一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌及其应用的制作方法

1.本发明属于食品发酵加工技术领域，具体涉及一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌及其应用。


背景技术：

2.酱油是传统的发酵食品之一，已经成为中国家家户户必备的调味品。它独特的色香味离不开酿造过程中不同微生物的相互作用，同时也含有丰富的营养成分，具有一定的保健效果。在19世纪20年代，人们比较重视酱油中氨基态氮等基本指标，但随着生活水平的提高，消费者逐渐对酱油的色香味具有更高的要求，逐渐追求滋味和风味良好的高品质酱油，使得越来越多的研究人员关注于酱油的风味研究。
3.酱油香气化合物主要包括酸类、醇类、醛类、酯类、酮类、酚类和呋喃酮类等多种物质，其中乙酯类化合物在酱油中起着香甜、浓郁而柔和的基底作用，赋予甜香和果香(冯云子.高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[d].华南理工大学,2015.)。其中赋予果香的化合物包括乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、乳酸乙酯、2
‑
甲基丁酸乙酯和异戊酸乙酯，这些物质的香气阈值较低，在0.1
‑
10μg/kg范围内；而赋予花香的化合物主要包括乙酸苯乙酯(花香和蜂蜜香)和苯乙酸乙酯(花香)，其香气阈值分别为249.6和155.5μg/kg。这些乙酯类化合物在高盐稀态酱油中具有重要的风味贡献作用，主要与酵母酶催化作用密切相关，少量来源于物质的化学反应。王春玲等(王春玲,宋茜,侯丽华,等.耐盐产酯酵母的选育及发酵性能研究[j].中国酿造,2010(06):20
‑
24.)通过选育耐盐产酯酿酒酵母，可以有效提高乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量，改善酱醪汁的风味。因此筛选高产乙酯类化合物的功能酵母菌，并强化应用到酱油酿造体系中，对于提升酱油中乙酯类化合物含量，提升其风味品质具有重要意义。
[0004]
目前，许多研究人员关注于酱油中主要耐盐产香酵母菌，如鲁氏接合酵母和假丝酵母，具有较好的耐盐性和产香特性，而对酱油中具有产香优势的其他酵母菌种关注相对较少。这些菌种在酱油中含量相对较低，但对于酱油中特定香气化合物具有一定贡献作用。因此对于产香酵母的选择应该多样化，并对其产香特性进行研究，探索接种的最佳时间及接种量，使得酱油产品的风味协调，层次丰富，以此实现改善酱油香味、提高酱油品质的效果。


技术实现要素：

[0005]
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌及其应用。
[0006]
本发明提供的方案是通过了解耐盐酵母菌的特性，通过选择合适的菌株添加量、添加时间和培养温度，靶向提升酱油中乙酯类化合物的含量，以实现现阶段酱油风味与品质的提升。
[0007]
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
[0008]
本发明提供的提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009 l3 wjw是一种多变拟威克酵母菌(wickerhamiellaversatilis)；其具有以下形态生理特征：菌落为圆形，直径大小为3mm，棕白色，表面湿润光滑且隆起，镜检形态为小圆形；其耐盐范围(以氯化钠nacl耐受浓度计) 为0％
‑
20％，最适生长温度为30℃，最适生长ph为5.5。
[0009]
本发明提供的提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌是一种耐盐多变拟威克酵母菌(wickerhamiellaversatilis)，其名称为swjs w2009 l3 wjw，于2021年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21635。
[0010]
本发明提供的提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌能够应用在发酵酱油中。
[0011]
本发明提供的提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌在发酵酱油中的应用，包括如下步骤：
[0012]
(1)泡豆与蒸煮：将黄豆浸泡在水中，升温进行蒸煮处理，过滤取滤渣，得到熟豆；
[0013]
(2)混料与拌曲：将步骤(1)所述熟豆、面粉及曲精混合均匀，得到大曲；
[0014]
(3)大曲的培养：将步骤(2)所述大曲进行固态发酵，得到成曲；
[0015]
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所述成曲与盐水混合均匀，得到酱醪；将所述酱醪进行第一次发酵处理，然后接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw(一种耐盐多变拟威克酵母菌)，进行第二次发酵处理，灭菌，过滤取滤液，得到成品酱油。
[0016]
进一步地，步骤(1)所述黄豆浸泡在水中的时间为6h
‑
10h。
[0017]
进一步地，步骤(1)所述蒸煮处理的时间为10
‑
15min。
[0018]
进一步地，步骤(1)所述蒸煮处理的压力为0.1
‑
0.12mpa。
[0019]
进一步地，步骤(1)所述蒸煮处理的温度为121
‑
125℃。
[0020]
进一步地，步骤(2)所述熟豆的温度为32
‑
45℃。
[0021]
进一步地，步骤(2)所述面粉与步骤(1)所述黄豆的质量比为1:3
‑
1:4。
[0022]
进一步地，步骤(2)所述曲精为活性良好的米曲霉。
[0023]
进一步地，步骤(2)所述曲精的接种量为黄豆与面粉两者总质量的 0.04
‑
0.5wt％。
[0024]
优选地，步骤(2)所述面粉与步骤(1)所述黄豆的质量比为1：4。
[0025]
进一步地，步骤(3)所述固态发酵，包括：先在28
‑
30℃条件下发酵 16
‑
24h，再在26
‑
28℃下发酵16h
‑
26h；
[0026]
进一步地，在步骤(3)所述固态发酵开始后第14h
‑
18h完成第一次翻曲，在完成第一次翻曲后的4h
‑
7h完成第二次翻曲。
[0027]
进一步地，步骤(4)所述盐水的质量百分比浓度为18
‑
22％；
[0028]
进一步地，步骤(4)所述盐水与步骤(3)所述大曲的体积比为1:1.8
‑
1:2.5；
[0029]
进一步地，步骤(4)所述第一次发酵处理的时间为15
‑
60d；
[0030]
进一步地，步骤(4)所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌的接种量为104‑
105cfu/ml；
[0031]
进一步地，步骤(4)所述第二次发酵处理的时间为30
‑
75d；
[0032]
进一步地，步骤(4)所述第一次发酵处理和第二次发酵处理是以室温的日晒夜露为最适温度。
[0033]
本发明提供的发酵酱油，其风味物质的测定可以采用顶空固相微萃取法分析酱油中的挥发性物质情况，重点分析其中的乙酯类化合物；其感官评定可以由感官评价小组确定酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(qda)进行。
[0034]
进一步地，所述的顶空固相微萃取法在于取4ml发酵液(所述成品酱油)放入顶空进样瓶中，调节到盐浓度为180g/l,并用萃取头完成香气萃取工作。
[0035]
本发明从酱醅中筛选出耐盐酵母菌(一种多变拟威克酵母菌)，研究其对高盐稀态酱油风味成分的影响，具有一定创新性。且将其应用于酱油酿造生产过程，对于提升酱油风味改善酱油品质具有一定的潜力和价值。
[0036]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0037]
本发明提供的提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009l3wjw(wickerhamiellaversatilis)应用在酱油发酵中，能够显著提升酱油中酯类化合物，特别是乙酯类化合物的含量，如乙酸乙酯、2
‑
甲基丙酸乙酯、3
‑
甲硫基丙酸乙酯、2
‑
乙酸苯乙酯、乳酸乙酯、2
‑
甲基丁酸乙酯和苯乙酸乙酯，明显改善酱油的果香和花香特征，制得的酱油风味更加协调持久。
附图说明
[0038]
图1为实施例中提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009l3wjw菌株平板形态图；
[0039]
图2为实施例中提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009l3wjw菌株显微镜形态图；
[0040]
图3为实施例中提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009l3wjw菌株的生长曲线；
[0041]
图4为实施例中提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009l3wjw菌株的耐盐性检测结果图。
具体实施方式
[0042]
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0043]
1.菌株的分离筛选
[0044]
无菌条件下，取捣碎后的高盐稀态酱油酱醅样品2.5g，与25ml无菌生理盐水置于无菌密封袋中混合均匀，取0.1ml的酱醅样品稀释液于pda平板中，涂布均匀，置于28℃培养箱中培养，分离纯化，得到所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌，将其命名为swjsw2009l3wjw。
[0045]
2.菌株的鉴定
[0046]
2.1菌株的形态生理特征
[0047]
菌落为圆形，直径大小为3mm，棕白色，表面湿润光滑且隆起，其平板形态可参照图1所示。在显微镜下菌体形态如图2所示。该菌株在nacl 浓度为0
‑
20％时均可进行生长，其耐盐性如图3所示；最适生长ph为5.5；最适生长温度为30℃；该菌株在55h时到达对数生长期，其生长曲线如图 4所示。
[0048]
2.2分子生物学鉴定
[0049]
对分离得到的所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009 l3 wjw进行18s rdna测序，对测序结果进行比对后确定该菌株为多变拟威克酵母菌(wickerhamiellaversatilis)，其18s rdna序列如seqid no.1所示。所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjsw2009 l3 wjw，保藏编号为cgmcc no.21635，于2021年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。
[0050]
实施例1
[0051]
一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌在制备发酵酱油中的应用，包括如下步骤：
[0052]
(1)泡豆与蒸煮：将黄豆加入水中，浸泡处理6h，浸泡后进行高温高压蒸煮处理，蒸煮压力在0.1mpa，时间为15min，蒸煮处理的温度为 121℃，然后冷却至32℃，过滤取滤渣，得到熟豆；
[0053]
(2)混料与拌曲：将步骤(1)所述熟豆、面粉及曲精混合均匀，所述面粉与步骤(1)所述黄豆的质量比是1：4，曲精使用米曲霉，接种量为黄豆与面粉两者总质量的0.04wt％，得到大曲；
[0054]
(3)大曲的培养：将步骤(2)所得的大曲进行固态发酵，先在30℃下培养16h，再在28℃下培养28h；其中，在所述固态发酵开始后第15h 时完成第一次翻曲，在完成第一次翻曲后的7h后完成第二次翻曲，得到成曲；
[0055]
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所述成曲与盐水混合均匀，所述盐水的质量百分比浓度为18wt％，步骤(3)所述大曲与盐水体积比1:2.5，得到酱醪；将所述酱醪发酵到第15d按照104cfu/ml接种量接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，继续发酵至90d，经灭菌和过滤取滤液得到成品酱油。
[0056]
(5)风味物质的测定：取发酵液(所述成品酱油)4ml放入顶空进样瓶中，调节到盐浓度为180g/l，并用萃取头完成香气萃取工作。
[0057]
(6)感官评定：由感官评价小组(男3，女5)确定成品酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(qda)进行。
[0058]
对照例1：对照例1与实施例1基本相同，唯一不同之处在于在步骤(4) 中没有添加所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，其余条件相同，得到一种酱油。对照例1的酱油同样经过上述步骤(5)和步骤(6)的测试。
[0059]
结果分析
[0060]
相比于对照例1，实施例1在接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw后显著提升成品酱油中检出乙酯类化合物总量，为对照例1的2.44倍，其中乳酸乙酯(果香)和苯乙酸乙酯(花香)含量分别为对照例1的3.77倍和5.43倍，同时可以新产生3
‑
甲硫基丙酸乙酯(果香、甜香)等酯类物质，可参照表1所示。
[0061]
而且实施例1制备的成品酱油，其果香和花香的感官评定得分分别为对照例1的2.38倍和2.60倍，可参照表2所示。
[0062]
实施例2
[0063]
一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌在制备发酵酱油中的应用，包括如下步骤：
[0064]
(1)泡豆与蒸煮：将黄豆加入水中，浸泡处理7h，浸泡后进行高温高压蒸煮处理，蒸煮压力在0.1mpa，时间为13min，蒸煮处理的温度为 123℃，然后冷却至35℃，过滤取滤渣，得到熟豆；
[0065]
(2)混料与拌曲：将步骤(1)所述熟豆、面粉及曲精混合均匀，面粉与步骤(1)所述黄豆的质量比是1：4，曲精使用米曲霉，接种量为黄豆与面粉两者总质量的0.2wt％，得到大曲；
[0066]
(3)大曲的培养：将步骤(2)所得的大曲固态发酵，先在30℃下培养22h，再在27℃下培养22h；其中，在，在所述固态发酵开始后第16h 时完成第一次翻曲，在完成第一次翻曲后的6h后完成第二次翻曲；
[0067]
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所述成曲与盐水混合均匀，所述盐水的质量百分比浓度为19wt％，步骤(3)所述大曲与盐水体积比1:2.2，得到酱醪；将所述酱醪发酵到第30d按照104cfu/ml接种量接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，继续发酵至90d，经灭菌和过滤取滤液得到成品酱油。
[0068]
(5)风味物质的测定：取发酵液(所述成品酱油)4ml放入顶空进样瓶中，调节到盐浓度为180g/l，并用萃取头完成香气萃取工作。
[0069]
(6)感官评定：由感官评价小组(男3，女5)确定成品酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(qda)进行。
[0070]
对照例2：对照例2与实施例2基本相同，唯一不同之处在于在步骤(4) 中没有添加所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，其余条件相同，得到一种酱油。对照例2的酱油同样经过上述步骤(5)和步骤(6)的测试。
[0071]
结果分析
[0072]
相比于对照例2，实施例2在接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw后显著提升成品酱油中检出乙酯类化合物总量，为对照例2的2.10倍，其中乳酸乙酯(果香)苯乙酸乙酯(花香) 含量分别为对照例2的3.46倍和5.30倍，同时可以新产生3
‑
甲硫基丙酸乙酯(果香、甜香)等酯类物质，可参照表1所示。
[0073]
而且实施例2制备的成品酱油，其果香和花香的感官评定得分分别为对照例2的1.75倍和2.00倍，可参照表2所示。
[0074]
实施例3
[0075]
一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌在制备发酵酱油中的应用，包括如下步骤：
[0076]
(1)泡豆与蒸煮：将黄豆加入水中，浸泡处理10h，浸泡后进行高温高压蒸煮处理，蒸煮压力在0.12mpa，时间为15min，蒸煮处理的温度为 125℃，冷却至45℃，过滤取滤渣，得到熟豆。
[0077]
(2)混料与拌曲：将步骤(1)所述熟豆、面粉及曲精混合均匀，面粉与步骤(1)所述
黄豆的质量比是1：4，曲精使用米曲霉，接种量为黄豆与面粉两者总质量的0.5wt％，得到大曲；
[0078]
(3)大曲的培养：将步骤(2)所得的大曲固态发酵，先在30℃下培养24h，再在28℃下培养20h；其中，在所述固态发酵开始后第16h时完成第一次翻曲，在完成第一次翻曲后的7h后完成第二次翻曲，得到成曲；
[0079]
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所述成曲与盐水混合均匀，所述盐水的质量百分比浓度为20wt％，步骤(3)所述大曲与盐水体积比1:2.3，得到酱醪；将所述酱醪发酵到第30d按照105cfu/ml接种量接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，继续发酵至90d，经灭菌和过滤取滤液得到成品酱油。
[0080]
(5)风味物质的测定：取发酵液(所述成品酱油)4ml放入顶空进样瓶中，调节到盐浓度为180g/l，并用萃取头完成香气萃取工作。
[0081]
(6)感官评定：由感官评价小组(男3，女5)确定成品酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(qda)进行。
[0082]
对照例3：对照例3与实施例3基本相同，唯一不同之处在于在步骤(4) 中没有添加所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，其余条件相同，得到一种酱油。对照例3的酱油同样经过上述步骤(5)和步骤(6)的测试。
[0083]
结果分析
[0084]
相比于对照例3，实施例3在接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw后显著提升成品酱油中检出乙酯类化合物总量，为对照例3的2.92倍，其中乳酸乙酯(果香)和苯乙酸乙酯(花香)含量分别为对照例3的5.08倍和7.42倍，同时可以新产生3
‑
甲硫基丙酸乙酯(果香、甜香)等酯类物质，明显改善酱油中果香和花香特征，可参照表1所示。
[0085]
而且实施例3制备的成品酱油，其果香和花香的感官评定得分分别为对照例3的3.33倍和3.38倍，可参照表2所示。
[0086]
实施例4
[0087]
一种提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌在制备发酵酱油中的应用，包括如下步骤：
[0088]
(1)泡豆与蒸煮：将黄豆加入水中，浸泡处理8h，浸泡后进行高温高压蒸煮处理，蒸煮压力在0.12mpa，时间为14min，蒸煮处理的温度为124℃，然后冷却至38℃，得到熟豆；
[0089]
(2)混料与拌曲：将步骤(1)所述熟豆与面粉及曲精混合均匀，面粉与步骤(1)所述黄豆的质量比是1：3，曲精使用米曲霉，接种量为黄豆与面粉两者总质量的0.15wt％，得到大曲；
[0090]
(3)大曲的培养：将步骤(2)所得的大曲固态发酵，先在30℃下培养24h，再在28℃下培养20h；其中，在所述固态发酵开始后第18h时完成一次翻曲，8h后完成第二次翻曲，得到成曲；
[0091]
(4)酱醪的发酵与目标菌的接入：将步骤(3)所述成曲与盐水混合均匀，所述盐水的质量百分比浓度为22wt％，步骤(3)所述大曲与盐水体积比1:2.5，得到酱醪；将所述酱醪发酵到第60d按照104cfu/ml接种量接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，继续发酵至90d，经灭菌和过滤取滤液得到成品酱油。
[0092]
(5)风味物质的测定：取发酵液(所述成品酱油)4ml放入顶空进样瓶中，调节到盐浓度为180g/l，并用萃取头完成香气萃取工作。
[0093]
(6)感官评定：由感官评价小组(男3，女5)确定成品酱油的风味变化情况，采用定量感官描述法(qda)进行。
[0094]
对照例4：对照例4与实施例4基本相同，唯一不同之处在于在步骤(4) 中没有添加所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw，其余条件相同，得到一种酱油。对照例4的酱油同样经过上述步骤(5)和步骤(6)的测试。
[0095]
结果分析
[0096]
相比于对照例4，实施例4在接种所述提升酱油中乙酯类化合物含量的耐盐酵母菌swjs w2009 l3 wjw后显著提升成品酱油中检出乙酯类化合物总量，为对照例4的1.93倍，其中乳酸乙酯(果香)和苯乙酸乙酯(花香)含量分别为对照例4的2.26倍和4.17倍，同时可以新产生3
‑
甲硫基丙酸乙酯(果香、甜香)等酯类物质，可参照表1所示。
[0097]
而且实施例4制备的成品酱油，其果香和花香的感官评定得分分别为对照例4的1.43倍和1.75倍，可参照表2所示。
[0098]
表1
[0099][0100]
注：表1中的
‑
表示未检出
[0101]
表2
[0102][0103]
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。