一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法与流程

本发明属于细胞生物学
技术领域：
，尤其涉及一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法。
背景技术：
：脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesnchymalstemcells，uc-mscs)，是指从新生儿脐带组织中分离的一种多能干细胞。能分化形成骨、软骨、肌肉、脂肪等多种中胚层细胞。与骨髓干细胞相比，uc-mscs则来源丰富并且免疫原性低，是比较理想的种子细胞来源。作为再生医学中的常用细胞，体外培养和扩增uc-mscs是推动其临床研宄及应用的必要条件。影响uc-mscs培养和扩增的因素包括培养方法和培养基，在体外培养过程中，使用成分明确的无血清培养基可以避免血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性，有利于研究者对细胞行为进行精确调控。但无血清培养基中细胞贴壁能力较弱，从而影响脐带间充质干细胞的原代培养，进而影响后续的传代培养。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，至少包括以下步骤：s1、剪取脐带转入培养皿中挤出残血并剪短；然后转入新的培养皿中剥离血管和外膜，得到华通氏胶组织；s2、将华通氏胶组织放于新的培养皿中，加入氯化钠注射液清洗；转入离心管中，剪成小块；吸取华通氏胶组织糜浆均匀平铺于培养瓶底部；s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，待组织贴壁后，向培养瓶中加入原代培养基，缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面；将培养瓶放入培养箱中培养。作为一种优选的技术方案，s2中所述氯化钠注射液清洗8～10次。作为一种优选的技术方案，s2中剪成的小块体积为1～2mm3。作为一种优选的技术方案，所述培养箱的培养条件为37.0℃，5.0％co2。作为一种优选的技术方案，所述原代培养基，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基、纤连蛋白。作为一种优选的技术方案，所述原代培养基，按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基98～100份、纤连蛋白0～0.5份。作为一种优选的技术方案，所述原代培养基，按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.25份。作为一种优选的技术方案，所述培养方法还包括：培养瓶放入培养箱中培养4～6天后，向培养瓶中补充加入原代培养基后继续培养。作为一种优选的技术方案，所述培养方法还包括：培养瓶放入培养箱中培养7～9天后，用移液管吸弃培养瓶上清液及脱落的组织块，再加入原代培养基继续培养；所述再加入原代培养基的量为s1中加入的原代培养基量的2倍。本发明还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。有益效果：本发明提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，使用成分明确的原代培养基，且不含血清，避免血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性，同时提高了无血清培养基中细胞贴壁能力，减少了贴壁时间，提高了效率，且原代培养的人脐带间充质干细胞制备成工作库细胞具有良好的形态。附图说明图1是实施例1原代培养的人脐带间充质干细胞制备成的工作库细胞细胞的形态图。具体实施方式结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本发明中提供的任何定义不一致，则以本发明中提供的术语定义为准。在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本发明的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。为了解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，至少包括以下步骤：s1、剪取脐带转入培养皿中挤出残血并剪短；然后转入新的培养皿中剥离血管和外膜，得到华通氏胶组织；s2、将华通氏胶组织放于新的培养皿中，加入氯化钠注射液清洗；转入离心管中，剪成小块；吸取华通氏胶组织糜浆均匀平铺于培养瓶底部；s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，待组织贴壁后，向培养瓶中加入原代培养基，缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面；将培养瓶放入培养箱中培养。在一些优选的实施方式，s2中所述氯化钠注射液清洗8～10次。在一些优选的实施方式，s2中剪成的小块体积为1～2mm3。在一些优选的实施方式，所述培养箱的培养条件为37.0℃，5.0％co2。临床上对治疗用的人脐带间充质干细胞有如下要求：细胞制剂无致病因子感染风险；细胞扩增应当使用添加成分明确的无血清培养基，残留的培养基对受体无不良影响，培养过程避免使用抗生素；细胞制剂应含有足量保持较高活力的细胞，有效维持与治疗相关的生物学特性。按照这些标准，传统的用于扩增人脐带间充质干细胞的含血清培养基已不能满足临床需求。尽管部分生物公司已经开发出几款适合于体外扩增的商业化无血清培养基，但是在使用时仍存在一定问题，如原代培养过程中细胞贴壁能力较弱，培养后细胞表面特异性抗原表达、分化潜能等有所下降等。为了提高原代培养过程中细胞贴壁能力及抗氧化能力，在一些优选的实施方式，所述原代培养基，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基、纤连蛋白。在一些优选的实施方式，所述原代培养基，按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基98～100份、纤连蛋白0～0.5份。在一些优选的实施方式，所述原代培养基，按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.25份。纤连蛋白通过纤连蛋白分子上的粘附位点，影响细胞黏附、迁移等，从而提高细胞贴壁能力。当间充质干细胞无血清培养基98～100份、纤连蛋白0～0.5份时，发明人意外的发现细胞贴壁能力进一步增强，细胞形态结构更好，这可能是由于细胞与纤连蛋白分子上的黏附位点结合，缩短了细胞汇合时间，且提高了细胞外基质的稳定性，从而提高了细胞贴壁率、汇合率以及细胞结构稳定性。在一些优选的实施方式，所述培养方法还包括：培养瓶放入培养箱中培养4～6天后，向培养瓶中补充加入原代培养基后继续培养。在一些优选的实施方式，所述培养方法还包括：培养瓶放入培养箱中培养7～9天后，用移液管吸弃培养瓶上清液及脱落的组织块，再加入原代培养基继续培养；所述再加入原代培养基的量为s1中加入的原代培养基量的2倍。本发明还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。实施例以下通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。实施例1实施例1提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.25份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。实施例1还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。实施例2实施例2提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基98份、纤连蛋白0.25份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。实施例2还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。实施例3实施例3提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基99份、纤连蛋白0.25份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。实施例3还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。实施例4实施例4提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.2份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。实施例4还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。实施例5实施例5提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.15份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。实施例5还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。对比例1对比例1提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01。对比例1还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。对比例2对比例2提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基90份、纤连蛋白0.25份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；对比例2还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。对比例3对比例3提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.8份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。对比例3还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。对比例4对比例4提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，包括以下步骤：s1、将脐带从采集瓶中取出放入装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剪取10cm左右脐带组织。将剪取的脐带组织转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短。将脐带小段转入新的装有30ml氯化钠注射液的150mm培养皿中，剥离脐带血管和外膜得到华通氏胶组织。s2、将收集到的华通氏胶组织放于新的150mm培养皿中，加入适量氯化钠注射液清洗8次。将清洗后的华通氏胶组织转入50ml离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块。用巴氏吸管吸取0.5ml华通氏胶组织糜浆于75cm2培养瓶中，用5ml移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部。s3、将培养瓶放于生物安全柜内静置，静置直至全部组织贴壁。贴壁的标志：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。组织贴壁后，向培养瓶中加入5ml原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面。将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中培养。s4、在组织块接种后的第5天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现在组织块的周围有梭状贴壁细胞出现，则进行补液操作，向培养瓶中补充加入5ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养。s5、在组织块接种后的第8天，从培养箱中取出培养的细胞。显微镜下观察细胞生长情况，如发现30％以上的组织块边缘有细胞爬出，则进行换液，用移液管吸弃培养上清液及脱落的组织块后，向培养瓶中加入10ml原代培养基。操作完成后，将培养瓶放入37.0℃，5.0％co2培养箱中继续培养；当显微镜下观察到50％以上的组织块周围爬出细胞且局部融合度在80％以上，则完成原代培养。所述原代培养基按重量份计，至少包括以下组分：间充质干细胞无血清培养基100份、纤连蛋白0.05份。所述间充质干细胞无血清培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cm-sc01；所述纤连蛋白购自上海源叶生物科技有限公司，货号为s12073-5mg。对比例4还提供了一种原代培养的人脐带间充质干细胞，由上述所述的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法培养得到。性能评价1、贴壁时间测试在上述实施例和对比例s3中培养瓶放于生物安全柜内静置的时候，每5分钟检测一次组织是否完全贴壁，贴壁时间记录于表1。2、细胞形态测试将实施例1～5原代培养的人脐带间充质干细胞制备成工作库细胞，图1是实施例1原代培养的人脐带间充质干细胞制备成的工作库细胞细胞的形态图，实施例2～5原代培养的人脐带间充质干细胞制备成的工作库细胞细胞的形态图与图1类似。表1实施例贴壁时间/min实施例125实施例225实施例325实施例430实施例530对比例160对比例255对比例340对比例445通过上述实施例和对比例可以得知，本发明提供了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法,使用成分明确的无血清培养基，避免血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性，同时提高了无血清培养基中细胞贴壁能力，减少了贴壁时间，提高了效率，且原代培养的人脐带间充质干细胞制备成工作库细胞具有良好的形态。最后指出，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12