诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法

本发明属于细胞生物学与发育生物学交叉领域，涉及诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法。

背景技术：

肺是人类主要的呼吸器官，其中肺泡上皮细胞组成的肺泡是肺部实现气体交换功能的基本结构和功能单位。在体外培养肺细胞进行药物筛选、毒性测试和疾病研究是临床医学、药学、发育生物学和细胞生物学等领域的共同需求。然而，人源肺泡细胞一直是一种十分稀缺的资源，相关细胞的分离、纯化和实验室扩大培养的技术均不成熟。尽管目前从人胎儿中分离肺上皮前体细胞的实验流程已经比较成熟，但由于肺泡上皮细胞一般出现在孕26周，因此可用于取样的流产胎儿极难获得，亟需一套能够高效获得人体肺泡细胞或肺泡类器官的方法。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，所述方法包括以下步骤：

a.诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞；

b.诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞；

c.诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞；

d.诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞；

e.诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官。

在一些实施方案中，诱导分化使用的基底培养基为ldbasal，ldbasal配方为：dmem/f12培养基中加入glutamax(1-4mm，优选为1、2、3、4mm，更优选为2mm)、n2补充剂(1×)，b27补充剂(1×)，抗坏血酸-2-磷酸(40-60μg/ml，优选为40、50、60μg/ml，更优选为50μg/ml)。

在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞所用培养基为ldm-1，所述ldm-1的配方为：ldbasal培养基中加入activina(20-500ng/ml，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，更优选为100ng/ml)、chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)。

在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞的诱导时间为1-3天，优选为1、2、3天，更优选为1天。

在一些实施方案中，诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞所用的培养基为ldm-2，所述的ldm-2配方为：ldbasal培养基中加入activina(20-500ng/ml，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，更优选为100ng/ml)。

在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞所用的培养基为ldm-3，所述ldm-3的配方为：ldbasal培养基中加入sb431542(1-20μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μm，更优选为10μm)、dorsomorphin(1-10μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μm，更优选2μm)。

在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞的诱导时间为2-4天，优选为2、3、4天，更优选为3天。

在一些实施方案中，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞所用的培养基为ldm-4，所述ldm-4的配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)、视黄酸(10-100nm，优选为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100nm，更优选为50nm)、bmp4(1-30ng/ml，优选为1、5、8、15、20、25、30ng/ml，更优选为10ng/ml)、fgf7(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)、fgf10(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)。

在一些实施方案中，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞的诱导时间为8-10天，优选为8、9、10天，更优选为9天。

在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞所用的培养基为ldm-5，所述的ldm-5配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)、fgf7(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)、地塞米松(10-50nm，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nm，更优选为50nm)、camp(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)。

在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞的诱导时间为13-15天，优选为13、14、15天，更优选为14天。

在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡类器官包括以下步骤：

(1)将步骤d获得的肺前体细胞与基质胶溶液混合，形成细胞悬液；

(2)将细胞悬液按照每滴20-100μl的量，接种在干燥的细胞培养板里；

(3)等待至细胞悬液凝固；

(4)加入ldm-5进行诱导；ldm-5的配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)、fgf7(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)、地塞米松(10-50nm，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nm，更优选为50nm)、camp(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)。

在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡类器官的诱导时间为为13-15天，优选为13、14、15天，更优选为14天。

另一方面，本发明提供ldbasal培养基或试剂盒或组合物，其包括：

dmem/f12培养基；

glutamax；

n2补充剂(1×)；

b27补充剂(1×)；

抗坏血酸-2-磷酸。

另一方面，本发明提供ldbasal培养基或试剂盒，ldbasal配方为：dmem/f12培养基中加入glutamax(1-4mm，优选为1、2、3、4mm，更优选为2mm)、n2补充剂(1×)，b27补充剂(1×)，抗坏血酸-2-磷酸(40-60μg/ml，优选为40、50、60μg/ml，更优选为50μg/ml)。

另一方面，本发明提供诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基或试剂盒或组合物，其包括：

上述ldbasal培养基或试剂盒或组合物；

wnt通路激活剂；

activin通路激活剂；

tgfβ通路抑制剂；

bmp通路抑制剂；

bmp通路激活剂；

ra通路激活剂；

fgf通路激活剂；

camp通路激活剂；

糖皮质激素；

磷酸二酯酶抑制剂。

在一些实施方案中，所述wnt通路激活剂选自由chir99021、im-12、azd2858和wnt3a组成的组中的一个或多个，优选为chir99021。

在一些实施方案中，activin通路激活剂为activina。

在一些实施方案中，所述tgfβ通路抑制剂选自由sb431542、a83-01和ly2109761组成的组中的一个或多个，优选为sb431542。

在一些实施方案中，所述bmp通路抑制剂选自由dorsomophin、ldn193189和k02288组成的组中的一个或多个，优选为dorsomophin。

在一些实施方案中，所述bmp通路激活剂选自由bmp2、bmp4，bmp7组成的组中的一个或多个，优选为bmp4；

在一些实施方案中，所述ra通路激活剂选自由视黄酸、wyc-209和am580组成的组中的一个或多个，优选为视黄酸。

在一些实施方案中，所述fgf通路激活剂选自由fgf2、fgf7、fgf8和fgf10组成的组中的一个或多个，优选为fgf7和fgf10。

在一些实施方案中，所述camp通路激活剂选自由camp和forskolin组成的组中的一个或多个，优选为camp。

在一些实施方案中，所述糖皮质激素选自由地塞米松、甲泼尼龙和布地奈德组成的组中的一个或多个，优选为地塞米松。

在一些实施方案中，所述磷酸二酯酶抑制剂选自由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、luteolin和udenafil组成的组中的一个或多个，优选为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。

另一方面，本发明提供诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基或试剂盒或组合物，其包括：

上述ldbasal培养基或试剂盒或组合物；

wnt通路激活剂，其选自由chir99021、im-12、azd2858和wnt3a组成的组中的一个或多个，优选为chir99021；

activin通路激活剂，优选为activina；

tgfβ通路抑制剂，其选自由sb431542、a83-01和ly2109761组成的组中的一个或多个，优选为sb431542；

bmp通路抑制剂，其选自由dorsomophin、ldn193189和k02288组成的组中的一个或多个，优选为dorsomophin；

所述bmp通路激活剂选自由bmp2、bmp4，bmp7组成的组中的一个或多个，优选为bmp4；

ra通路激活剂，其选自由视黄酸、wyc-209和am580组成的组中的一个或多个，优选为视黄酸；

fgf通路激活剂，其选自由fgf2、fgf7、fgf8和fgf10组成的组中的一个或多个，优选为fgf7和fgf10；

camp通路激活剂，其选自由camp和forskolin组成的组中的一个或多个，优选为camp；

糖皮质激素，其选自由地塞米松、甲泼尼龙和布地奈德组成的组中的一个或多个，优选为地塞米松；

磷酸二酯酶抑制剂，其选自由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、luteolin和udenafil组成的组中的一个或多个，优选为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。

在进一步的实施方案中，诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基或试剂盒或组合物，还包含activina(20-500ng/ml，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/ml，更优选为100ng/ml)、chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)、sb431542(1-20μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μm，更优选为10μm)、dorsomorphin(1-10μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μm，更优选2μm)、chir99021(1-12μm，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μm，更优选为3μm)、视黄酸(10-100nm，优选为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100nm，更优选为50nm)、bmp4(1-30ng/ml，优选为1、5、8、15、20、25、30ng/ml，更优选为10ng/ml)、fgf7(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)、fgf10(10-50ng/ml，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/ml，更优选为10ng/ml)、地塞米松(10-50nm，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nm，更优选为50nm)、camp(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1-2mm，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm，更优选为0.1mm)。

另一方面，本发明提供上述培养基或试剂盒或组合物诱导诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的用途。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明通过诱导人多能干细胞进行肺分化，能够提供充足的人肺细胞，满足各种研究的需要。这些细胞与癌细胞相比，遗传物质正常，更贴近健康人体真实情况。与从人体中提取肺泡细胞相比，本发明获得肺细胞的方法更加温和，不涉及伦理问题，样品也非常容易获取。

附图说明

图1为根据本发明实施方式的限定性内胚层细胞形态；

图2为根据本发明实施方式的肺前体细胞形态；

图3为根据本发明实施方式的单层肺泡细胞形态；

图4为根据本发明实施方式的三维肺泡类器官形态；

图5为根据本发明实施方式的肺前体细胞生物标志物nkx2.1的表达；

图6为根据本发明实施方式的肺前体细胞生物标志物id2的表达；

图7为根据本发明实施方式的肺前体细胞生物标志物sftpc的表达；

图8为根据本发明实施方式的肺泡细胞生物标志物nkx2.1的表达；

图9为根据本发明实施方式的肺泡细胞生物标志物id2的表达；

图10为根据本发明实施方式的肺泡细胞生物标志物sftpc的表达；

图11为根据本发明实施方式的肺泡细胞生物标志物abca3的表达；

图12为根据本发明实施方式的肺泡细胞生物标志物napsa的表达。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

实施例1诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞

本发明中所有的细胞均在37℃，含有5％二氧化碳的细胞培养箱中恒温培养。

实施例1使用的初始细胞是诱导人多能干细胞dyr0100(中国科学院细胞库/干细胞技术平台，scsp-1301)。

在基质胶(corning，356231)包被的24孔板中使用10ml的mtesr1(stemcelltechnologies，85850)培养基，维持培养dyr0100。dyr0100克隆的汇合度达到90％时，开始诱导分化。

诱导分化使用的基底培养基为ldbasal，ldbasal配方为：100mldmem/f12(gibco，c1410500bt330500bt)培养基中加入1mlglutamax(gibco，35050061)(100×)、1mln2补充剂(gibco，17502001)(100×)、2mlb27补充剂(gibco，17504044)(50×)、0.1ml抗坏血酸-2-磷酸(源叶，s24742)(50μg/ml)。

在分化的第0天，使用ldm-1，诱导细胞向原条细胞分化。ldm-1的配方为：ldbasal培养基中加入activina(100ng/ml)(peprotech，120-14e)、chir99021(3μm)(selleck，s2924)。

在分化的第1天，使用ldm-2，诱导原条细胞分化3天，成为限定性内胚层细胞。ldm-2的配方为：ldbasal培养基中加入activina(100ng/ml)。限定性内胚层细胞为密集单层细胞(图1)。

实施例2诱导限定性内胚层细胞分化为肺前体细胞

针对实施例1最终获得的限定性内胚层细胞，第一阶段使用ldm-3，诱导实施例1获得的限定性内胚层细胞分化3天，成为前端前肠细胞。ldm-3的配方为：ldbasal培养基中加入sb431542(selleck，s2924)(10μm)、dorsomorphin(selleck，s7306)(2μm)。

第二阶段使用ldm-4，诱导上述获得的前端前肠细胞分化9天，成为肺前体细胞(图2)。ldm-4的配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(3μm)、视黄酸(sigma，r2625)(50nm)、bmp4(gibco，phc9531)(10ng/ml)、fgf7(r&d，251-kg-050)(10ng/ml)、fgf10(r&d，345-fg-025)(10ng/ml)。

实施例3诱导肺前体细胞分化为单层肺泡细胞

针对实施例2最终获得的肺前体细胞，使用ldm-5诱导肺前体细胞分化约16天，最终成为肺泡细胞(图3)。ldm-5的配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(3μm)、fgf7(10ng/ml)、地塞米松(sigma-aldrich，d4092)(50nm)、camp(sigma-aldrich，b5386)(0.1mm)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(sigma-aldrich，i5879-250mg)(0.1mm)。

实施例4诱导肺前体细胞分化为肺泡类器官

针对实施例2最终获得的肺前体细胞。具体诱导步骤如下：

(1)将上述肺前体细胞与基质胶溶液混合，形成细胞悬液；

(2)将细胞悬液按照每滴20-100μl的量，接种在干燥的细胞培养板里；

(3)等待20分钟直至细胞悬液凝固；

(4)加入ldm-5，培养16天；ldm-5的配方为：ldbasal培养基中加入chir99021(3μm)、fgf7(10ng/ml)、地塞米松(50nm)、camp(0.1mm)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1mm)。

最终获得的细胞为中间有空腔的肺泡类器官(图4)。

实施例5肺前体细胞或肺泡细胞生物标志物检测

使用的样品是诱导人多能干细胞、上述实施例2的肺前体细胞和实施例3的肺泡细胞。

使用trnzol总rna提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司，dp424)提取样品中的rna。

使用fastking试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，kr118)去除所述样品中基因组dna污染和反转录。

使用fastfireqpcrpremix(天根生化科技(北京)有限公司，fp207)对所述样品进行荧光定量pcr。

荧光定量pcr实验中使用的引物根据ncbi公布的人类基因组转录本信息设计，产物长度在80～120bp左右，pcr引物信息如下：

gapdh-fw：5′-ggtcaccagggctgctttta-3′

gapdh-rv：5′-ggatctcgctcctggaagatg-3′

nkx2.1-fw：5′-ctcatgttcatgccgctc-3′

nkx2.1-rv：5′-gacaccatgaggaacagcg-3′

id2-fw：5′-gacagcaaagcactgtgtgg-3′

id2-rv：5′-tcagcacttaaaagattccgtg-3′

sftpc-fw：5′-agcaaagaggtcctgatgga-3′

sftpc-rv：5′-cgataagaaggcgtttcagg-3′

abca3-fw：5′-aagatgtagcggacgagagg-3′

abca3-rv：5′-ccccggtcagcattttgaaa-3′

napsa-fw：5′-acgcctccacaaaacttcac-3′

napsa-rv：5′-tggcaaacttggtcccattg-3′

荧光定量pcr的反应条件为：预变性95℃，30秒；95℃，5秒，60℃，30秒，50个循环。

使用荧光定量pcr检测肺前体细胞中标志基因nkx2.1、id2和sftpc的表达水平。相关检测结果显示，与诱导人多能干细胞相比，肺前体细胞中nkx2.1、id2和sftpc的表达水平分别上升了4.3倍、2.6倍和9671.7倍(图5-7)，可见肺前体分化效果良好。

使用荧光定量pcr检测肺泡细胞标志基因nkx2.1、id2、sftpc、abca3和napsa的表达水平。相关检测结果显示，与肺前体细胞相比，肺泡细胞中nkx2.1表达水平几乎不变，id2、sftpc、abca3和napsa的表达水平分别上升了1.2倍、80.9倍、15倍、112.9倍(图8-12)，可见肺泡分化效果良好。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。