一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基与流程

1.本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。


背景技术：

2.去甲四环素是合成米诺环素、替加环素等第二、三代四环类抗耐药菌药物的重要中间体，也是合成四环类新药不可或缺的前体。目前，去甲四环素的生产方法主要是以去甲金霉素为原料化学合成而得，而发酵法生产研究较少。因此，筛选去甲四环素的高产菌株具有重要的工业应用价值。
3.工业上获得优良菌种的方法包括自然分离法、诱变选育法、代谢工程改造法等。但是，无论采用哪一种菌种改造方法，都离不开菌株筛选的过程。而筛选菌株是一个随机事件，只有筛选菌株的基数足够大，获得优良菌种的几率才能大。所以，传统的微生物育种方法是一项繁重的工作，往往工作量大，周期长，效率低。高通量筛选可以大大提高筛选通量，但是孔板筛选得到的高产菌株，高产性能不易重复，复试时高出比往往又大幅降低，生产水平不高。鉴于此，本发明开发了一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。


技术实现要素：

4.为了解决去甲四环素高产菌株筛选周期长、工作量大等难题，本发明提供了一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。
5.本发明采用的技术方案为：
6.一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，所述筛选方法为将待筛选的去甲四环素菌株通过孔板初筛和摇瓶复筛相结合的方法进行复合筛选，其中孔板初筛结合孔板效价和菌丝形态进行筛选，摇瓶复筛根据菌株效价进行筛选。
7.进一步地，具体包括以下步骤；
8.a、将待筛选的去甲四环素菌株的菌悬液涂布在固体平板培养基上，分离培养单菌落；
9.b、单菌落长好后，将同一单菌落孢子分别接种于装有孔板发酵培养基的孔板中和装有斜面培养基的试管中培养；
10.c、孔板发酵培养结束后，取1ml发酵液经盐酸酸化，酸化后离心，并取上清液检测菌株效价，孔板4℃保存；
11.d、将步骤c检测得到的高效价菌株对应的孔板发酵液进行菌丝镜检，根据菌丝形态得到复筛菌株，选取与复筛菌株为同一单菌落孢子的b步骤中的斜面菌株接种到摇瓶种子培养基中进行种瓶培养，菌株长好后转接摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；
12.e、摇瓶发酵培养结束后，发酵液用盐酸酸化，酸化后离心，取上清液检测菌株效价；
13.f、根据e步骤得到的检测结果，筛选得到去甲四环素高产菌株，并将对应的b步骤
中的试管中的斜面菌株制备砂土管保存。
14.进一步地，所述待筛选的去甲四环素菌株包括自然分离菌株、物理化学诱变菌株和代谢工程改造菌株；所述物理化学诱变包括紫外线、微波、激光、射线、室温等离子体、亚硝基胍、硫酸二乙酯诱变中的一种或多种。
15.进一步地，所述d步骤中复筛菌株的菌丝形态呈链丝状。
16.进一步地，所述a步骤中分离培养单菌落的培养条件为：25
‑
30℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天；所述b步骤中孔板培养的条件为：25
‑
30℃，20％
‑
60％湿度条件下，220rpm震荡培养2
‑
4天；斜面培养条件为：25
‑
30℃，20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天。
17.进一步地，所述步骤d中种瓶培养的条件为：25
‑
30℃，20％
‑
60％湿度条件下，220rpm震荡培养培养36
‑
42h；摇瓶发酵培养的条件为：25
‑
30℃， 20％
‑
60％湿度条件下，220rpm震荡培养培养7天。
18.进一步地，所述孔板为12深孔板、24深孔板、48深孔板、96深孔板的任意一种。
19.进一步地，所述孔板为24深孔板，所述24深孔板装量为2
‑
4ml。
20.一种筛选去甲四环素高产菌株的培养基，包括孔板发酵培养基、摇瓶种子培养基和摇瓶发酵培养基。
21.进一步地，所述孔板发酵培养基的成分及其含量为：可溶性淀粉 1.0
‑
4.0％、甘露醇0.1
‑
0.5％、高温豆粉1.0
‑
3.0％、碳酸钙0.5
‑
2.0％、酵母粉 0.1
‑
0.5％、大豆蛋白胨0.5
‑
1.5％、硫酸铵0.1
‑
0.5％、l
‑
赖氨酸0.5
‑
1.5％、溴化钠0.1
‑
0.5％、硫酸镁0.01
‑
0.03％、玉米浆0.5
‑
2.0％、消沫剂0.01
‑
0.05％、 2
‑
巯基苯并噻唑0.001
‑
0.002％、用硫酸或硝酸调节ph至5.0
‑
6.0，余量用纯水补齐。
22.所述摇瓶种子培养基的成分及其含量为：玉米淀粉1.0
‑
3.0％、甘露醇 0.5
‑
2.0％、高温豆粉0.5
‑
2.5％、碳酸钙0.5
‑
2.0％、酵母浸粉0.1
‑
0.5％、玉米蛋白粉0.5
‑
2.5％、硫酸铵0.1
‑
0.4％、溴化钠0.1
‑
0.5％、磷酸二氢钾0.01
‑
0.04％、硫酸镁0.01
‑
0.03％、ph自然，余量用纯水补齐；
23.所述摇瓶发酵培养基的成分及其含量为：玉米淀粉5
‑
10％、甘露醇 0.2
‑
1.0％、高温豆粉3.0
‑
6.0％、碳酸钙0.5
‑
2.5％、酵母粉0.1
‑
0.5％、大豆蛋白胨1.0
‑
2.0％、硫酸铵0.1
‑
0.5％、l
‑
赖氨酸0.5
‑
2.5％、溴化钠0.1
‑
0.5％、硫酸镁0.01
‑
0.03％、玉米油(v/v)1.0
‑
4.0％、消沫剂0.01
‑
0.05％、α
‑
淀粉酶 (淀粉用量的w/w)0.05
‑
0.1％、2
‑
巯基苯并噻唑0.001
‑
0.002％、用硫酸或硝酸调节ph至5.0
‑
6.0，余量用纯水补齐。
24.本发明获得的有益效果为：传统诱变选育方法为摇瓶初筛、摇瓶复试，该方法不仅周期长，费时费力，成本高，且极大地限制了筛选数量。较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明将其改进为孔板初筛和摇瓶复筛相结合的复合筛选方法，缩短了筛选周期，增大了筛选通量，大大提高了筛选效率，且工艺简单、易于实施。该方法在单菌落接孔板的同时进行了斜面接种，使用接种的斜面进行复试和保菌，减少了菌株的传代次数，另外，孔板初筛选取的效价较高的菌株进行菌丝制片观察，筛选菌丝呈链丝状的菌株进行摇瓶复试，去除了大部分假性高产菌株，进一步提高了高产菌株的筛选几率，减少了复试的工作量。
附图说明
25.图1为本发明筛选方法流程图；
26.图2为本发明链丝状菌丝图；
27.图3为本发明丝状菌丝图；
28.图4为本发明传统筛选方法流程图。
具体实施方式
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.实施例1：
31.以金色链霉菌streptomyces aureofaciens dca029为实验菌株，按照图4 传统筛选方法的步骤选育去甲四环素高产菌株。采用培养基为：
32.平板和斜面培养基的成分及其含量为：面粉1.5％，蛋白胨0.05％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.001％，琼脂2.5％，余量为水。
33.摇瓶种子培养基的成分及其含量为：玉米淀粉2.5％，甘露醇0.5％，高温豆粉2.0％，碳酸钙1.0％，酵母浸粉0.3％，玉米蛋白粉1.5％，硫酸铵0.2％，溴化钠0.15％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.02％，ph自然。
34.摇瓶发酵培养基的成分及其含量为：玉米淀粉10％，甘露醇0.5％，高温豆粉3.5％，碳酸钙1.0％，酵母粉0.3％，大豆蛋白胨1.0％，硫酸铵0.15％， l
‑
赖氨酸1.5％，溴化钠0.3％，硫酸镁0.02％，玉米油(v/v)4.0％，消沫剂0.01％，α
‑
淀粉酶(淀粉用量的w/w)0.05％，2
‑
巯基苯并噻唑0.002％。用硫酸或硝酸调节ph至5.0
‑
6.0。
35.取s.aureofaciens dca029砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天；斜面成熟后将孢子刮下，无菌水制备孢子悬液，进行稀释，涂布分离平板，28℃，20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15 天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养。分离平板上生长好单菌落接种到斜面培养基，斜面成熟接种至摇瓶种子培养基，28℃，20％
‑
60％湿度条件下220rpm震荡培养40h；种液成熟后，按照10％接种量接种到摇瓶发酵培养基中，相同条件下震荡培养7天至发酵结束。将发酵液用盐酸酸化并不断搅拌，至ph为1.5
‑
2.0，然后用甲醇稀释至适当倍数，振荡后离心，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，液相色谱检测滤液进行初筛。色谱条件为：
36.色谱柱：zorbaxsb c184.6*250mm 5.0μm；
37.流动相：
38.流动相a：草酸20mm、三乙胺20mm、ph≈1.2，流动相b：乙腈，流动相a：流动相b＝8：2；
39.进样量：20μl；
40.流速：1.0ml/min；
41.波长：350nm；
42.柱温：25℃。
43.挑选初筛效价较高的菌株保存砂土管，砂土管接斜面进行复试，复试所用的斜面、种瓶、发酵培养基和条件同初筛。实验结果如下：
[0044][0045]
实施例2：
[0046]
由实施例1看出，使用摇瓶初筛和摇瓶复筛，筛选周期长，且筛选通量小，为此，本发明首先将摇瓶初筛改为了孔板初筛。以金色链霉菌s. aureofaciens dca029为实验菌株选育去甲四环素高产菌株。采用培养基为：
[0047]
孔板发酵培养基的成分及其含量为：可溶性淀粉1.0
‑
4.0％，甘露醇 0.1
‑
0.5％，高温豆粉1.0
‑
3.0％，碳酸钙0.5
‑
2.0％，酵母粉0.1
‑
0.5％，大豆蛋白胨0.5
‑
1.5％，硫酸铵0.1
‑
0.5％，l
‑
赖氨酸0.5
‑
1.5％，溴化钠0.1
‑
0.5％，硫酸镁0.01
‑
0.03％，玉米浆0.5
‑
2.0％，消沫剂0.01
‑
0.05％，2
‑
巯基苯并噻唑 0.001
‑
0.002％。用硫酸或硝酸调节ph至5.0
‑
6.0。
[0048]
平板和斜面培养基、摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基同实施例1。
[0049]
取s.aureofaciens dca029砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天；斜面成熟后将孢子刮下，无菌水制备孢子悬液，进行稀释，涂布分离平板，28℃，20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15 天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养。分离平板上生长好单菌落接种到含有孔板发酵培养基的24深孔板中，孔板装量3ml，培养条件为：28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养3天进行初筛。培养结束取1ml发酵液经盐酸酸化至ph为1.5
‑
2.0，离心取上清液检测效价，方法同实施例1，孔板4℃冰箱保存。
[0050]
将分离单菌落接种孔板的同时，接种装有斜面培养基的试管中培养。根据孔板初筛结果，选取效价较高的孔板对应的试管斜面进行摇瓶复筛，方法同实施例1。复试效价较高的菌株制备砂土管保存。实验结果如下：
[0051][0052]
实施例3：
[0053]
由实施例2看出，使用孔板初筛和摇瓶复筛，大大缩短了筛选周期，提高了筛选通量，但是孔板初筛效价较高的菌株，摇瓶复试时高出比往往又大幅降低，高产性能不易重复，为此，本发明在孔板初筛时将效价和菌丝形态相结合(图1改进后的本发明筛选方法)，筛选菌丝呈链丝状(图2) 的菌株进行摇瓶复试，去除了大部分假性高产菌株，进一步提高了高产菌株的筛选几率，减少了复试的工作量。
[0054]
以金色链霉菌s.aureofaciens dca029为实验菌株，按照改进后图1的步骤选育去甲四环素高产菌株。采用培养基为：
[0055]
平板和斜面培养基、摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基同实施例1。
[0056]
孔板发酵培养基同实施例2。
[0057]
取s.aureofaciens dca029砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天；斜面成熟后将孢子刮下，无菌水制备孢子悬液，进行稀释，涂布分离平板，28℃，20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15 天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养。分离平板上生长好单菌落接种到含有孔板发酵培养基的24深孔板中，孔板装量3ml，培养条件为：28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养3天进行初筛。培养结束取1ml发酵液经盐酸酸化至ph为1.5
‑
2.0，离心取上清液检测效价，方法同实施例1，孔板4℃冰箱保存。
[0058]
将分离单菌落接种孔板的同时，接种装有斜面培养基的试管中培养。根据孔板初筛结果，选取效价较高的孔板进行菌丝镜检，进一步去除菌丝呈丝状(图3)的菌株，选取菌丝呈链丝状(图2)的菌株对应的试管斜面进行摇瓶复筛，方法同实施例1。复试效价较高的菌株制备砂土管保存。实验结果如下：
[0059][0060]
结果可以看出，孔板初筛得到的高产菌株通过菌丝形态差别进一步筛选，去除了大部分假性高产菌株，提高了高产菌株的筛选几率，减少了复试的工作量。
[0061]
实施例4：
[0062]
以金色链霉菌s.aureofaciens dca029为实验菌株，按照图1改进后的步骤选育去甲四环素高产菌株。采用培养基为：
[0063]
平板和斜面培养基、摇瓶种子培养基、摇瓶发酵培养基同实施例1。
[0064]
孔板发酵培养基同实施例2。
[0065]
取s.aureofaciens dca029砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃， 20％
‑
60％湿度条件下培养14
‑
15天；斜面成熟后将孢子刮下，无菌水制备孢子悬液，取3
‑
5ml转入到直径6cm的无菌培养皿中，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上，20w紫外线下30cm处紫外照射30、45、60s。照射结束用牛皮纸包住，红灯下进行稀释分离。分离平板上生长好单菌落接种到含有孔板发酵培养基的24深孔板中，孔板装量3ml，培养条件为： 28℃，20％
‑
60％湿度条件下培养3天进行初筛。培养结束取1ml发酵液经盐酸酸化至ph为1.5
‑
2.0，离心取上清液检测效价，方法同实施例1，孔板 4℃冰箱保存。
[0066]
将分离单菌落接种孔板的同时，接种装有斜面培养基的试管中培养。根据孔板初筛结果，选取效价较高的孔板进行菌丝镜检，选取菌丝呈链丝状(图2)的菌株对应的试管斜面进行摇瓶复筛，方法同实施例1。复试效价较高的菌株制备砂土管保存。实验结果如下：
[0067][0068]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。