一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法及其应用。


背景技术：

2.组胺是由组胺脱羧酶将组氨酸脱羧形成的低分子含氮有机碱，少量组胺在人体中调节各种生理功能。摄入过量的组胺(8～40mg)导致急性中毒，典型症状包括皮疹、红斑、出汗、恶心、呕吐、腹泻、口腔烧灼感、舌头和面部肿胀、头痛、呼吸窘迫、心悸和低血压；组胺中毒的症状可能会持续几个小时或一天，在极少数情况下，症状可能会持续几天。组胺超标的问题广泛存在于鱼露、虾酱、酱油等高盐食品中。
3.目前控制食品中组胺的方法主要有三种：物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要通过对食品低温储存、超高压处理、辐照处理控制食品中产组胺的微生物，这类方法操作简单但价格昂贵。化学方法即向食品中添加化学添加剂或香辛料控制食品中产胺类微生物，从而达到控制组胺的效果。这类方法的缺点在于对食品的风味及营养影响较大。生物方法即通过向食品中添加能降解组胺的微生物或酶。目前发现能降解组胺的微生物种类较多，但安全性无法控制。生物酶法对组胺降解效果良好，产物无毒害，但目前已报道的组胺降解酶种类少，对盐的耐受性差。
4.组胺降解酶主要有两类，组胺氧化酶与组胺脱氢酶。本发明涉及的组胺氧化酶来自嗜盐古菌，使用异源表达、亲和层析等方法获得纯酶，表达量大且后续纯化方法简单。嗜盐古菌组胺氧化酶对nacl、温度具有广适性，可应用于降解鱼露、虾酱等高盐食品中的组胺。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术存在缺点，提供一种重组嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法。
6.本发明基于盐长命菌(halovivax sp.)wlhsj27
‑
1的基因组获得一个新型组胺氧化酶基 因hod
hvv
，其核苷酸序列如seq id no.1所示，基因大小为2037bp；使用tatp预测发现该酶 无tat信号肽，为胞内酶，由678个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.为了实现以上目的，本发明包括以下步骤：
8.本发明涉及了新型嗜盐古菌组胺氧化酶的制备方法，具体包括以下步骤：
9.(1)构建pta04
‑
hod
hvv
重组表达质粒：
10.首先基于盐长命菌(halovivax sp.)wlhsj27
‑
1的基因组获得一个新型组胺氧化酶基因 hod
hvv
；根据目的基因设计含有酶切位点的引物，利用常规pcr技术扩增目的片段hod
hvv
； 并通过分子克隆技术将hod
hvv
连接到pta04载体上构建重组质粒；
11.(2)重组质粒转化haloferax volcanii：
12.将步骤(1)得到的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述嗜盐古菌宿主为haloferax volcanii；转化后的重组宿主细胞在hv
‑
ypc液体培养基中摇瓶培养，细胞培养至稳定期后，低温离心收集菌体，备用；
13.(3)hod
hvv
纯化：
14.收集步骤(2)的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心收集上清液，用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化上清液，获得含咪唑的酶液，再利用凝胶过滤去除酶液中的咪唑，获得高纯度组胺氧化酶，记为hod
hvv
。
15.优选的，步骤(1)中所述盐长命菌(halovivax sp.)保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为cgmccno.22177，建议的分类命名：盐长命菌(halovivax sp.)，保藏日期为2021年4月12日。
16.优选的，步骤(1)中所述hod
hvv
核苷酸序列如seq id no.1所示，基因大小为2037bp。
17.优选的，步骤(1)中所述酶切位点选择限制性内切酶ecorι和bamhi的酶切位点。
18.优选的，步骤(2)中所述haloferax volcanii购自日本微生物保藏中心(jcm)，菌株保藏号jcm 8879。
19.优选的，步骤(2)中所述hv
‑
ypc培养基成分为(每升)：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，kcl 4.2g，mgso4·
7h2o 33.0g，mgcl2·
6h2o 30.0g，nacl 144.0 g，1m tris
‑
hcl(ph 8.0)12.0ml，cacl
2 0.33g(首先预溶于水中，溶解后添加)，上述组分定容于1l蒸馏水中，调节ph至7.5，115℃灭菌30min。
20.优选的，步骤(2)中所述摇瓶培养的温度为37℃，转速为180rpm。
21.优选的，步骤(2)所述低温为0～4℃。
22.优选的，步骤(3)中所述获得成熟酶的具体操作为：使用10倍柱床体积细胞裂解液平衡镍柱，随后使用上清液与镍柱结合3遍；使用15倍柱床体积缓冲液ⅰ洗脱杂蛋白，使用5 倍柱床体积缓冲液ⅱ洗脱目的蛋白，得到纯酶。
23.优选的，所述细胞裂解液成分为2m nacl，20mm tris
‑
hcl，ph 8.0。
24.优选的，所述缓冲液i成分为2m nacl，20mm tris
‑
hcl，40mm咪唑，ph 8.0。
25.优选的，所述缓冲液ii成分为2m nacl，20mm tris
‑
hcl，250mm咪唑，ph 8.0。
26.优选的，步骤(3)中所述凝胶过滤层析所用的流动相为细胞裂解液。
27.本发明制备的组胺氧化酶可用于鱼露、虾酱、腌制食品等各类高盐食品中降解组胺的用途。
28.本研究以组胺磷酸盐为底物，通过测定其反应产物h2o2含量测定hod
hvv
的催化活性，其方法为：
29.以蒸馏水溶解100mm组胺磷酸盐底物，取5μg酶液、5μl底物及酶活测定缓冲液共60 μl体系，37℃反应30min，置于冰上停止反应，向体系中加入60μl检测液，反应30s，使用核酸蛋白分析仪du800
tm
测定吸光值a
595
。以酶活测定缓冲液代替酶液作为空白对照。制作h2o2含量标准曲线计算酶活。一个酶活力单位定义为特定条件下每分钟生成lμg组胺所需要的酶量。2m nacl、37℃且ph 8.0条件下测得的以组胺磷酸盐为底物的hod
hvv
比酶活为23.6u/mg。
30.以组胺磷酸盐为底物，hod
hvv
在所述的0.07～4m nacl范围内最适nacl浓度为2m，在 0.5m、2m、4m nacl浓度下，4h后仍具有100％活性；在所述30～80℃的范围内，最适反应
温度为60～65℃，在30℃，4h后仍保持100％的活性，50℃下，3h后酶活达到400％；在所述ph 6.0～9.0范围内，最适ph为6.5，在ph 6.0、7.5、9.0下，4h后仍保持100％活性。能耐受多种金属离子，sr
2+
对酶活有促进作用；能够降解多种生物胺，以组胺为底物时酶活最高。以组胺为底物最大反应速率v
max
为30.83μg/min/mg，动力学常数k
m
为0.5321mm。
31.优选的，步骤中所述测定缓冲液为2m nacl，20mm tris
‑
hcl，ph 8.0。
32.优选的，步骤中所述检测液为5mm 3
‑
甲基
‑2‑
苯并噻唑酮腙盐酸盐，2.5mm间二氨基苯甲酸，0.067mg/ml辣根过氧化物酶。
33.本发明的优点和技术效果是：
34.(1)本发明从盐长命菌(halovivax sp.)wlhsj27
‑
1中筛选获得的新型组胺氧化酶基因， 该基因与已发表的其他微生物来源的组胺氧化酶一致性低，且目前暂无盐长命菌组胺氧化酶 研究，该发明可填补盐长命菌组胺氧化酶研究的空白，因此新型盐长命菌组胺氧化酶编码基 因hod
hvv
与盐长命菌组胺氧化酶hod
hvv
均具有很高的研究价值。
35.(2)组胺氧化酶hod
hvv
具有优良的酶学性质，能够催化多种胺类；耐高温，最适反应温度在60～65℃，在30℃及50℃下均较为稳定；对nacl、ph的耐受性良好，在低盐至高盐、中性至碱性均具有较好的稳定性；可耐受多种金属离子。具有优良性状的组胺氧化酶可应用于组胺含量较高的鱼露、虾酱等各类高盐食品中降解组胺。
附图说明
36.图1为本发明中hod
hvv
重组质粒在实例2中的质粒双酶切验证图。
37.图2为本发明中hod
hvv
实例3中的sds
‑
page电泳图。
38.图3为本发明中hod
hvv
酶活测定在实例4中的h2o2含量标准曲线。
39.图4为本发明中hod
hvv
在实例5中的最适反应温度图。
40.图5为本发明中hod
hvv
在实例5中的最适反应nacl浓度图。
41.图6为本发明中hod
hvv
在实例5中的最适反应ph图。
42.图7为本发明中hod
hvv
在实例6中的热稳定性图。
43.图8为本发明中hod
hvv
在实例6中的nacl稳定性图。
44.图9为本发明中hod
hvv
在实例6中的ph稳定性图。
45.图10为本发明中实例6中不同金属离子对hod
hvv
催化活性的影响图。
46.图11为本发明中实例7中不同底物下hod
hvv
催化活性图。
47.图12为本发明中实例8中以组胺为底物hod
hvv
动力学曲线图。
具体实施方式
48.下面结合说明书附图和具体实施实例对本发明做进一步说明。
49.盐长命菌(halovivax sp.)发明人分离，分离自内蒙古自治区、乌兰察布市乌兰呼少海子， 分离时间2019年12月20日。
50.实施例1：
51.新型嗜盐古菌组胺氧化酶编码基因hod
hvv
的获取；
52.基于一株盐长命菌(halovivax sp.)(发明人分离，中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.22177保
tris
‑
hcl buffer，ph 9.0tris
‑
hcl buffer中,放置0h、1h、2h、3h、4h。以实施例4的方法，测定酶活。以ph 6.0下0h时酶活为100％，计算相对酶活。在ph 6.0、7.5、9.0的条件下， 4h后仍保持100％的酶活，表明该酶具有较好的ph稳定性(图9)。
86.金属离子耐受性具体操作为：在应用实例4的反应体系中分别添加kcl、mgcl2、srcl2、 niso4、cocl2、bacl2溶液，使金属离子终浓度为10mm。以实施例4的方法，测定酶活；其中con.是指对照组，以不加金属离子的反应为对照并以其酶活为100％。在所测试的金属离子中，sr
2+
、k
+
对酶活具有促进作用；mg
2+
对酶活无明显影响；ba
2+
、co
2+
、ni
2+
抑制酶活，但仍能保持50％的活性，表明该酶具有较好的金属离子耐受性(图10)。
87.实施例7：
88.不同底物下hod
hvv
的酶活。
89.以不同类型的生物胺为底物，取5μg酶液于最适反应条件下测定hod
hvv
的酶活。
90.具体操作为：分别配置100mm的组胺、色胺、尸胺、精胺、腐胺、酪胺。以实施例4 的方法，测定酶活。以组胺为底物的酶活设置为100％，计算相对酶活。该酶对组胺的酶活最高，其次是酪胺；对色胺、尸胺、腐胺有30％的酶活；而对精胺无酶活。表明该酶具有广泛的底物特异性(图11)。
91.实施例8：
92.hod
hvv
的酶促动力学分析。
93.以组胺磷酸盐为底物，取5μg酶液于最适反应条件下测定hod
hvv
的酶活；
94.具体操作为：设置各体系中组胺终浓度为0.05、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、0.8、1、1.5、 2mm。在最适条件下，以实施例4的方法，测定不同底物下的酶活，利用graphpad prism 7 构建酶动力学曲线，根据米氏方程(michael
‑
menten equation)计算酶动力学常数k
m
和最大反应速率v
max
。所得反应底物最大反应速率v
max
为30.83μg/min/mg，动力学常数k
m
为0.5321 mm(图12)。
95.说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
96.seq id no.1
97.atggcagaaagccacacgcgagcgatcgaccatccgctcgatccgctcac
98.gccggacgagatcgaggccgcctacgaagtgctgaccgacgaacgcgacg
99.tcggcgaggcgagcctctgtatcaagatcgaactggccgaacccgaaaag
100.gaggcgcttcgggcctacgacgacggcggggagcgtcccgatcgacgggc
101.gctgcttgtgatccgaaacagttctgacggaaagacgctcgaggccgtcg
102.tctcgctcgaggaggcgtcggtcgtctccaccgaggaggtcaacggccag
103.ccgtcgatcgccatcgaggagttcatcgcctgcgaggagaccgtcaaacg
104.caacgaggagtggcaagccgcgctccacgatcgaggaatcgaaaacaccg
105.accgcgcgatggtcgacccgtggtcggtcggtcacgagttcgtccccgag
106.gacgtcgaccgctcgaggcggctggcccacgggctgacgttcgtccgacc
107.cagcgaggacgacggcgacgagggttacgcccatcccgtctccgggctgc
108.acacgttcgtcgacctcgaccggatggaggtcgtgaaagtcgtcgactac
109.ggcccgccggatgaggacagtccgatcccacccgaggagatggcctaccg
110.cgagggcgacgtcgagctccgagacgacctgaccgcctacaacgtcgacc
111.agccggacggcccgagctggagcgtcgacggccacaaactcgagtggcag
112.aactggcacatgcgcgtcggctggacccagcgggaggggctggtgctgta
113.cgacgtcggctacgaggacgacggcgaggttcggtcgatcatcgatcgcg
114.cttcctgtgcggagatgtccgtcccctacggcgatcagaacatcaacgac
115.cggttcaagaacgcgatggacgtcggggagtacaacatcggtcggctggc
116.gaaatcgctgaccaacggctgtgactgcctcggtcacatgcactactggg
117.acgccgtgatgaacacagccgccggcgagccgaacgtgctcgagaacgcc
118.atctgcctccacgaggaggacaacgggacgctgtgggagcgtagcgactg
119.gcgcaccgagaccgacgaggtgcggaggcgccgccgactggtcgtctcgt
120.tcgtcgccgcggtggggaattacgactacatcttcaactggtacttctac
121.caggacgcctccatggaggtcgaggtccggctgacgggtatcgacagcgt
122.ctccgccgtcggaccggacgaagatccggacgggtacggcgagttgctcg
123.ccccgcagctcaacggcccgatccaccagcacttctttaacttccggctc
124.gacatgaacgtcgacgacgggccgaacagcctctaccgcgtccagaacga
125.gcaggtgccgatcggtcccggtgggctcgacccgatgggcgaggccgacg
126.agcgaacggccaaccccggcggccaggcgttctacgccaagcgagagcag
127.ctctcgagcgagtcggcggccaaggacctcatcgacccgctgaagggccg
128.ctactggcaggtgattaacccggccgaagaaaactacctcggtaaaccga
129.cggggtacaagctcgttcccggcgggaacgtcgaggccgcaatgcagccc
130.gaatcgagcgtgatgaaacgctccgggttcatccagtaccacctctgggc
131.gacccccttccgcgaggacgagcgcttccccgccggcacctaccccaacc
132.agcaccccggcggtgcgggcctgcccgcgtggaccgaggccgaccggaac
133.ctcgaggaagaagacctcgtgctctggtacaccctgggcgtgaaccacgt
134.cacccgcccggaagactggccgatcctctccgtgcaggtgtacagcttca
135.cactccagcccgtgaacttcttcgacgggagcccggcgatggacgtgccg
136.ccacagcacgccatcgaaggtcaggacgtccccggccacggcgaccactg
137.cgcgaccgacgccggcgcggacgccgacgacgactga
138.seq id no.2
139.maeshtraidhpldpltpdeieaayevltderdvgeaslcikielaepekealrayddg gerpdrrallvirnssdgktleavvsleeasvvsteevngqpsiaieefiaceetvkrneewq aalhdrgientdramvdpwsvghefvpedvdrsrrlahgltfvrpseddgdegyahpvsg lhtfvdldrmevvkvvdygppdedspippeemayregdvelrddltaynvdqpdgpswsv dghklewqnwhmrvgwtqreglvlydvgyeddgevrsiidrascaemsvpygdqnind rfknamdvgeynigrlaksltngcdclghmhywdavmntaagepnvlenaiclheedng tlwersdwrtetdevrrrrrlvvsfvaavgnydyifnwyfyqdasmevevrltgidsvsa vgpdedpdgygellapqlngpihqhffnfrldmnvddgpnslyrvqneqvpigpggldpm geadertanpggqafyakreqlssesaakdlidplkgrywqvinpaeenylgkptgyklvp ggnveaamqpessvmkrsgfiqyhlwatpfrederfpagtypnqhpggagl
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