一种改良的嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法与流程

本发明属于微生物培养技术领域，尤其是一种改良的嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法。

背景技术：

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)是人体肠道菌群主要成员之一，于2004年首次被分离和鉴定，属于革兰氏阴性球菌，严格厌氧，运动不活泼，无芽孢，是一种定植于粘膜层的肠道共生体，能够专一性降解肠道黏蛋白的细菌，利用人类肠道上皮细胞覆盖着粘膜层中富含的黏蛋白作为其能源，从而通过竞争作用保护肠道免受病原体的侵害。阿克曼氏菌与其他肠道菌的不同之处在于它能储存黏蛋白，即使在肠道中没有营养物质也可以蓬勃生长。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌作为一种肠道益生菌具有诸多特性：研究显示阿克曼氏菌对早衰症具有防护作用；可显著减缓小鼠模型渐冻症；不受灭活的影响，口服灭活的阿克曼氏菌能减少肥胖带来的心血管风险及ii型糖尿病的风险；治疗肥胖，但不影响肠道菌群组成等等，在未来的疾病治疗及预防中有广泛的应用前景。

目前，嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法主要包括厌氧箱、厌氧罐、厌氧袋及亨盖特厌氧滚管技术，由于阿克曼氏菌的严格厌氧条件且需要黏蛋白作为其能量来源，因此培养条件成为其生长的一个瓶颈。常规的阿克曼氏菌液体厌氧培养方法是在100％n2、37℃条件下用厌氧螺口试管培养，或用182kpan2/co2的气相提供的厌氧条件下在37℃下用丁基橡胶塞密封的血清瓶中进行。阿克曼氏菌液体的培养方法的要求较高且不易操作，对细菌的大规模生产造成一定的限制，其中，用n2去除氧气是液体培养阿克曼氏菌繁琐步骤中的一步，该操作费时费力且成本高，为了免去这一步骤，使试验能够便捷高效地进行，因此本研究旨在探索一种便捷高效的液体培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法来大量培养阿克曼氏菌。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种改良的嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法，本发明在培养过程中在液体培养基上层加入灭菌溶剂，以隔绝液体培养基与外界空气的接触，从而达到与n2除氧相同的目的，实现了良好的培养效果，且操作更简便，对设备要求更低。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种改良的嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法，包括如下步骤：

(1)用无菌吸管吸取液体培养基或者无菌水，按照固液比0.6～1.0ml：1g滴入装有嗜黏蛋白阿克曼氏菌的冻干管中，轻轻振荡至其溶解，得到菌悬液；

(2)吸取全部菌悬液接种在固体培养基上，然后将其置于厌氧袋中，同时将厌氧包、氧气指示剂迅速放入厌氧袋中，密封所述厌氧袋，待其中的氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将厌氧袋转入37℃环境下恒温培养48～72h，得到复苏的细菌；

(3)从复苏的细菌固体培养基挑取单个菌落到液体培养基中，并将其置于放入试管中，向所述试管内液体培养基表面加入灭菌溶剂，再将试管置于含有厌氧包、氧气指示剂的厌氧袋中，密封完全后待氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将所述厌氧袋转入37℃环境下恒温培养45～48h，即完成所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养，得到培养的菌液。

进一步地，所述液体培养基是向bhi液体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.20％～0.25％的单糖岩澡糖、0.22％～0.25％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.25％～0.30％的胰蛋白胨、0.25％～0.28％的苏氨酸、0.21％～0.25％的猪肠胃黏蛋白。

进一步地，所述固体培养基是向bhi固体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.25％～0.30％的单糖岩澡糖、0.20％～0.25％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.24％～0.27％的胰蛋白胨、0.20％～0.25％的苏氨酸、0.22％～0.25％的猪肠胃黏蛋白。

进一步地，所述灭菌溶剂为液体石蜡或二甲苯或乙酸乙酯。

进一步地，所述灭菌溶剂的加入量为占所述试管高度1cm或以上的量。

进一步地，所述试管为厌氧螺口试管。

进一步地，将培养的菌液按照细菌基因组dna抽提试剂盒的步骤抽提dna，以抽提的dna为模板，扩增16srdna基因片段，扩增片段大小为1400bp，将扩增的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，然后测序。

进一步地，所述扩增的引物序列如下：27f:5’-agagtttgatcmtggctcag-3’

1492r:5’-ggctaccttgttacgactt-3’。

进一步地，所述反应体系为：2×estaqmastermix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s,52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明使用固体、液体培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌时，是向所述bhi培养基里额外添加了单糖岩澡糖、n-乙酰氨基葡萄糖胺、胰蛋白胨、苏氨酸及猪肠胃黏蛋白，这些糖是黏蛋白的衍生成分，在黏蛋白存在的情况下，添加额外的黏蛋白衍生成分能够实现嗜黏蛋白阿克曼氏菌的最佳增长，厌氧培养48～60h后，菌液浓度能达到10⁹cfu/ml，与利用相同培养基在传统培养方法条件下未表现出显著差异。

2.本发明使用液体培养基培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌时，在bhi液体培养基的上层封注灭菌溶剂，与传统利用丁基橡胶塞密封的血清瓶培养方法相比，免去了n2、n2/co2除氧的步骤，该操作降低了培养难度，能够使嗜黏蛋白阿克曼氏菌大规模地培养，且操作更简便，比传统厌氧培养方法节省24～48h的除氧时间，对设备要求更低，为日后该益生菌的应用提供了技术支持，为其在食品、饲料、药物等方面的应用奠定基础。

3.本发明能使用普通的试管代替厌氧螺口试管，进一步降低了培养成本，简化培养条件，能够达到同样的高效培养效果，比传统的培养方法简单便捷，省时省力，具有极大的进步意义。

4.本发明采用的灭菌溶剂包括液体石蜡或二甲苯或乙酸乙酯，该溶剂不会对实验中的培养基造成不利的影响，并不会对培养的阿克曼氏菌产生危害。

附图说明

图1为本发明的阿克曼氏菌固体培养基复苏结果图。

图2为本发明的阿克曼氏菌改良液体培养基结果图。

图3为本发明的阿克曼氏菌在genbank上进行blast比对图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不作为是对本发明的限制。如下使用的嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干管购自广东菌种保藏中心；bhi固体、液体培养基购自北京陆桥技术责任有限公司；猪肠胃黏蛋白购自上海源叶生物科技有限公司；厌氧袋、厌氧包、氧气指示剂购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌基因组dna抽提试剂盒购自北京康维世纪生物科技有限公司；革兰氏快速染液购自珠海贝索生物技术有限公司；其余试剂购自化学原料公司。

实施例1

(一)准备培养基

液体培养基是向bhi液体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.20％的单糖岩澡糖、0.22％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.25％的胰蛋白胨、0.25％的苏氨酸、0.21％的猪肠胃黏蛋白；

固体培养基是向bhi固体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.25％的单糖岩澡糖、0.20％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.24％的胰蛋白胨、0.20％的苏氨酸、0.22％的猪肠胃黏蛋白；

(二)嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法，包括如下步骤：

(1)用无菌吸管吸取液体培养基或者无菌水，按照固液比0.8ml：1g滴入装有嗜黏蛋白阿克曼氏菌的冻干管中，轻轻振荡至其溶解，得到菌悬液；

(2)吸取全部菌悬液接种在固体培养基上，然后将其置于厌氧袋中，同时将厌氧包、氧气指示剂迅速放入厌氧袋中，密封所述厌氧袋，待其中的氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将厌氧袋转入37℃环境下恒温培养48h，得到复苏的细菌；如图1所示，图1为本发明的阿克曼氏菌固体培养基复苏结果图；

(3)从复苏的细菌固体培养基挑取单个菌落到液体培养基中，并将其置于放入试管中，向所述试管内液体培养基表面加入灭菌溶剂液体石蜡，再将试管置于含有厌氧包、氧气指示剂的厌氧袋中，密封完全后待氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将所述厌氧袋转入37℃环境下恒温培养45h，即完成所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养，得到培养的菌液(图2为本发明的阿克曼氏菌改良液体培养基结果图，如图2所示，可见灭菌溶剂与培养基之间明显分层)；所述灭菌溶剂的加入量为占所述试管高度1cm的量；

经过检测，得到培养的菌液浓度能达到10⁹cfu/ml，与利用相同培养基在传统培养方法条件下未表现出显著差异。

将培养的菌液按照细菌基因组dna抽提试剂盒的步骤抽提dna，以抽提的dna为模板，扩增16srdna基因片段，扩增片段大小为1400bp，将扩增的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，送至广州天一辉远公司测序；

所述扩增的引物序列如下：

27f:5’-agagtttgatcmtggctcag-3’

1492r:5’-ggctaccttgttacgactt-3’；

所述反应体系为：2×estaqmastermix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s,52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

将所得菌液经16srdna测序，并在genbank上进行blast比对，如图3所示，与阿克曼氏菌序列同源性达到98.09％，证明该菌为阿克曼氏菌。

实施例2

(一)准备培养基

液体培养基是向bhi液体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.25％的单糖岩澡糖、0.25％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.30％的胰蛋白胨、0.28％的苏氨酸、0.25％的猪肠胃黏蛋白。

固体培养基是向bhi固体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.30％的单糖岩澡糖、0.25％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.27％的胰蛋白胨、0.25％的苏氨酸、0.25％的猪肠胃黏蛋白；

(二)嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法，包括如下步骤：

(1)用无菌吸管吸取液体培养基或者无菌水，按照固液比1.0ml：1g滴入装有嗜黏蛋白阿克曼氏菌的冻干管中，轻轻振荡至其溶解，得到菌悬液；

(2)吸取全部菌悬液接种在固体培养基上，然后将其置于厌氧袋中，同时将厌氧包、氧气指示剂迅速放入厌氧袋中，密封所述厌氧袋，待其中的氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将厌氧袋转入37℃环境下恒温培养72h，得到复苏的细菌；

(3)从复苏的细菌固体培养基挑取单个菌落到液体培养基中，并将其置于放入试管中，向所述试管内液体培养基表面加入灭菌溶剂二甲苯，再将试管置于含有厌氧包、氧气指示剂的厌氧袋中，密封完全后待氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将所述厌氧袋转入37℃环境下恒温培养48h，即完成所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养，得到培养的菌液；所述灭菌溶剂的加入量为占所述试管高度1.2cm的量；

经过检测，得到培养的菌液浓度能达到10⁹cfu/ml，与利用相同培养基在传统培养方法条件下未表现出显著差异。

将培养的菌液按照细菌基因组dna抽提试剂盒的步骤抽提dna，以抽提的dna为模板，扩增16srdna基因片段，扩增片段大小为1400bp，将扩增的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，送至广州天一辉远公司测序；

所述扩增的引物序列如下：

27f:5’-agagtttgatcmtggctcag-3’

1492r:5’-ggctaccttgttacgactt-3’；

所述反应体系为：2×estaqmastermix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s,52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

将所得菌液经16srdna测序，并在genbank上进行blast比对，与阿克曼氏菌序列同源性达到98.09％，证明该菌为阿克曼氏菌。

实施例3

(一)准备培养基

液体培养基是向bhi液体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.22％的单糖岩澡糖、0.24％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.28％的胰蛋白胨、0.27％的苏氨酸、0.23％的猪肠胃黏蛋白。

固体培养基是向bhi固体培养基中添加了如下质量百分数的物质：0.28％的单糖岩澡糖、0.23％的n-乙酰氨基葡萄糖胺、0.25％的胰蛋白胨、0.22％的苏氨酸、0.24％的猪肠胃黏蛋白；

(二)嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法，包括如下步骤：

(1)用无菌吸管吸取液体培养基或者无菌水，按照固液比0.6ml：1g滴入装有嗜黏蛋白阿克曼氏菌的冻干管中，轻轻振荡至其溶解，得到菌悬液；

(2)吸取全部菌悬液接种在固体培养基上，然后将其置于厌氧袋中，同时将厌氧包、氧气指示剂迅速放入厌氧袋中，密封所述厌氧袋，待其中的氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将厌氧袋转入37℃环境下恒温培养55h，得到复苏的细菌；

(3)从复苏的细菌固体培养基挑取单个菌落到液体培养基中，并将其置于放入试管中，向所述试管内液体培养基表面加入灭菌溶剂乙酸乙酯，再将试管置于含有厌氧包、氧气指示剂的厌氧袋中，密封完全后待氧气指示剂显示厌氧袋内为无氧环境后，将所述厌氧袋转入37℃环境下恒温培养47h，即完成所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养，得到培养的菌液；所述灭菌溶剂的加入量为占所述试管高度1.5cm的量。

经过检测，得到培养的菌液浓度能达到10⁹cfu/ml，与利用相同培养基在传统培养方法条件下未表现出显著差异。

将培养的菌液按照细菌基因组dna抽提试剂盒的步骤抽提dna，以抽提的dna为模板，扩增16srdna基因片段，扩增片段大小为1400bp，将扩增的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳，送至广州天一辉远公司测序；

所述扩增的引物序列如下：

27f:5’-agagtttgatcmtggctcag-3’

1492r:5’-ggctaccttgttacgactt-3’；

所述反应体系为：2×estaqmastermix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s,52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

将所得菌液经16srdna测序，并在genbank上进行blast比对，与阿克曼氏菌序列同源性达到98.09％，证明该菌为阿克曼氏菌。

对比例1

与实施例1相比，区别在于，是用焦性没食子酸替换液体石蜡。记录实验过程。

实验中焦性没食子酸虽然能够形成明显的分层，实现隔绝空气，但是全程需要避光保存，且有很高的毒性。

对比例2

与实施例1相比，区别在于，是用甘油替换液体石蜡。记录实验过程。

实验中甘油能与液体培养基混溶，不能较好地与培养基分层隔绝氧气。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

序列表

<120>一种改良的嗜黏蛋白阿克曼氏菌液体培养方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

alaglyalaglythrthrthrglyalathrcysmetthrglyglycys

151015

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20

<210>2

<211>19

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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151015

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