ph＝5时，存活率为95.02％；ph＝4时，存活率85.71％；ph＝3时，存活率80％。口腔环境的ph一般不低于4，说明lp220能够耐受口腔ph环境。表1植物乳杆菌lp220菌株对酸耐受性3、对盐的耐受性将活化的lp220以5％的接种量接种至nacl质量分数为2.0％、4.0％、6.0％、8.0％的bmrs液体培养基为试验组，以不加nacl的bmrs为对照组。37℃静置培养24h，10倍稀释测定乳酸菌活菌数，菌株存活率＝试验组/对照组×100％(以活菌数记)。表2植物乳杆菌lp220菌株对盐耐受性盐(％)活菌数(cfu/g)存活率(％)对照3.850*109----2.03.59*10993.25％4.03.49*10990.65％6.07.700*10820.00％8.03.300*1088.57％试验结果如表2所示，当盐含量分别为2.0％、4.0％时，lp220的存活率为93.25％、90.65％；当盐含量为8.0％时，lp220的存活率为8.57％。因口腔中盐含量一般为0-4.0％，故lp220对口腔环境具有较好的耐受性。实施例8本实施例公开了植物乳杆菌lp220对双菌生物膜形成的抑制作用试验1、微生物数量的变化在培养皿中放入(18mm*18mm)无菌盖玻片，加入变异链球菌和金黄色菌菌悬液各4ml，在0h加入植物乳杆菌lp220上清0.5ml，37℃培养24h，对照以空白bmrs液体培养基代替。培养结束后用无菌镊子将长有生物膜的盖玻片夹入35ml离心管中，以10ml的无菌生理盐水将其浸没，将离心管超声清洗2h保证生物膜从盖玻片上完全洗脱下来，同时混悬于生理盐水中。梯度稀释生物膜菌悬液，每个梯度取100μl稀释悬液，用bhi培养基和lb培养基分别浇注平板，37℃培养24h后计数。表3生物膜致病菌计数结果如表3所示，可见在0h加入植物乳杆菌lp220上清介导后，双菌变异链球菌与金黄色葡萄球菌生物膜中致病菌数量均下降了2个数量级，表明植物乳杆菌lp220上清具有抑制致病菌形成生物膜的作用。2、生物膜表型检测将植物乳杆菌lp220与变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003过夜培养，10倍稀释后培养2h至od600为0.4±0.02。将圆形玻片放入24孔板中，加入1ml含2％(w/v)蔗糖及0.5％(w/v)mes缓冲液的bhi培养基与等体积bmrs培养基，接种20μl乳酸菌、变异链球菌和金黄色葡萄球菌，充分混合，37℃培养24h。用无菌镊子夹出玻片，表面用pbs清洗去除游离的菌体后放入新的24孔板，加入1ml2.5％戊二醛过夜固定生物膜。吸去戊二醛并用pbs清洗两次，用不同梯度的乙醇(30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％)脱水10-15min。最后一次脱水后4℃冰箱放置可保存镜检。试验结果如图9所示：变异链球菌cgmcc1.2499与金黄色葡萄球菌cmcc26003共同培养时大量生长，同时被大量的胞外多糖包裹，形成致密的网状结构，如图9a、图9b所示；当加入植物乳杆菌lp220混合培养后视野中致病菌大量减少，生物膜中细菌多为杆菌，同时结构变得比较疏松，胞外多糖含量明显减少，如图9c、图9d所示，表明植物乳杆菌lp220抑制了变异链球菌cgmcc1.2499和金黄色葡萄球菌cmcc26003双菌生物膜的形成，从而防治龋病的形成。最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。sequencelisting<110>四川高福记生物科技有限公司<120>一株植物乳杆菌lp220及应用<130>20210407<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1537<212>dna<213>植物乳杆菌lactobacillusplantarum<400>1ctttacggttaccttgttacgacttcaccctaatcatctgtcccaccttaggcggctggt60tcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggt120gtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattc180cgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagatta240gcttgctctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccag300gtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcag360tctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgg420gacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtatccatg480tccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggtt540cttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattc600ctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgca660gcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactacca720gggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccaga780cagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatgga840gttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgag900ccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatc960cggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctt1020tctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttctttaacaac1080agagttttacaagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgt1140ccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtccc1200aatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccc1260caccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttcaa1320gctcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgttatcc1380cccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaatgtaa1440atcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgatcgacttgcatgtattaggcacgc1500cgccagcgttcgtcctgagccaggatcaaactcaagg1537当前第1页12