本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基。
背景技术：
：造血干细胞(hematopoieticstemcells,hscs)具有自我更新细胞增殖和分化到各种血液组织的能力。造血干细胞对于血液系统的发育、维持和再生发挥着至关重要的作用。通常情况下，造血干细胞在正常的血液系统中处于静息状态，但是一旦发生如移植器官过程中的血液损失和感染，造血干细胞被立即激活以发生快速造血的功能。大部分的造血干细胞处于细胞周期的g0期，大约每个月会更新一次，导致造血干细胞在体内的数量极少，大大的限制了造血干细胞在临床中的应用。骨髓、外周血和脐带血是造血干细胞的重要来源。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有富含更早期的造血干细胞、采集方便，造血半细胞免疫原性弱，对异源性抗原产生的抗体少，移植过程中不需要严格配型，成熟性t细胞较少，采集和保存容易，无肿瘤细胞污染，对供者无损伤和副作用等优点，因而，脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。但是，造血干细胞的成功移植每千克体重至少需要2.5×106个cd34+细胞。cd34+细胞在脐带血的含量约为1％～2％，现有的脐带造血干细胞体外扩增培养体系仍难以满足临床上对hscs的大量需求。目前，采用现有造血干细胞培养基多数会采用胎牛血清，培养基中加入了非人源物质，对造血干细胞的培养会造成干扰，同时采用现有的培养基培养的造血干细胞大多存在活性和增殖能力较差的问题。现急需研究一种能够提高造血干细胞的扩增率和细胞活性培养基。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，不添加动物血清，成分明确，对脐带血造血干细胞的扩增有明显的促进作用。本发明的目的采用如下技术方案实现：一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中以下组分：雷公藤内酯醇、p27抑制剂、改性纳米二氧化钛、干细胞因子、2-巯基乙醇、l-肉毒碱、尼克酰胺、亚油酸、il-2；所述改性纳米二氧化钛的制备过程如下：（1）将棉花裁切后浸泡在75%乙醇中进行预处理，取出后经去离子水冲洗后烘干；（2）将烘干后的棉花送入碳化炉，在绝氧条件下进行碳化处理，得到碳纤维；（3）将钛酸丁酯溶于无水乙醇中加入抑制剂，再加入分散剂和去离子水，调节溶液ph至2.5-4.5，搅拌后得到二氧化钛溶胶；（4）将步骤（2）的碳纤维加入步骤（3）的二氧化钛溶胶中，充分吸附后取出碳纤维，用40%乙醇清洗后放入盛有去离子水的高压反应釜中，将高压反应釜置于烘箱中热处理后取出碳纤维，烘干得到负载在碳纤维上的改性纳米二氧化钛。进一步地，以终浓度计，所述用于扩增脐带血造血干细胞的培养基中各组分的质量浓度为：雷公藤内酯15-25ng/ml、p27抑制剂3-5ng/ml、改性纳米二氧化钛5-10ng/ml、干细胞因子20-30ng/ml、2-巯基乙醇1-5ng/ml、l-肉毒碱12-18ng/ml、尼克酰胺1-5μg/ml、亚油酸20-30ng/ml、il-25-10ng/ml。进一步地，以终浓度计，所述用于扩增脐带血造血干细胞的培养基中各组分的质量浓度为：雷公藤内酯20ng/ml、p27抑制剂4ng/ml、改性纳米二氧化钛8ng/ml、干细胞因子25ng/ml、2-巯基乙醇2ng/ml、l-肉毒碱15ng/ml、尼克酰胺3μg/ml、亚油酸25ng/ml、il-28ng/ml。进一步地，所述基础培养基为imem培养基。进一步地，步骤（2）中碳化处理的过程为：升温至1000-1200℃，碳化处理90-100min。进一步地，步骤（3）中所述抑制剂为柠檬酸，所述分散剂为乙二醇乙醚。进一步地，步骤（3）中钛酸丁酯和无水乙醇的质量比为1:5-10，钛酸丁酯和抑制剂的质量比为1:0.5-1，钛酸丁酯和分散剂的质量比为1:1-2，钛酸丁酯和去离子水的质量比为1:2-4。进一步地，步骤（4）中碳纤维和二氧化钛溶胶的质量比为：1:5-15。进一步地，步骤（4）的热处理过程为：在200-220℃热处理4-5h。进一步地，步骤（4）中烘干温度为100-120℃。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，为细胞增殖提供稳定的外部环境，其中培养基中的雷公藤内酯醇和p27抑制剂、改性纳米二氧化钛发挥协同作用促进脐带血造血干细胞的体外扩增，刺激细胞生长，提高细胞的增殖能力，并且能保持细胞活性，避免细胞凋亡，极大地提高了脐带血造血干细胞的体外增殖效率。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例1一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，由imem培养基和添加在imem培养基中以终浓度计的以下组分组成：雷公藤内酯20ng/ml、p27抑制剂4ng/ml、改性纳米二氧化钛8ng/ml、干细胞因子25ng/ml、2-巯基乙醇2ng/ml、l-肉毒碱15ng/ml、尼克酰胺3μg/ml、亚油酸25ng/ml、il-28ng/ml。所述改性纳米二氧化钛的制备过程如下：（1）将棉花裁切后浸泡在75%乙醇中进行预处理，取出后经去离子水冲洗后烘干；（2）将烘干后的棉花送入碳化炉，在绝氧条件下进行升温至1100℃，碳化处理95min，得到碳纤维；（3）将钛酸丁酯溶于无水乙醇中，钛酸丁酯和无水乙醇的质量比为1:8，加入柠檬酸，钛酸丁酯和柠檬酸的质量比为1:0.7，再加入乙二醇乙醚和去离子水，钛酸丁酯和乙二醇乙醚的质量比为1:1，钛酸丁酯和去离子水的质量比为1:3，调节溶液ph至3.0，搅拌后得到二氧化钛溶胶；（4）将步骤（2）的碳纤维加入步骤（3）的二氧化钛溶胶中，碳纤维和二氧化钛溶胶的质量比为：1:10，充分吸附后取出碳纤维，用40%乙醇清洗后放入盛有去离子水的高压反应釜中，将高压反应釜置于烘箱中，在210℃热处理4.5h，热处理后取出碳纤维，在110℃烘干得到负载在碳纤维上的改性纳米二氧化钛。实施例2一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，由imem培养基和添加在imem培养基中以终浓度计的以下组分组成：雷公藤内酯15ng/ml、p27抑制剂3ng/ml、改性纳米二氧化钛5ng/ml、干细胞因子20ng/ml、2-巯基乙醇1ng/ml、l-肉毒碱12ng/ml、尼克酰胺1μg/ml、亚油酸20ng/ml、il-25ng/ml。所述改性纳米二氧化钛的制备过程如下：（1）将棉花裁切后浸泡在75%乙醇中进行预处理，取出后经去离子水冲洗后烘干；（2）将烘干后的棉花送入碳化炉，在绝氧条件下进行升温至1000℃，碳化处理100min，得到碳纤维；（3）将钛酸丁酯溶于无水乙醇中，钛酸丁酯和无水乙醇的质量比为1:5，加入柠檬酸，钛酸丁酯和柠檬酸的质量比为1:0.5，再加入乙二醇乙醚和去离子水，钛酸丁酯和乙二醇乙醚的质量比为1:1，钛酸丁酯和去离子水的质量比为1:2，调节溶液ph至2.5，搅拌后得到二氧化钛溶胶；（4）将步骤（2）的碳纤维加入步骤（3）的二氧化钛溶胶中，碳纤维和二氧化钛溶胶的质量比为：1:5，充分吸附后取出碳纤维，用40%乙醇清洗后放入盛有去离子水的高压反应釜中，将高压反应釜置于烘箱中，在200℃热处5h，热处理后取出碳纤维，在100℃烘干得到负载在碳纤维上的改性纳米二氧化钛。实施例3一种用于扩增脐带血造血干细胞的培养基，由imem培养基和添加在imem培养基中以终浓度计的以下组分组成：雷公藤内酯25ng/ml、p27抑制剂5ng/ml、改性纳米二氧化钛10ng/ml、干细胞因子30ng/ml、2-巯基乙醇5ng/ml、l-肉毒碱18ng/ml、尼克酰胺5μg/ml、亚油酸30ng/ml、il-210ng/ml。所述改性纳米二氧化钛的制备过程如下：（1）将棉花裁切后浸泡在75%乙醇中进行预处理，取出后经去离子水冲洗后烘干；（2）将烘干后的棉花送入碳化炉，在绝氧条件下进行升温至1200℃，碳化处理90min，得到碳纤维；（3）将钛酸丁酯溶于无水乙醇中，钛酸丁酯和无水乙醇的质量比为1:10，加入柠檬酸，钛酸丁酯和柠檬酸的质量比为1:1，再加入乙二醇乙醚和去离子水，钛酸丁酯和乙二醇乙醚的质量比为1:2，钛酸丁酯和去离子水的质量比为1:4，调节溶液ph至4.5，搅拌后得到二氧化钛溶胶；（4）将步骤（2）的碳纤维加入步骤（3）的二氧化钛溶胶中，碳纤维和二氧化钛溶胶的质量比为：1:5-15，充分吸附后取出碳纤维，用40%乙醇清洗后放入盛有去离子水的高压反应釜中，将高压反应釜置于烘箱中，在220℃热处理4h，热处理后取出碳纤维，在120℃烘干得到负载在碳纤维上的改性纳米二氧化钛。对比例1对比例1提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：省去雷公藤内酯，其余均和实施例1相同。对比例2对比例2提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：省去p27抑制剂，其余均和实施例1相同。对比例3对比例3提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：将p27抑制剂替换为p57抑制剂，其余均和实施例1相同。对比例4对比例4提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：省去改性纳米二氧化钛，其余均和实施例1相同。对比例5对比例5提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：将改性纳米二氧化钛替换为改性纳米二氧化钛制备过程中步骤（2）的碳纤维，其余均和实施例1相同。对比例6对比例6提供一种扩增脐带血造血干细胞的培养基，和实施例1的区别为：将改性纳米二氧化钛替换为纳米二氧化钛，其余均和实施例1相同。将采用免疫磁珠法分选出的脐带血cd34+细胞，经常规培养后取p3代细胞进行扩增，过程如下：将p3代脐带血造血干细胞接种于96孔板中，细胞密度为1×104个/ml，分别用实施例1至3和对比例1至6的培养基作为扩增培养基，每组培养基复种三个孔，每孔100μl，在37℃，5%co2的培养箱中培养，每两天半量更换培养基，培养7天后采用流式细胞仪检测cd34+细胞数量并计算扩增倍数，结果如表1所示。表1样品扩增倍数实施例125.47±0.79实施例224.76±0.72实施例325.10±0.64对比例111.54±0.52对比例212.89±0.65对比例313.88±0.57对比例410.46±0.49对比例510.79±0.61对比例611.37±0.64由表1可以看出采用实施例1至3培养基的造血干细胞扩增数量更多，对比例1至6中调整了培养基的组成，在用于造血干细胞的扩增时，增殖效果不及实施例1至3。说明本发明的培养基中雷公藤内酯醇、p27抑制剂、改性纳米二氧化钛发挥协同作用促进脐带血造血干细胞的体外扩增，刺激细胞生长，提高细胞的增殖能力，进而提高脐带血造血干细胞的体外扩增效率。将上述实验培养7天后扩增的造血干细胞采用台盼蓝染色法统计细胞活率，结果如表2所示。表2样品细胞活率（%）实施例198.45实施例297.24实施例397.96对比例183.51对比例285.79对比例387.42对比例481.37对比例582.64对比例684.79由表2可以看出实施例1至3中经扩增得到的造血干细胞活率更高，对比例1至6中调整了培养基的成分后，细胞的活率下降，说明培养基中的雷公藤内酯醇和p27抑制剂、改性纳米二氧化钛协同增效保持细胞活性，避免细胞凋亡，进而提高脐带血造血干细胞的体外增殖效率。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12